Universidad Austral de Chile

Instituto de Bioquímica y Microbiología, Facultad de Ciencias Bioquímica General, BIOQ-221

PROTEÍNAS: PROPIEDADES Y MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN PURIFICACIÓN DE LISOZIMA

Constanza Cárcamo, Fabiola Torres

INTRODUCCIÓN. Las proteínas son las biomoléculas más importantes ya que cumplen variadas funciones dentro de la célula entre ellas formar parte fundamental de estructuras, ser biocatalizadores, estar involucradas en los procesos de defensa del organismo. Poseen características que son de gran interés debido a la utilidad que presentan en el ámbito de la bioquímica, para la separación y cuantificación de estas macromoléculas (1). Se analizan varias de sus propiedades, métodos de cuantificación y por otra parta la purificación de lisozima, para así poder discutir cual es el funcionamiento y las propiedades principales de las proteínas. Una de las características más ventajosa de las proteínas, consiste en su propiedad amortiguadora, que viene dada por la cadena R con grupo ionizable. Se titularon muestras de suero sanguíneo, obteniéndose como resultado que aquel que no fue desproteinizado necesito una mayor cantidad de miliequivalentes de HCl para producir un cambio brusco en el pH, estableciéndose de esta manera la capacidad tamponante que tienen las proteínas. Otra propiedad estudiada fue el punto isoeléctrico (pI), punto donde la proteína presenta su

menor solubilidad, que fue el método por el cuál se estudió en la caseína, obteniéndose precipitación entre los pH 4,4 y 4,74, que se encuentran entre el valor del pI que da la literatura correspondiente a 4,6 (2). Dos análisis fueron realizados para evaluar la solubilidad de las proteínas, en primer lugar como disminuye esta propiedad al agregar una sal, demostrando la presencia de precipitado tanto en el sobrenadante como en la correspondiente al precipitado. En segundo lugar, se estudio respecto al efecto de la temperatura en un solvente orgánico. Tanto a los -10°C como a temperatura ambiente se observo precipitado, que es atribuido a la disminución de la solubilidad por el solvente orgánico. Sin embargo esta precipitación fue reversible para el caso de los -10°C ya que, al disminuir la temperatura disminuye la capacidad desnaturante del alcohol. Cuantificación de proteínas fue llevada a cabo por los métodos de Biuret y Bradford, realizándose curvas de calibración para cada método de acuerdo a las concentraciones de las soluciones estándar y las absorbancias medidas con cada método. Se obtuvo una concentración de

muestra de 83,7 y 25,8 mg/ml, para Biuret y Bradford respectivamente. La lisozima, objeto de nuestro estudio, es una enzima que se caracteriza por catalizar la hidrólisis de las paredes celulares de las bacterias al romper los enlaces glucosídicos β-1,4 entre el ácido N-acetilmurámico y N-acetilglucosamina, para el presente estudio esta enzima fue obtenida de la clara de huevo y caracterizada principalmente por tener un pI de 11, ser una cadena polipeptídica de 129 aminoácidos, tener un peso molecular de 14,6 kDa, forma semi helicoidal con hélices alfa y algunas regiones de lámina beta extendida y cuatro enlaces disulfuro, es la proteína que se encuentra en mayor abundancia en la clara de huevo. También es posible encontrarla en lagrimas y saliva de animales, entre otras secreciones. Para poder realizar su purificación el primer paso llevado a cabo fue la separación de la clara del huevo, obteniendo un extracto de la clara de huevo. El cual es sometido a una cromatografía de intercambio catiónico, aprovechando la diferencia de puntos isoeléctricos de las diferentes proteínas contenidas en la clara; lisozima pI 11, con el resto las cuales no superan el pI de 8. Así al trabajar a un pH de 8,2 los grupos de la matriz quedan cargados negativamente, reteniendo en ella a la lisozima que presenta una carga neta positiva a diferencia de las otras que presentan una carga neta negativa y son eluídas en la primera parte de la cromatografía. Posteriormente se eluyó la proteína con un gradiente iónico que permite su separación de la columna. Y así se pudo obtener la separación de la lisozima en la fracción de eluído, del resto de las proteínas que se encuentran en la fracción de lavado. Estas fueron fracciones son colectadas para la

posterior su posterior cuantificación, utilizando el método de Bradford en el cual se utiliza la propiedad del colorante azul de Coomasie de unirse a las proteínas y presentar máximos de absorbancias característicos a las 595nm, las cuales son medidas para las diferentes muestras en estudio, obteniéndose así las concentraciones de 4,38mg/ml para lavado, 0,57mg/ml eluído y 7,32mg/ml crudo Para la determinación del grado de pureza se midió la actividad frente a la bacteria Micrococcus lysodeikticus, donde una disminución de la turbidez en la suspensión bacteriana permite comprobar la actividad catalítica en distintas fracciones de enzima, al realizar la misma medición con un estándar de lisozima comercial. Esta medición se realizó con un espectrofotómetro sabiendo que una unidad de actividad enzimática (U) provoca un ΔA/min=0,001 La fracción de lavado fue purificada en un 0,97%, la de elusión en un 65,8% y el extracto crudo en un 12% Finalmente se realizó una separación electroforética en SDS-PAGE, donde se pudo comprobar la presencia de lisozima de acuerdo a los tamaños moleculares estándar, obteniéndose en las muestras de crudo y eluído una banda de 13,7 kDa, valor cercano al peso molecular de la lisozima que según la literatura correspondiente a 14,6kDa. Adicionalmente a la electroforesis el gel obtenido se utilizo para una inmunodetección por Western Blot, método en la cual se utilizan anticuerpos que son específicos para la proteína u enzima que se está tratando, que permite identificar proteínas en mezclas complejas, además de calcular el peso molecular y medir las cantidades relativas de proteínas en cada muestra, y con el cual se

detectó la presencia de lisozima en las fracciones de eluído y crudo.

RESULTADOS: 1) Propiedades de las proteínas. 1.a) Propiedad amortiguadora del pH de las proteínas. Para el análisis de esta propiedad, se procedió a titular con HCl 0.01N, 0.5ml tanto de suero sanguíneo, como de suero sanguíneo desproteinizado y agua con 1.5ml de NaCl 0.15M respectivamente. Para obtención de suero sanguíneo desproteinizado, se procedió a calentar en un baño a ebullición un 1ml de suero sanguíneo, durante 1 a 2 minutos, con la posterior homogenización y centrifugación de éste, separando finalmente el sobrenadante, él cual fue titulado. En cada una de las titulaciones fue empleado el indicador Rojo Congo, el cual vira en aquellos límites en que se sospecha de la propiedad amortiguadora de las proteínas. Resultados de las titulaciones son posibles de observar en la tabla I.

TABLA I

Cantidad de HCl 0,01N (meq) gastados en las distintas muestras tituladas.

Muestra titulada

Cantidad de HCl

gastado (ml)

HCl 0.01N gastados

(meq)*

Suero sanguíneo diluido

5.1 0.051

Suero sanguíneo desproteinizado

2.5 0.025

Agua destilada 0,05 5x10-4

A modo de ejemplo, se demuestra el cálculo para los miliequivalentes de HCl gastados, en el caso del suero sanguíneo diluido. meq = volumen HCl gastado x normalidad HCl

meq= 5.1ml x 0.01N meq= 0.051 miliequivalentes

1.b) Determinación del punto isoeléctrico de la caseína. Para la determinación del punto isoeléctrico de la caseína, se analizó la solubilidad que presenta la caseína a distintos pH, al ser añadidos los 6mg/ml de caseína en 0.1M acetato de sodio a diferentes tubos con una concentración de ácido acético de 1M, 0,1M y 0,01M según corresponda y con diferentes volúmenes para cada tubo. Finalmente se agitaron los tubos y transcurrido un período de 20 minutos, se observo la turbidez de estos, los cuales se informan en la Tabla II.

TABLA II Solubilidad de la caseína, en función del precipitado y la turbidez de la solución,

a diferentes pH

Observación: El nivel de turbidez se designa:

O= sin cambio, solución translúcida. += turbidez, opalescencia.

x= precipitado

1.c) Separación por salazón de las proteínas del suero sanguíneo. Se procede a agregar lentamente 1ml de sulfato de amonio a 1ml de suero, quedando así la solución a media saturación. Luego se centrifugo la solución a 2500rpm por un período de entre 10 a 15 minutos, separando así el sobrenadante. Se toma una porción del precipitado, dejándose ésta en otro tubo y disolviéndose en 20ml de agua destilada. Se comprueba la presencia de proteínas tanto con el sobrenadante como en el precipitado disuelto agregando 0,5ml de ácido tricloroacético al 10%.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

pH 5,97 5,67 5,44 5,14 4,74 4,44 4,24 3,84 3,50

20 minutos

O O+ + x xx xx x x O

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12

Concentración (mg/ml)

Ab

sorb

anci

a a

54

0n

m

TABLA III Análisis de precipitación en las muestras de suero sanguíneo.

Suero sanguíneo a media saturación

con (NH4)2SO4

Precipitación por CCl3COOH

Sobrenadante Positiva

Precipitado (solubilizado)

Positiva

Existe presencia en ambos casos precipitado, al agregar el ácido tricloroacético lo que comprueba la presencia de proteínas.

1.d) Acción del alcohol a diferentes temperaturas sobre las proteínas del suero sanguíneo. Dos muestras de suero sanguíneo, 1 ml de cada una respectivamente, fueron tratadas a diferentes temperaturas. A una de ellas, se le añadió 3ml de etanol 95° a temperatura ambiente y a la otra muestra, también se añadieron 3ml de etanol 95° pero se equilibro la temperatura a -10°C. Cada una de las muestras se mantuvo a su temperatura respectiva por 30 minutos. Posterior a esto se diluyeron ambas 1:4 en solución de NaCl 0,15M, llevándolas a temperatura ambiente. Evaluándose finalmente el efecto del etanol sobre la solubilidad de las proteínas a diferentes temperaturas y la reversibilidad de la precipitación, como se observa en la Tabla IV.

TABLA IV Efecto del etanol sobre la solubilidad de las proteínas a diferentes temperaturas y reversibilidad de esta precipitación.

Temperatura aproximada

(°C)

Presencia de

precipitado

Resolubilización con NaCl 0,15M

-10 Positivo Positivo

20 Positivo Negativo En la tabla es posible apreciar el efecto que tiene este solvente orgánico en la solubilidad de las proteínas y como la temperatura influye en la resolubilización de éstas.

2) Métodos de cuantificación de proteínas. 2.a) Método de Biuret. A seis tubos de ensayo, se les agregaron distintos volúmenes de solución patrón de albúmina 10mg/ml, agua destilada y reactivo de Biuret. Valores que se entregan para cada tubo en la Tabla V. Se espera un período de 30 minutos, para luego medir la absorbancia a 540nm. Con estos valores es posible generar la curva de calibración (Figura 1) para así obtener la concentración de la muestra que se nos fue entregada.

TABLA V Valores de volúmenes agregados a los distintos tubos y absorbancias medida

según método de Biuret.

La muestra fue diluida 10 veces para obtener la absorbancia en el rango de la curva de calibración.

FIGURA 1. Curva de calibración del método de Biuret. Se realizó a través de las absorbancias medidas para las soluciones patrones, la cual se utiliza para calcular las concentraciones de la muestra entregada mediante el método de Biuret. Mediante regresión lineal se obtuvo la ecuación: y = 0,0541x + 0,0033

N° tubo Patrón albúmina

[µl]

H2O[µl] Concentración [mg/ml]

Reactivo de

Biuret [ml]

A

1 (blanco)

0 200 0 0,8 0,000

2 40 160 2 0,8 0,104

3 80 120 4 0,8 0,222

4 120 80 6 0,8 0,354

5 160 40 8 0,8 0,424

6 200 0 10 0,8 0,539

Muestra 200 (suero)

--- X 0,8 0,456

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

Concentración (mg/ml)

Ab

sorb

anci

a a

59

5n

m

2.b) Método de Bradford. A una serie de tubos, se añaden distintos volúmenes de una solución patrón de albúmina de bovino 0,1mg/ml, agua destilada y el reactivo de Bradford, él cual se entrego preparado. Se especifican los volúmenes para cada tubo en la tabla Vl. Luego de añadir el reactivo de Bradford, los tubos se agitan y se incuban durante 10 minutos, una vez el tiempo finaliza se mide absorbancia 595nm.

TABLA VI. Valores de volúmenes agregados a los distintos tubos y absorbancias medida según método de Bradford.

Muestra fue diluida 1000 veces, para así medir una absorbancia dentro del rango de la curva de calibración.

FIGURA 2. Curva de calibración del método de Bradford. Se realizó a través de las absorbancias medidas para las soluciones patrones, la cual se utiliza para calcular las concentraciones de la muestra entregada mediante el método de Bradford. Mediante regresión lineal se obtuvo la ecuación: y = 5,0568x + 0,0027 Ejemplificaremos según este método como se cálculo la concentración. y = 5,0568x + 0,0027, donde y es la absorbancia de la muestra por el método de Bradford y x, la concentración de ésta. Reemplazando la absorbancia, cuyo valor es 0,133, se despeja la incógnita, y se obtiene una concentración de 0,0258 mg/ml para la muestra diluida.

A través de las ecuaciones obtenidas de las Figuras 1 y 2, es posible realizar la determinación de la concentración de nuestra muestra como se observa en la Tabla VII.

TABLA VII Cálculos de las concentraciones de la

muestra, según las curvas de calibración realizadas por los métodos

de Biuret y Bradford.

*La muestra está diluida 10 veces, por lo tanto la concentración inicial de la muestra

corresponde a 8,3678mg/ml x 10 = 83.678mg/ml.

**La muestra está diluida 1000 veces, por lo tanto la concentración inicial de la muestra corresponde a 0,0258mg/ml x

1000 = 25,8 mg/ml.

3) Purificación de lisozima.

3.b) Purificación y cuantificación de la Lisozima. Para la purificación parcial de la lisozima se realizó una cromatografía de intercambio catiónico, con gradiente salino, con la posterior medición de la absorbancia de las correspondientes muestras. Previo a la realización de la cromatografía se preparó el extracto de huevo crudo a analizar mediante a separación de la clara del huevo, la que luego fue filtrada en capas de gasa hasta obtener 15 ml de líquido fino, que fue diluido en 70 ml de buffer A (TRIS-Hcl 50mM pH 8,2 conteniendo 50mM de NaCl.) y nuevamente filtrado en un embudo con lana de vidrio obteniendo así un líquido claro y fino tipo jalea, que corresponde a una dilución de la clara de huevo. Posterior a esto se procedió a armar la columna de cromatografía la cual es de

N° tubo Agua destilada

[µl]

Estándar [µl]

Muestra [µl]

Reactivo color [ml]

Concentración [mg/ml]

A

1 100 --- --- 1 0,00 0,000

2 90 10 1 0,01 0,071

3 80 20 1 0,02 0,112

4 60 40 1 0,04 0,136

5 40 60 1 0,06 0,386

6 20 80 1 0,08 0,391

Muestra --- --- 100 1 X 0,133

A Concentración. diluída (mg/ml)

Concentración [mg/ml]

Muestra (método de

Biuret) 0,456 8,3678* 83,678

Muestra (método de Bradford)

0,133 0,0258** 25,8

carboximetilcelulosa. Se equilibró con 5ml de Buffer A (Tris-Hcl 50mM pH 8,2 conteniendo 50 mM de Nacl) y después se añadió 3 ml de resina, dejándola sedimentar, y finalmente se reguló la velocidad de flujo a 20 gotas por minuto. Se procedió a realizar el proceso cromatográfico, agregando 5 ml de extracto crudo a la columna y recolectando las elusiones de lavado, con buffer A, en 15 fracciones de 3ml y luego 15 fracciones de eluído, en buffer B, de 1 ml cada una. Estas fracciones son llevadas a un espectrofotómetro EVOLUTION 60, midiendo las absorbancias a 280nm en cubeta de cuarzo, realizando también la medición del extracto crudo. A continuación se muestran los resultados de las máximas absorbancias obtenidas FIGURA 3. Cromatograma de la separación de la lisozima del extracto de clara de huevo. El peak comprendido entre la

fracción 1 a 14 corresponde a la fracción de lavado, contenido distintas proteínas de la clara de huevo. Las fracciones 15-30 corresponden a la fracción de eluído, conteniendo a la lisozima.

TABLA Vlll

Valores de las máximas absorbancias obtenidas en las fracciones de lavado y eluído.

Fracciones A (280 nm)

Lavado 3,002

Eluído 2,349

Aquellas fracciones que presentaron absorbancias fueron traspasadas a un tubo falcón de 15 ml, a las cuales, junto al extracto crudo, nuevamente se les realizó una

medición de sus absorbancias por medio del método de Bradford, para su cuantificación, realizando previamente las diluciones correspondientes de cada una para así poder medir en un rango de concentración de 0,1 a 1 mg/ml, y poder trabajar a partir de un estándar de BSA de 0,1 mg/ml. Obteniéndose así las siguientes mediciones de las absorbancias de las soluciones patrón, resumidas en la siguiente tabla.

TABLA lX Absorbancias obtenidas para las

distintas muestras mediante el método de Bradford y concentraciones del

estándar de BSA, para la elaboración de una curva de calibración

A partir de las absorbancias obtenidas por el método de Bradford, y las concentraciones del estándar de BSA se confeccionó una curva de calibración para poder determinar las concentraciones de las muestras de lavado, eluído y crudo. Mostrado a continuación: FIGURA 4. Absorbancia vs concentración de proteínas a partir de un estándar de BSA 0,1 mg/ml. Curva de

calibración, para la obtención de concentraciones, ecuación de la recta

Tubos Agua destilada

µl

Estándar µl

Muestra µl

Reactivo de

Bradford (ml)

Concentración (mg/ml)

A

1 100 -- -- 1 0,000 0,000

2 90 10 -- 1 0,010 0,072

3 80 20 -- 1 0,020 0,112

4 60 40 -- 1 0,040 0,136

5 40 60 -- 1 0,060 0,368

6 20 80 -- 1 0,080 0,391

Ejemplo para el cálculo de las concentraciones en lavado, eluido y crudo por regresión lineal -Muestra de crudo: Y = 5,0516x + 0,003 0,373 = 5,0516x + 0,003 X= 0,0732 mg/ml Considerando que se realizo una dilución de 100X: 0,0732mg/ml x 100 = 7,32 mg/ml

TABLA X Concentraciones de las muestras de

lavado, eluido y crudo.

Fracción Absorbancia Concentración (mg/ml)

Lavado 0,224 4,38

Eluído 0,291 0,57

Crudo 0,373 7,32 Las absorbancias mostradas corresponden a las obtenidas de la medición por medio del método de Bradford. Las concentraciones se obtuvieron a partir de la ecuación de la recta obtenida de la curva de la calibración, de los resultados de las mediciones del método de Bradford usando las concentraciones de un estándar de BSA. Para las muestras de lavado y crudo el factor de dilución corresponde a 100X. Para la fracción de elusión a 10X

3.2) Determinación de la actividad específica y el grado de pureza de la lisozima. Con las fracciones de lisozima cruda, lavada y semi-purificada obtenidas anteriormente se realizaron ensayos para determinar la actividad específica (U/mg proteína) y el grado de pureza de la lisozima, además del porcentaje de rendimiento. Para ellos se adicionó la muestra a una suspensión de bacterias liofilizadas 0,25 mg/ml y resuspendidas en tampón fosfato de sodio 40 mM pH 6,2 a 20ºC. Para determinar la actividad de la muestra se utilizó un estándar comercial de lisozima de huevo de gallina (sigma) 50 mg/ml disuelta en agua estéril. Previo a la medición en el espectrofotómetro se realizan las diluciones necesarias, y se comienza por calibrar con blanco de agua a 450 nm, luego se mide a

tiempo cero 950 µl del sustrato. Luego de esto se procedió a programar el equipo para una lectura cinética midiendo así la actividad muramidasa a cada una de las muestras, de las cuales se aplicaron 50 µl junto a 950 µl de sustrato, obteniendo así del espectrofotómetro los siguientes gráficos. Tabla Xl Valores obtenidos de ∆A/min para las distintas muestras medidas.

Fracción ∆A/min*

Lavado 5x10-4

Eluido 6,75x10-3

Crudo 6,25x10-3

Estándar 0,01025

*Valores obtenidos del promedio de todos los deltas entregados en las lecturas cinéticas de cada una de las muestras

Cálculos para el extracto crudo: -Unidad de actividad enzimática U = ∆A/min = 6,75x10-3 = 6,75U 0,001 0,001 -Proteínas totales: Se calcula conociendo la concentración de proteína y el volumen con el cual se realizó la medición de la variación de absorbancia. Proteína total: 0,025 mg/ml x 0,05 ml = 6,25x10-3 -Actividad específica: U/mg= 96,75/ 6,25x10-3 = 1000 U/mg -Purificación: Como actividad de referencia se escogió la actividad del estándar. Actividad específica = 1000 / 8200 = 0,12 Actividad de referencia

-Porcentaje de rendimiento: Se escogió como referencia la actividad total del crudo. % Rendimiento= Purificación x100 0,12 x 100 = 12%

TABLA XIl

Purificación para la obtención de lisozima.

3.3) Separación electroforética de

proteínas por SDS-PAGE.

Se prepararon diluciones de

las muestras, de las cuales se

aplicaron 20 microlitos al gel

discontinuo de poliacrilamida,

entregado preparado y listo al iniciar

la sesión práctica, al mismo tiempo

se cargo un estándar de peso

molecular de distintas proteínas. La

separación se realizó corriendo el

gel a 200 V constante.

Ejemplo de Calculo del volumen utilizado en la fracción de extracto crudo para cargar en el gel de poliacrilamida, de forma tal que al tomar alícuotas 100ul se obtuviese una concentración final de 250ug/ml y considerando el buffer de carga 5X -Volumen de muestra a utilizar de la fracción de lavado 8,573 mg/ml x X = 100ml x 250 mg/ml V= 2,92 microlitros de muestra. Las muestras ya preparadas, antes de ser aplicadas en el gel se fueron llevadas a un proceso de denaturalizacón que consistió en

calentarlas durante 5 min a 95ºC, luego de esto se cargan en el gel con un volumen final de 20 microlitros y se pone a correr la electroforesis durante 35-45 min. Finalmente se desmonta el gel de las placas de vidrio, se fijó en una solución de isopropanol 25%/ ácido acético 10% durante 1hr, para luego ser teñido con azul de coomasie durante 1 hr y desteñido, en estas

condicione se obtuvo.

FIGURA 5. Electroforesis de las distintas fracciones obtenidas para la purificación de lisozima. Los carriles corresponden a 1)estándar PAGE RULER. 2) Extracto Crudo 3) Fracción de lavado. 4) Fracción de elusión. Se observa la presencia de lisozima en el carril 2 y 4, indicadas por la flecha.

A partir de la imagen del gel, se pueden calcular los Rf correspondientes a las bandas de cada carril, conociendo los pesos moleculares del estándar utilizado, se puede calcular el log del peso molecular, y así graficar una curva de calibración con estos datos. Para finalmente calcular los pesos moleculares de las muestras. Se muestra a continuación los valores, en la tabla v y la curva de calibración en el gráfico 3, con el ejemplo de calculo correspondiente a Rf.

Fracción Actividad Enzimática

(U)

Proteínas totales (mg)

Actividad específica

(U/mg)

Purificación nº de veces

Rendimiento (%)

Lavado 0,5 6,25E-3 80 9,7x10-3 0,97

Eluido 6,75 1,25E-3 5400 0,658 65,8

Crudo 6,25 6,25E-3 1000 0,12 12

Estándar 10,25 1,25E-3 8200 1 100

TABLA Xlll Valores de Rf y log de la masa molecular

del estándar PAGE RULER, para la construcción de una gráfica.

Banda Masa Molecular

(kDa)

Log masa molecular

Rf

1 250 2,398 0,03

2 130 2,114 0,055

3 95 1,978 0,09

4 72 1,857 0,15

5 55 1,740 0,22

6 36 1,556 0,33

7 28 1,447 0,43

8 17 1,230 0,68

9 10 1,000 0,92

Ejemplo de calculo para los valores de Rf

- Ejemplo peso molecular del

estándar, 250 kDa

Rf= 6/200

0,03

A partir de los datos anteriormente obtenidos es posible realizar la siguiente gráfica

FIGURA 6. Valores del estándar de peso

molecular conocido, Rf vs log PM. Curva

de calibración a partir de la cual se obtendrán

los pesos moleculares de las muestras.

Ecuación de la recta Y= -1,0108x + 1,9162. Se

utilizaron los puntos desde el peso Molecular de

55kDa hasta 10kDa para obtener un mayor

ajuste en los puntos.

TABLA XlV

Valores de Rf para las bandas obtenidas

para cada carril en donde se aplicaron las

muestras.

Carril Numero de

bandas Rf

2 1 2 3

0,13 0,27 0,77

3 1 2

0,13 0,27

4 1 2

0,23 0,77

Conociendo la ecuación de la recta

y los valores de Rf, es posible

calcular los pesos moleculares de

las bandas obtenidas en cada carril.

Ejemplo de Calculo. Carril 1

banda 1

Y= -1,0108x + 1,9162

Y= -1,0108 (0,13) + 1,9162

Y=1,785 log PM

Anti log 1,785 = PM

60,9 kDa = PM

TABLA XV

Valores de peso molecular para

las bandas obtenidas en el gel

para los carriles de muestra.

Carril Numero de banda

Peso molecular

(kDa)

2 1 2 3

60,9 43,98 13,7

3 1 2

60,9 43,98

4 1 2

48,27 13,7

Se pueden observar los valores de

peso molecular para las fracciones de

lavado, elusión y crudo, que

corresponden a los carriles 3, 4 y 2

respectivamente.

3.4) Inmunodetección por Western

Blot.

Para realizar la

electrotransferencia se utilizó el gel

de poliacrilamida en SDS, que fue

sumergido en tampón Tris-glicina-

metanol durante 15 minutos a

temperatura ambiente. Se tomo una

membrana de nitrocelulosa con las

mismas dimensiones del gel,

humedecida en el tampón de

transferencia, además se

prepararon 6 papeles whatman 3

MM saturados en tampón de

transferencia. Todo esto fue

transferido a una membrana de

nitrocelulosa en una cámara Trans-

blot SD conectada a una fuente de

poder Power Pac Universal con 15-

10V; el gel transferido se tiñó con

azul de Coomassie R. La solución

para la electrotransferencia que se

utilizó fue tampón de transferencia

(Bjerrum y Schafer-Nielsen) 48 mM

Tris, 39 mM glicina, 20% metanol,

pH 9,2 en SDS 10%. Una vez

realizado esto, se dejo secar la

membrana, para luego incubarla en

BLOTTO (leche descremada

5%/PBS/Tween 20 0,05%), por 30

min. Luego se incubó por 30 min

con el primer antisuero policlonal

anti lisozima preparado en conejo,

se lavó 3 veces con PBS y se volvió

a incubar con el segundo anticuerpo

conjugado con fosfatasa alcalina

(anti IgG de conejo preparado en

cabra y conjugado con fosfatasa

alcalina/PBS tween 20 0,05%) por

30 min. Se realizó 3 lavados cortos

con PBS y se equilibró la membrana

en tampón de fosfatasa (Tris-HCl

0,1M pH 9/NaCl 0,1M/MgCl2 0,05

M).

Finalmente la actividad se

reveló a la oscuridad (resultados en

la figura 6) con una solución NBT 50

mg/ml en 70% dimetilformamida

/BCIP 50 mg/ml en 100%

dimetilformamida. La reacción fue

detenida con agua desionizada y

EDTA 0,2 M

Figura 7. Inmuno detección de lisozima

por western blot. La lisozima fue separada

usando electroforesis en gel de poliacrilamida

en SDS y transferida a una membrana de

nitrocelulosa. Se incubó con antisuero polyclonal

anti-lisozima y un segundo anticuerpo

conjugado con fosfatasa alcalina (Anti IgG). Los

resultados fueron revelados con los sustratos

NBT y PICB. Los carriles corresponden a

1)estándar PAGE RULER. 2) Extracto Crudo. 3)

Fracción de lavado. 3) Fracción de elusión.

DISCUSIÓN: Los resultados obtenidos en la sección propiedades, métodos de cuantificación y purificación de lisozima se discuten a continuación. Para las propiedades amortiguadoras de las proteínas, se sabe que éstas dependen de los extremos amino y carboxilo terminales además de las cadenas laterales de los aminoácidos que las componen (4). Esta propiedad se estudio mediante la titulación de distintas muestras de proteínas, cuyos resultados se encuentran en la Tabla I que muestra la cantidad de HCl necesario para producir el viraje del indicador de pH rojo congo (que tiene un viraje entre los valores de pH 4,2 a 6,3 que va desde el color rojo a al amarillo respectivamente). Como se muestra en la tabla I, se utilizó el doble de miliequivalentes de HCl en la fracción que contenía proteínas en comparación con el suero desproteinizado (proteínas desnaturadas), lo que confirma la capacidad que tienen las proteínas para evitar cambios bruscos en el pH, ya que al necesitar un volumen mayor de HCl para lograr el viraje se establece la existencia de esta propiedad. Respecto a la determinación del punto isoeléctrico de las proteínas, su estudio es de vital importancia ya que nos permite saber la carga eléctrica neta de la proteína a un determinado pH con lo cual podemos separar distintas proteínas de una mezcla mediante una columna de intercambio iónico. El punto isoeléctrico nos indica al pH en el cual la proteína tiene carga neta 0, que es también donde la proteína presenta su menor solubilidad, por lo cual precipita. Esto fue observado para la caseína la cual fue incubada a distintos pH, observándose un precipitado en los tubos 5 y 6 (Tabla II) y realizando los cálculos necesarios para obtener

el pH en los que se encontraba la caseína en estos tubos, se obtuvo que el valor de los pH está entre 4,44 y 4,75 respectivamente, cercanos al punto isoeléctrico descrito en la literatura, que tiene un valor de 4,6 (5) En el análisis de la precipitación por salazón de las proteínas de suero sanguíneo se obtienen los resultados entregados en la Tabla III. En una primera instancia, cuando la solución se encontraba a media saturación sólo un cierto tipo de proteínas precipito y las restantes al quedar en el sobrenadante fueron sometidas a centrifugación y así separarlas. Se comprobó la presencia de proteínas tanto en el sobrenadante como en el precipitado mediante el ácido tricloroacético que fue añadido, ya que ambas fracciones volvieron a precipitar. Para el análisis de la solubilidad de las proteínas en función de la temperatura y utilizando un solvente orgánico, se presentan los resultados en la Tabla IV. Al trabajar a ambas temperaturas, tanto a -10 como a 20°C, se observo precipitación de las muestras de suero sanguíneo, ya que una vez añadido el etanol, este solvente, deshidrata a las proteínas produciendo que estás precipiten. Cuando se evalúa la reprecipitación de las proteínas, en aquella que el etanol se mantuvo a temperatura ambiente no fue reversible la precipitación, porque el etanol desnaturalizo a la proteína. En cambio, cuando se realizó el experimento a -10°C, si fue observable la reversibilidad de la precipitación, lo que nos indica que a menor temperatura disminuye la capacidad desnaturante del solvente orgánico. Fueron utilizados dos métodos para realizar la cuantificación de proteínas, método de Biuret y de Bradford

respectivamente, ambos son ensayos colorimétricos. El método de Biuret sirve para determinación de concentraciones entre 1 y 10 mg/ml, mientras que el de Bradford para concentraciones de entre 0,01 y 01 mg/ml (6). En ambos casos se realizó una curva de calibración a partir de las concentraciones y absorbancias medidas de las soluciones patrones (Figuras I y II). Mediante los cálculos necesarios, obtuvimos una concentración de 83,7 y 25,8 mg/ml para Biuret y Bradford respectivamente. Diferencia que se explicaría por el análisis de las curvas de calibración para cada método, siendo la de Bradford la curva que presenta valores más alejados de la línea de tendencia, disminuyendo así la eficacia de la utilización de la ecuación de la recta, obtenida por regresión lineal para realizar los cálculos de las concentraciones. La muestra de clara de huevo, obtenida mediante su separación del huevo, y posterior filtración con la obtención de un extracto de clara, fue sometida diversos métodos con el fin de realizar una purificación parcial de lisozima, proteína contenida en ella. Inicialemente se realizó una cromatografía de intercambio iónico con este extracto de clara de huevo, con el cual se logró separar la lisozima del resto de las proteínas que forman parte de la clara del huevo, esto ya que al trabajar a ph 8,2 la lisozima se encuentra con carga neta positiva a diferencia de las otras proteínas que se encuentran con carga neta positiva, así la enzima en estudio interacciona con la matriz quedando retenida en ella y separándose así del resto que no son atraídas por la matriz y caen, como podemos ver en la figura 3 el cromatograma nos muestra dos peaks de absorbancias, que nos indican la presencia de proteínas en las

diferentes fracciones colectadas, aquellas que están contenidas en las fracciones 0-5 corresponden a aquellas pertenecientes al lavado, y que contienen todas aquellas proteínas que no fueron capaces de interaccionar con la matriz, y que por lo tanto no corresponden a lisozima, la cual si se encuentra presente entre las fracciones 15 a 20. Al observar la separación de los peaks obtenidos, podemos concluir que la cromatografía se realizó de manera òptima, lo cual nos asegura que hubo una buena separación de las proteínas contenidas en la muestra, y que la fracción eluido contiene solo lisozima y que el resto de las proteínas se encuentran en la fracción de lavado. Sin embargo también es posible que algunas moléculas de lisozima hayan interaccionado con otras proteínas y no con la matriz quedando contenidas en la fracción de lavado. Al realizar la cuantificación de estas fracciones obtenidas y del extracto crudo por medio del método de Bradford podemos ver en Tabla X que la mayor concentración está en el extracto crudo, seguido de la fracción de lavado y finalmente de la fracción de elusión, esto solo nos entrega una visión de la cantidad de proteínas contenida en cada una de las muestras, las cuales no corresponden específicamente a lisozima, razón por la cual la fracción de lavado presenta una menor concentración ya que está contiene solo lisozima, a diferencia de las otras muestras que contienen conjuntos de proteínas. Al realizar la determinación del grado de purificación de lisozima en las diferentes muestras (Tabla Xll) se obtuvo que la fracción de elución presenta una actividad específica mayor de 5400 U/mg producto de que contiene una mayor cantidad de lisozima. Además para esta fracción se obtuvo un % de rendimiento de 65,8 lo cual nos indica que se

encuentra altamente purificada en esta fracción. Por medio de la separación electroforética SDS-PAGE (Figura 5) es posible verificar la presencia de lisozima en la fracción de eluido y en el extracto crudo, ya que como se ve ambas muestras presentan bandas correspondientes a los 13,7 kDa, peso molecular cercano al que tiene la lisozima 14kDa. De acuerdo a la observación del ancho de esta banda, es posible concluir que la fracción de eluido tiene un mayor contenido de la enzima en comparación al extracto crudo que presenta una banda menos pronunciada que la primera. Para la fracción de lavado, como se muestra en la tabla XV, se observan dos bandas que corresponden a 60,9 y 43,98 kDa ninguna de estas cercana a la banda que presentaría la lisozima, lo cual es producto de que no la contiene esta sino que otras proteínas distintas. También es necesario destacar la presencia de más bandas en las fracciones de eluido 48,27(kDa) y de extracto (60,9 y 43,98 kDa), las cuales son esperables para la segunda muestra ya que este corresponde a un extracto sin proceso de purificación por lo cual contiene distintas proteínas, a diferencia del primero, en el cual podemos concluir que en el proceso de cromatografía una pequeña cantidad de otra proteína distinta de lisozima también interaccionó con la matriz, quedando retenida, y eluyendo junto a la lisozima. Finalmente podemos corroborar todo lo anterior con la realización del western Blot, figura 7, en la cual es apreciable la presencia de lisozima en la fracción de eluido con una intensa banda alrededor de los 14kDa, de la misma forma sucede en el extracto crudo, pero con menor intensidad. Para la fracción de lavado no se aprecian bandas, lo

cual esta dado por el hecho de que esta fracción no contiene lisozima.

REFERENCIAS:

1. DAVID L. NELSON, MICHAEL M. COX. 2009. Lehninger, Principios de Bioquímica. Quinta edición. España, Barcelona. Ediciones Omega.

2. ANGEL GIL. 2010. Tratado de Nutrición. Tomo II: Composición y Calidad Nutritiva de los alimentos. Segunda edición.

3. GARRIDO ET AL. 2006. Fundamentos de Bioquímica estructural.

4. GARRIDO ET AL. 2006. Fundamentos de Bioquímica estructural.

5. ANGEL GIL. 2010. Tratado de Nutrición. Tomo II: Composición y Calidad Nutritiva de los alimentos. Segunda edición.

6. GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS. 2012. Bioquímica General, Bloque I. Universidad Austral de Chile.

7. webdelprofesor.ula.ve/.../EXPERIMENTO%208%20LISOZIMA%2006-04.pdf

8. personal.us.es/ruano/docs/practicas.pdf

9. www.bio.davidson.edu/courses/.../Westernblot.html

10. http://biologiaaldia.bligoo.cl/content/view/1541155/Accion-de-la-lisozima-y-la-penicilina.html

11. http://gmein.uib.es/otros/enzimas/Jmoldesarrollo/lisozimajmol/lisozimajmol.html