PRACTICA 2

COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA

OBJETIVOS

1. Conocer los principios básicos de los métodos para la medida de concentración de las sustancias.

2. Establecer diferencias entre Transmitancia y Absorbancia.

3. Realizar una curva espectral, una curva de calibración y establecer sus diferencias.

PRELABORATORIO: Consultar y traer al Laboratorio el Espectro de Absorción de las diferentes especies de Hemoglobina en la region visible (340-700 nm)Consultar el mecanismo y la técnica para la determinación de hemoglobina en el laboratorio clínico.Debe traerse el diagrama de flujo de cada una de las actividades que realizará en la práctica.Traer varias hojas de papel milimetrado, regla e implementos necesarios para realizar sus curvas.

A. COLORIMETRIA

Muchos experimentos bioquímicos incluyen la medición de un compuesto o grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Una de las técnicas más usadas para determinar la concentración de dichos compuestos es la Colorimetría. El fundamento de la técnica se basa en que si se pasa luz blanca a través de una solución coloreada, algunas longitudes de onda se absorben con preferencia sobre las otras. Figura 2.1

Para el caso de la absorción de radiación visible, muchos iones o moléculas o son coloreados, o pueden reaccionar con una substancia coloreada o pueden formar en algunas de sus reacciones una substancia coloreada. Cada una de estas situaciones presenta la posibilidad de efectuar una determinación analítica cuantitativa. La mayor ventaja de este método consiste en que no es necesario el aislamiento del compuesto y así se pueden determinar los constituyentes de una mezcla compleja tal como la sangre

Luz incidente Blanca

Rojo

Amarillo

Azul Amarillo

Azul

Verde

Luz absorbida por la solución coloreada Roja

Luz emergente y por consiguiente color de la solución verde

Figura 2.1 Porqué son coloreadas las soluciones?.

PARTES DE UN COLORIMETRO. Figura 2.2

La luz blanca emitida por una lámpara de tungsteno pasa a través de una rendija (apertura), y luego a través de un lente condensador que vuelve paralelos estos rayos que van a incidir sobre la solución problema (generalmente es coloreada o tiene la capacidad de absorber la luz) la cual se coloca en la celda o cubeta. La cubeta es generalmente de vidrio de paredes paralelas con 1 cm de separación entre ellas en la mayoría de los casos, esta distanciase conoce como paso de luz..

El Filtro puede estar colocado antes o después de la cubeta y su color se selecciona para permitir la transmitancia máxima del color no absorbidodia. El color del filtro debe ser complementario al de la solución que se estudia, por ejemplo, si se quiere examinar una solución de color azul, se selecciona el filtro rojo que es complementario y permite la transmisión máxima del color no absorbido (azul) o dicho de otra forma el filtro rojo no absorbe luz azul permitiendo la máxima transmitancia de este último. Los filtros producen bandas angostas de transmisión y por lo tanto luz aproximadamente monocromática . Cada color corresponde a una región del espectro de luz blanca y posee una longitud de onda () característica que se mide en nanometros (nm) y puede ser seleccionada mediante el uso de los filtros en los colorímetros. La longitud de onda más usada para mediciones en Bioquímica Clínica es 340 nm que pertenece al rango ultravioleta. A esta longitud de onda las formas reducidas de los cofactores NADH, NADPH tienen valores altos de Absorbancia mientras que sus formas oxidadas (NAD, NADP) no absorben. Una reacción catalizada por enzimas que utilicen estas coenzimas puede ser medida fácilmente por la aparición o desaparición de NADH o NADPH.

La luz llega a una fotocelda que genera corriente eléctrica en proporción directa a la intensidad de la luz incidente, se amplifica la señal y finalmente pasa a un galvanómetro que proporciona directamente medidas de porcentaje de Transmitancia y Absorbancia.

Principio de la Colorimetría. Cuando se pasa un rayo de luz monocromática de intensidad inicial a través de una solución coloreada en un recipiente transparente parte de la luz es absorbida por la solución de manera que la intensidad de la luz transmitida () es menor que

94,50

Fuente de energía radiante

HendiduraDe entrada

Filtro Hendidura de salida

Cubeta DetectorPantalla

la inicial (o). Figura 2.3. La relación entre e o depende de la longitud (l) del medio absorbente y de la concentración (C) de la solución absorbente .

Figura 2.3 Absorción de la luz por una solución

De cada uno de estos dos factores Longitud y Concentración se deriva la Ley de Lambert y de Beer respectivamente.

Ley de Lambert

Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta, esto es:

= o . e-k1 . l

Ley de Beer

Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta:

= o . e-k 2.c

Dado que las dos características de la solución influyen en la magnitud de la intensidad emergente, surge la ley combinada de Beer Lambert.

= o . e-k 3.c.l

Transmitancia y Absorbancia

La concentración de la sustancia desconocida, puede calcularse en % transmitancia o en unidades de Absorbancia. El cociente de las dos intensidades, I/Io, se conoce como TRANSMITANCIA y se expresa como un porcentaje.

%T= / o = luz transmitida (solución problema) luz incidente (solución blanco)Expresado en términos de Logaritmos:

-Log / o = k.c.l Log o / = k.c.l. = Absorbancia = A

k = Constante que depende de la longitud de onda, de la naturaleza del medio y del espesor.

Conociendo %T de una solución coloreada se puede determinar su ABSORBANCIA .

T = 100 __ __ oExpresando en Logaritmos:

Log % T = Log 100 + Log / o; como A = Log _ o _ y Log 100 = 2 entonces: Log %T = 2 - A

por lo tanto: A = 2 – Log % T

ABSORBANCIA = EXTINCIÓN = DENSIDAD ÓPTICA (D.O.)

Para buscar la concentración de una sustancia desconocida por colorimetría las lecturas deben hacerse en %T ya que la escala de lectura es lineal porque está dividida homogénaemente en 100 partes iguales lo que hace su medición más exacta; la escala de Absorbancia o extinción es logarítmica, se extiende de cero a dos con divisiones desiguales haciendo poco exacta la lectura principalmente en los valores altos. Sin embargo, en la práctica debe emplearse valores de Absorbancia, que pueden hallarse mediante la fórmula o mediante una tabla de conversión para cada valor de transmitancia. Con valores conocidos de A o %T, es posible hallar la concentración de una sustancia desconocida (solución absorbente). La relación entre la concentración y el % T no es lineal, por lo cual se requiere muchos puntos para lograr una medición exacta; en contraposición existe una relación lineal entre la concentración y la Absorbancia. (Figura 2.5.).

Figura 2.5 Relación entre la absorción de la luz y la concentración

Por lo tanto con un solo punto dado por el patrón (Estándar de concentración conocida) es posible trazar una curva correcta teniendo en cuenta solo si se ha establecido la relación lineal (o rango lineal) y descartando los rangos de desviación tanto a altas concentraciones como a bajas concentraciones

Limitaciones de la Ley Beer Lambert

Para que se cumpla la Ley combinada deben darse las siguientes condiciones:

1. La luz preferiblemente debe ser monocromática o la longitud de onda debe estar entre límites muy estrechos.

2. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución. Esto permite conseguir la sensibilidad óptima.

3. No debe haber ionización, asociación, disociación o solvatación del soluto con respecto a la concentración o el tiempo.

4. La ley sólo se cumple hasta cierto límite máximo de concentración, característico de cada sustancia (Linealidad).

B. ESPECTROFOTOMETRIA

Un Espectrofotómetro es un colorímetro más sofisticado en el cual la luz monocromática se difracta mediante una rendija o prisma.

La banda de longitudes de onda de la luz que pasa a través del filtro, en el caso dell colorímetro es muy ancha, por lo cual puede ser difícil distinguir entre dos compuestos que tengan absorción parecida; en este caso, es recomendable usar un Espectrofotómetro ya que permite separar picos de absorción muy juntos debido a la presencia del monocromador. Los Espectrofotómetros son aparatos más sofisticados cuyas 2 ventajas principales son: a) Abarcan todo el espectro de luz .

b) Permite mayor poder de resolución: esto es medir exactamente dos compuestos que absorben a longitudes de onda muy cercanas.

Espectro de Luz. En la luz blanca existen tres grandes regiones:

Ultravioleta: Comprende longitudes de onda menores de 400 nm

Visible: Comprende longitudes de onda de 400 a 700 nm Infrarojo: Comprende longitudes de onda mayores de 700 nm.

DETERMINACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE SOLUCIONES COLOREADAS

I. CURVA ESPECTRAL

A. MATERIALES

- Solución Patrón de la sustancia absorbente, por ejemplo: azul de metileno, rojo de metilo, permanganato de potasio o sangre desfibrinada.

- Agua destilada- tubos graduados de 50 y 15 ml. - 2 pipetas de 5 ml y 10 ml- Espectrofotómetro- Papel milimetrado

B. MÉTODOS

B.1. Preparación de los estándares: Se prepararàn 10 estandares de la solución coloreada, haciendo diluciones seriadas a la mitad de la siguiente forma:. a. Marcar cada tubo con el número de la diluciónb. En cada tubo graduado va a medir exactamente 5 ml de agua destiladac. Al tubo N. 1 le va adicionar 5 ml exactos de la solución marcada como patrón o stardar inicial del compuesto coloreado.d. Agitar el tubo por inversión para mezclar y formar la primera dilución del estándar.e. Preparar la segunda dilución adicionando al tubo marcado como dilución N.2, 5 ml exactos de la dilución N. 1, como en el caso anterior se agita por inversión del tubo.f. Continuar preparando las diluciones N.3 a N. 10, repitiendo el paso descrito en el ítem anterior, utilizando la dilución inmediatamente anterior.

B.2 Curva Espectral a. Prender el espectofotometro 10 min antes de iniciar sus medidas.b. Calibrar el equipo con y sin solución blanco, ajustando 350 nm como longitud de onda.c. Adicionar a la celda 1 ml exacto del estándar N. 4.d. Medir la transmitanciae. Retirar la celda, variar la longitud de onda a 400 nm, calibrar nuevamente el equipo, y medir nuevamente la absorbancia de la misma muestra contenida en la celda (dilución N. 4 del estándar).f. Variar la longitud de onda en 50 nm (para este caso 450 nm) y repetir lo descrito en el ítem anterior.g. Seguir variando la longitud de onda cada 50 nm (hasta llegar a700 nm) cada vez repitiendo los pasos descritos anteriormente. h. Transforme el %T obtenido en Absorbancia utilizando las tablas dadas en el apéndice 1 ó

mediante fórmula (A=2-%T). Tabular sus datos

La curva espectral se realiza graficando los valores de Absorbancia de la solución coloreada (absorbente) en la ordenada, leídos a diferentes longitudes de onda (abcisa):

Con los datos obtenidos trazar en papel milimetrado la curva espectral, graficando las longitudes de onda en la abcisa y las absorbancias en la ordenada e informar el rango de longitud de onda óptimo l para la solución coloreada utilizada. Cada sustancia presenta una mayor absorción en una región del espectro (rango de lectura) a una longitud de onda característica.

Las curvas espectrales permiten determinar la longitud de onda en la cual la solución presenta la máxima absorción de luz. (Figura 2.6) Por lo tanto, el trazado espectral de una solución nos da información sobre el color y la naturaleza química de la sustancia que la compone.

II. ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN

Debe conocerse la longitud de onda o el rango óptimo de Absorbancia para la sustancia a analizar (que ha sido hallada mediante una curva espectral).

Se prepara una serie de patrones de concentración conocida de la sustancia problema que se va a estudiar. Seguidamente se prepara el blanco adicionando todos los reactivos participantes sin añadirle muestra a analizar, es decir el blanco corresponde al 100 %T o sea al cero de Absorbancia. De esta forma se hace corrección inmediata de la absorción que puede presentarse por el reactivo y que pudiera aumentar falsamente la concentración de la sustancia a analizar

Figura 2.6. Curva espectral.

Los %T se transforman a Absorbancia (D.O)

Se realiza en papel milimetrado una curva resultante de graficar en la abcisa las diferentes concentraciones de los patrones procesados y en la ordenada las absorbancias correspondientes a cada uno. Si se cumple la ley de Beer Lambert uniendo los puntos se obtendrá una recta, dentro de un rango de absorbancia vs. Concentración. Tambien se determinarán los rangos de desviación.Solo con el rango lineal posible hallar cualquier concentración desconocida de la sustancia analizada, si interpolamos sobre la ordenada el dato correspondiente a la Absorbancia del desconocido en la abcisa. Dado que muchas curvas cumplen las leyes de Beer Lambert por la ley matemática de proporciones, se cumple:

Absorbancia 1 Absorbancia 2____________ : _____________

Concentración 1 Concentración 2

Dado que conocemos la concentración del patrón estándar y las absorbancias de ambos casos, del patrón y de la muestra, es posible, despejando, hallar la concentración desconocida:

_A standard (A St ) = _A muestra (A m) ; C muestra = _A m_ X C St

C standard (C St ) C muestra (C m) A St

En donde:A = Absorbancia m = MuestraC = Concentración St = Estándar o patrón

Factor = C St A St

RECORDAR QUE ESTA PROPORCION ES VALIDA SOLO SI YA ESTÁ COMPROBADO QUE LAS CURVAS CUMPLEN LAS LEYES DE BEER LAMBERT.

PROCEDIMIENTO

a) Partiendo de las diluciones seriadas de concentración conocida que preparó en el punto anterior, y habiendo realizado la curva espectral con la que determinó su longitud de onda optima. Ajuste el equipo en esta longitud de onda y calíbrelo utilizando agua como blanco de reactivos.

b) Lea %T de cada una de las concentracionnes de la solución y transforme sus valores de Transmitancia a Absorbancia. Recuerde inciar el proceso utilizando la dilucuón de mejor concentración.

c) Con los datos obtenidos construya en papel milimetrado la curva de calibración graficando concentraciones en la abcisa y absorbancias en la ordenada. Determine el rango lineal y el rango de desviación.

d) Calcular la concentración de las muestras problema mediante la gráfica y mediante fórmula.

f) Con los datos obtenidos durante la práctica, realice el informe.

g) Determine la concentración de sus muestras de análisis realizando incluso las diluciones que sea necesario. Interpole los datos de absorbancia en su grafica de calibración para obtener los valores de concentración. Reporte sus valores de forma tabulada.Discuta y concluya su informe.

BIBLIOGRAFIA

1. Fischer & Peters; “Compendio de análisis químico cuantitativo”; Nueva EditorialInteramericana, S. A. de C. V.; 1ª edición; 1971; pp. 400 - 450.2. Gilbert H. Ayres; ”Análisis químico cuantitativo”; Ediciones del Castillo, S. A.; 1970; pp 459-514.