UNIDAD 2

Enzimología vegetal

Dra. María Inés Isla

30% del peso seco total de la célula vegetal.

90 % excluyendo pared celular y almidón

Proteínas Estructural

Almacenamiento

Enzimas

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Clasificación de las Enzimas

C. Principales problemas en el manejo de las Enzimas

D. Principios fundamentales de su acción catalítica

E. Introducción a la cinética enzimática

F. Enzimas reguladores

Enzimas

A) Propiedades generales de las enzimas

1. Son los catalizadores de las reacciones químicas en

los sistemas biológicos

2. Aceleran muchísimo la velocidad de las reacciones

(106 – 1014 veces).

3. La actividad

catalítica

depende de la

integridad de la

estructura

nativa

Holoenzima:

Apoenzima (parte

proteica, inactiva) +

Grupo prostético

(unión fuerte,

covalente)

Cofactor

(unión debil)

Carácter inorgánico

(iónes metálicos)

Carácter orgánico

(NADH, FAD,

Vitaminas, etc):

Coenzimas)

depa.pquim.unam.mx/proteinas/enzimas/img17.html

http://www.biorom.uma.es/contenido/cibertexto/enz/enz3.htm#mm

4: Especificidad /estereoespecificidad

Complementariedad Geometría

Complementariedad electrónica

Absolutamente específica

Sólo actúa sobre un sustrato

Grupo específica

Actúa sobre moléculas que comparten

una característica estructural

(grupo. funcional)

Enlace específica

Cataliza una combinación específica de

enlaces

Estereoquímica específica

Actúa sólo sobre uno de los

estereoisómeros

(D o L)

5. La ACTIVIDAD de las E depende no solo del

mantenimiento de su estructura nativa sino del pH,

temperatura

6. Control regulatorio:

Efecto sobre la actividad catalítica por un efector

(activador o inhibidor) hasta el control de la expresión

y el turnover de proteínas

A partir de 1982, se sabe que no todas las

enzimas son proteínas; existen moléculas de

RNA con actividad catalítica, las llamadas

ribozimas

Maduración del DNA

• Transcrito primario mRNA

ribozimas

1, 2, 3

1. Splicing ( corte y

empalme) eliminación de

intrones. Intrón de

autocorte y empalme

2. Introducción del

casquete en 5´

3. Introducción de una

cadena rica en adenina

(PoliA) en el extremo 3´.

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Clasificación de las Enzimas

C. Principales problemas en el manejo de las Enzimas

D. Principios fundamentales de su acción catalítica

E. Introducción a la cinética enzimática

F. Enzimas reguladores

Enzimas

Las enzimas se clasifican según la reacción

catalizada: • Nomenclatura:

- Número clasificatorio de 4 dígitos (E.C.)

- Nombre sistemático

- Nombre trivial

ATP + D-Glucosa ADP + D-Glucosa-fosfato

Número clasificatorio: E.C. 2.7.1.1.

2. Clase: Transferasa

7. Subclase: Fosfotransferasa

1. Fosfotransferasas con OH como aceptor

1. D-glucosa como aceptor del fosfato

Nombre sistemático: ATP:glucosa fosfotransferasa

Nombre trivial: hexoquinasa

Nomenclatura: se adiciona sufijo “asa” al nombre del sustrato o de la reacción que cataliza

ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

EC 2.7.1.1

Número sistemático

Enzyme

Comission

Grupo Subgrupo

Sub-subgrupo

Enzima

Nombre común: Hexokinasa

1. Oxidorreductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Ligasas

Clasificación de enzimas:

Grupos

Grupo 1: Oxidorreductasas

Catalizan reacciones de oxidorreducción

En las reacciones redox, siempre tienen que estar

presentes a la vez el aceptor y el dador electrónico.

Ared + Box Aox + Bred

A : es el reductor o dador electrónico; en el curso

de la reacción se oxida (pierde electrones)

B : es el oxidante o aceptor electrónico; en el curso

de la reacción se reduce (gana electrones)

Dador: Aceptor oxidorreductasa

Glucosa : O2 oxidorreductasa

Dador Aceptor Nombre común:

Glucosa oxidasa

Los subgrupos se forman según la naturaleza del dador:

1.1.-.- Sobre grupos alcohol

1.2.-.- Sobre grupos aldehido

1.3.-.- Sobre grupos -CH-CH-

etc.

EC 1.1.3.4

Nomenclatura alternativa en oxidorreductasas:

1. Deshidrogenasas

2. Oxidasas

3. Peroxidasas

4. Oxigenasas

5. Hidroxilasas

6. Reductasas

Reacciones de oxidorreducción

Grupo 2: Transferasas

Catalizan reacciones de transferencia de grupo:

A-X + B A + B-X

Dador: Aceptor - Grupo transferido - transferasa

ATP: D-Hexosa Fosfotransferasa EC 2.7.1.1

Nombre común: hexokinasa o hexoquinasa

. grupos aldehídos

· grupos acilos

· grupos glucósidos

· grupos fosfatos (kinasas, quinasas, cinasas)

Grupo 3: Hidrolasas

Catalizan reacciones de hidrólisis

A-B + H2O A-OH + H-B

No se suelen utilizar nombres sistemáticos en las

hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre

primitivo: Tripsina, Pepsina, Papaína, etc.

Transforman polímeros en

monómeros.

Actúan sobre:

· enlace Ester

· enlace glucosídico

· enlace peptídico

· enlace C-N

Grupo 4: Liasas

Catalizan reacciones reversibles de adición de un grupo a

un doble enlace:

A=B + X AXB

COO-

CH

CH

COO-

H2O COO-

CH

CH2

COO-

HO

Fumarato(trans-)

L-Malato

· Entre C y C

· Entre C y O

· Entre C y N

Grupo 5: Isomerasas

Catalizan reacciones de isomerización

Algunas reacciones isomerásicas:

- Racemasas

- Oxidorreductasas intramoleculares

- Mutasas o transferasas intramoleculares

Reacciones de isomerización y eliminación

Grupo 6: Ligasas

Catalizan la unión de dos grupos químicos a expensas

de la hidrólisis de un enlace de alta energía.

A + B + ATP A-B + ADP + Pi

O bien

C + D + ATP C-D + AMP + PPi Entre C y O

· Entre C y S

· Entre C y N

· Entre C y C

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Clasificación de las Enzimas

C. Principales problemas en el manejo de las Enzimas

(Extracción y purificación de Enzimas)

D. Principios fundamentales de su acción catalítica

E. Introducción a la cinética enzimática

F. Enzimas reguladores

Enzimas

EXISTEN DISTINTAS TÉCNICAS

QUE, COMBINADAS CONVENIENTEMENTE,

RESULTAN EN LA PURIFICACIÓN

DE UNAS DETERMINADAS PROTEÍNAS

Definir objetivos

• de pureza, actividad y cantidad requerida del producto final

• desarrollar un método

• Definir las propiedades de la proteína deseada

• simplificar las técnicas de selección y optimización

• Desarrollar ensayos analíticos

• para una rápida detección de la actividad/rendimiento de

nuestra proteína

• Minimizar el manejo de la muestra en cada paso y reducir el número de

pasos en el proceso de purificación

• evitar procedimientos largos que conllevan el riesgo de pérdida

de actividad/rendimiento

• Minimizar el uso de aditivos

• pueden interferir en ciertos ensayos y requeriría un paso extra

de purificación para eliminarlos

Eliminar contaminantes perjudiciales cuanto antes

• por ejemplo, proteasas, compuestos fenólicos, etc

Estabilizantes o conservantes de la actividad enzimática

ESTRATEGIA GENERAL DE PURIFICACIÓN

SE DEBE PROCURAR SEGUIR UN PROTOCOLO

LO MÁS SIMPLE Y SENCILLO POSIBLE

1. Obtención del extracto crudo

2. Fraccionamiento del extracto crudo por precipitación con sulfato de

amonio, polímeros (PEG), ácido poliacrílico, solventes, cambios de pH,

centrifugación, y diálisis

3. Cromatografía en columna

4. Electroforesis en gel:

•Electroforesis en poliacrilamida-SDS

• isoelectroenfoque

• Electroforesis bidimensional

PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE PROTEÍNAS

Ejemplo

AFINIDAD (GST)

(columna)

GEL FILTRACIÓN

(columna)

INTERCAMBIO IÓNICO

(columna)

HIDROFÓBICA

TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

Interacciones

por afinidad

biológica

Fase

móvil

Fase

estac.

Líquida

Sólida

Tamaño

Adsorción

(¡NO

aBsorción!)

Líquida

Interacciones

electrostáticas

Nombre

Afinidad

Exclusión

Intercambio

iónico

Interacción

Hidrofóbica

Reparto

Hidrofobicidad

Interacciones

inespecíficas

Clase

Tipo

(propiedad)

Adsorción HIDROXIAPATITA

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

LECHO

CROMATOGRÁFICO

f. estacionaria

EMPAQUETADO

COLUMNA

COLUMNA

llave

MUESTRA

APLICACIÓN

MUESTRA

RESERVORIO

f. móvil

ELUCIÓN Y COLECTADO DE FRACCIONES

FLUJO

gravedad

DIFUSIÓN

SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO

volumen de fase

estacionaria de 10 a 200

veces el volumen de

muestra

EQUILIBRADO

(lavado)

Moléc. distribuida en

f.móvil

Moléc. distribuida en

f.estacionaria

PERFIL DE ELUCIÓN

ANÁLISIS DEL

CONTENIDO DE LAS

FRACCIONES

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

ues

ta d

el d

etec

tor

fracción

Espectrofotométrico

Abs 280nm – Proteínas

Otras Abs - Colorantes

FRACCIONES

1 2 4 5 6 7 8 9 3

Pero normalmente las

fracciones no presentan

diferente coloración…

El objetivo de un método cromatográfico es alcanzar un perfil de elución en la que la

separación entre los picos cromatográficos de dos solutos 1 y 2 que eluyan uno detrás

del otro sea óptimo

PROPIEDAD: Tamaño (y forma)

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN POR GEL, DE

EXCLUSION POR TAMAÑO, DE TAMIZADO

MOLECULAR

MICROPARTÍCULAS

FASE MÓVIL

SOPORTE Resina de micropartículas esféricas porosas formadas

por polímeros hidrofílicos (dextrano, agarosa, poliacrilamida o mezcla

de ellos). Diámetro de poro determinado.

Tamaños de poro intervalo o rango de fraccionamiento.

P.e. Sephadex G25: 1000 – 5000 Da

Sephadex G200: 5000 – 250000 Da

F. MÓVIL (LÍQUIDA) solvente acuoso que atraviesa la columna

por los espacios intersticiales (entre las micropartículas).

F. ESTACIONARIA (LÍQUIDA) solvente acuoso (el mismo

que el de la fase móvil) que se encuentra dentro de micropartículas.

F. ESTACIONARIA

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

ues

ta d

el d

etec

tor

fracción

PERFIL DE ELUCIÓN

CROMATOGRAFÍA DE GEL FILTRACIÓN

Molec. GRANDES RÁPIDAS

* Avanzan a mayor velocidad a través de los

espacios intersticiales entre las bolas (con f. móvil)

son eluidas antes

grande

Molec. PEQUEÑAS LENTAS

* Penetran en los pequeños conductos de las bolas de

gel y avanzan a menor velocidad (con f. estacionaria)

son eluidas después

pequeña

2-APLICACIÓN

MUESTRA

3-ELUCIÓN

1- Equilibrado

de la columna

PROPIEDAD: Interacciones electrostáticas (carga eléctrica)

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

MICROPARTÍCULAS

FASE MÓVIL

SOPORTE Resina de micropartículas formadas por polímeros

sintéticos o naturales (dextranos, celulosas, agarosa).

F. MOVIL (LÍQUIDA) Solvente que anula la interacción

electrostática.

2 posibilidades: Gradientes de pH cambio de carga

de las moléculas de la muestra.

Gradientes iónicos (salinos) competencia

por grupos electrófilos.

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Grupos con cargas iónicas

unidos al soporte.

Carga positiva (+) intercambiadores de aniones (-):

cromatografía aniónica

Carga negativa (-) intercambiadores de cationes (+):

cromatografía catiónica F. ESTACIONARIA

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Molec. MENOR CARGA (+) RÁPIDAS

* Son desplazadas más fácilmente por la f.móvil.

Las moléc. (-) son rechazadas por la f. estacionaria

y eluidas directamente.

Molec. MAYOR CARGA (+) LENTAS

* Son retenidas por los grupos cargados iónicamente

de la f. estacionaria.

•Gradiente de pH

•Gradiente salino

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

ues

ta d

el d

etec

tor

fracción

PERFIL DE ELUCIÓN

+

-

Na+

q+ Q+

APLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

* Cromatografía

catiónica

Lavado

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

PROPIEDAD: Interacciones específicas entre dos moléculas

P.e. hormona-receptor

proteína-metal o cofactores como ATP

antígeno-anticuerpo

F. ESTACIONARIA

MICROPARTÍCULAS

F. ESTACIONARIA (SÓLIDA) Ligandos (grupos químicos)

específicos (con afinidad por alguna de las moléculas a aislar)

unidos a la matriz.

-- Comerciales: Concavalina A une glicoproteínas

Proteína A une IgG (anticuerpos)

-- No comerciales: anclaje covalente ligando - matriz

SOPORTE Matriz de micropartículas hidrofílicas sin carga, con

rigidez, inerte y estable (agarosa, acrílica).

F. MÓVIL (LÍQUIDA) Solución que anula o disminuye la afinidad

con el ligando de la fase estacionaria.

-- Solución con el propio ligando Molécula + ligando libre

-- Solución con algo que interacciona con el ligando Molécula

FASE MÓVIL

fracción

Molec. NO INTERACCIÓN RÁPIDAS

* No se unen al ligando de la fase estacionaria

eluyen directamente.

Molec. INTERACCIÓN LENTAS

* Se unen al ligando de la f. estacionaria.

Elución específica.

APLICACIÓN

MUESTRA

LAVADO

ELUCIÓN

ESPECÍFICA

1 2 4 5 6 7 8 9 3

resp

ues

ta d

el d

etec

tor

PERFIL DE ELUCIÓN

LAVADO ELUCIÓN

ESPECÍFICA

molécula

CROMATOGRAFÍA

DE AFINIDAD

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sistema GST (Glutatión-S-Transferasa)

GST

Proteína X

Purificación de PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Cualquier proteína marcada con etiqueta GST

Glut GST Glut

GST Glut

Glut

APLICACIÓN

MUESTRA

ELUCIÓN

Glut

GST: Glutatión S-transferasa de Schistosoma japonicum

El ligando de la fase estacionaria es glutatión (GSH)

La proteína se eluye añadiendo GSH libre

His: Cola de poli-histidina (por ejemplo, 6 His)

El ligando de la fase estacionaria es un metal (Ni, Co)

La proteína se eluye bajando el pH o añadiendo quelantes de

metales

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Aplicación básica PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

Normalmente se combinan diferentes técnicas para optimizar el

proceso (de menos a más específicas).

Unidad de enzima: Se define como la cantidad de E que cataliza la

transformación de 1 µmol de sustrato por minuto bajo condiciones

definidas de trabajo (pH, T, ¨concent de S y cofactores)

Actividad específica: La actividad específica está dada por el

cociente entre el numero de unidades de enzima y los mg de proteína

del preparado.

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Clasificación de las Enzimas

C. Principales problemas en el manejo de las Enzimas

D. Principios fundamentales de su acción catalítica

E. Introducción a la cinética enzimática

F. Enzimas reguladores

Enzimas

Principios fundamentales de la acción

catalítica de las enzimas

¿ cómo funcionan las enzimas ?

• En condiciones fisiológicas las reacciones sin catalizar

tienden a ser lentas (estabilidad de biomoléculas)

• Muchas reacciones bioquímicas suponen situaciones

poco probables

• Una enzima soluciona estos problemas proporcionando

un ambiente tridimensional favorable a la reacción (sitio

activo)

Las enzimas alteran las velocidades de reacción

pero no los equilibrios

(B) E + S ES EP E + P

(A) S P

(A) (B) Cambio de energia libre

(equilibrio)

energia de activación, v

SITIO ACTIVO:

Grupos catalíticos: (the reactive side chains of amino acids

or cofactors,which carry out the bond-breaking and bond-forming

reactions involved)

Sitio de ligamiento: attracts and positions the substrate

Interacciones no covalentes

Cambios

conformacionales

De donde

viene la

energía que

proporciona el

descenso

espectacular

de la Energía

de activación

Interacciones no

covalentes entre la E

y el S: puente

hidrógeno,

interacciones iónicas

e hidrofóbicas

Interacciones

covalentes

transitorias entre la E

y el S:

Energía de fijación Disminuye la entropía

Disminuye la solvatación

Ayuda a la redistribución

electrónica

Cambios

conformacionales: teoría

del encaje inducido

Los grupos

funcionales catalíticos

pueden formar

enlaces covalentes

transitorios

Los grupos funcionales

del S pueden

transferirse

transitoriamente a la

Enzima

La energía de fijación entre enzima y sustrato

proporciona especificidad de reacción y catálisis

Energia

de fijacion

Mecanismos

catalíticos

Catálisis ácido-base

Catálisis covalente o nucleofílica

Catálisis de iones metálicos

Efectos de proximidad y

orientación

Unión preferencial del complejo del estado

de transición

Intermediario cargado inestable

Descomponer en sus

especies reactivas

Se puede estabilizar

transfiriendo protones

(agua, aa, acidos

orgánicos)

A-B A + B

H2O

A-B + E-X: A-X + B A+X: + B

H2O

1. Por unión a sustratos para

orientarlos adecuadamente

2. Por mediación de reacciones

de oxidoreducción

3. Por estabilización

electrostática o protección de

las cargas negativas

* Estos compuestos pueden formarse por donación de protones desde

restos aminoacídicos ácidos del centro activo de la enzima, tales como:

- grupos carboxílicos (-COOH) Glu, Asp

- grupos imidazólicos protonados His

- grupos fenólicos (Ph-OH) Tyr

- grupos guanidinios protonados Arg

- grupos aminos protonados (-NH3+) Lys

Estos grupos pueden convertirse potencialmente en donadores de

protones en una catálisis ácida.

- grupos carboxilato (-COO-) Glu, Asp

- grupo imidazol His

- grupo guanidino Arg

- Grupo amino (-NH2) Lys

Por otra parte:

Pueden servir de aceptores de protones en una catálisis básica.

* La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo

puede estabilizar el estado de transición, y por tanto contribuir a la

catálisis enzimática.

La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base

concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver la hidrólisis

de un éster por una esterasa:

-Consideremos la siguiente reacción no catalizada:

Y + B-X <====> Y--B--X <====> Y-B + X d+

- Si esta reacción puede ser catalizada por una enzima, el sustrato B-X

debe ser susceptible de ataque por un nucleófilo de la enzima:

..

-His-NH

-Ser-OH

-Tyr-OH

-Thr-OH

-Cys-SH

E ..

..

.. ..

B-X d+

+

Para que haya un aumento de la velocidad de reacción, la enzima debe

ser un buen nucleófilo, y también un buen grupo saliente.

Así pues, en presencia de la enzima:

E-N: + B-X <==> X + E-N-B + Y <==> Y-B + E-N: d+

La estabilidad del compuesto intermedio E-N-B nos dice que N: , es

……..

- mejor nucleófilo que Y

- mejor grupo saliente que X

- Existe un elevado número de reacciones enzimáticas que transcurren a

través de catálisis covalente

E-N: (grupo nucleofílico)

Grupos catalíticos específicos contribuyen a la

catálisis

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Clasificación de las Enzimas

C. Principales problemas en el manejo de las Enzimas

D. Principios fundamentales de su acción catalítica

E. Introducción a la cinética enzimática

F. Enzimas reguladores

Enzimas

Cinética del estado estacionario (1913)

Postularon que la enzima se combina en primer lugar

con el sustrato, de forma reversible

El complejo se descompone en una reacción más

lenta, dando lugar al producto y enzima libre

Leonor Michaelis Maud Menten

Cinética del estado estacionario

ES se

mantiene en

un estado

estacionario

Cinética del estado estacionario

d[ES] = k1 [E][S] Formación de ES dt

- d[ES] = k-1 [ES] + k2[ES] Descomposición de ES

dt

E + S ↔ ES → E + P k1

k-1

k2

ET = EL + ES

EL = ET - ES

Formación de ES: k1[EL][S]

Descomposición de ES: k-1 [ES] + k2 [ES]

k1[EL][S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

k1[EL][S] = (k-1 + k2 )[ES]

k-1+ k2 = [EL][S]

k1 [ES]

E + S ↔ ES → E + P k1

k-1

k2

k-1+ k2 = [ET - ES][S]

k1 [ES] KM =

Constante de Michaelis:

Relación entre concentración de sustrato y

velocidad de reacción enzimática

La velocidad inicial de la reacción siempre

corresponde a la ecuación:

vo = k2 [ES]

Cuando toda la enzima se encuentra formando

complejo ES:

vmax = k2 [ET]

Relación entre concentración de sustrato y

velocidad de reacción enzimática

k1[EL][S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

k1[ET - ES][S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

k1[ET][S] – k1[ES][S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

k1[ET] [S] = k-1 [ES] + k2 [ES] + k1[ES][S]

k1[ET] [S] = [ES] (k-1 + k2 + k1[S])

Dividimos por k1: [ET] [S] = [ES] ((k-1 + k2 ) + [S])

k1

[ET] [S] = [ES] (KM +[S])

(KM +[S])

[ET] [S] [ES] =

como vo = k2 [ES]

vo = k2 [ET] [S]

KM + [S]

vo = vmax [S]

KM + [S] Ecuación de

Michaelis-Menten

vmax = k2 [ET]

vmax

[ET]

K2 =

Variables o factores que influyen en la velocidad de

una reacción enzimática

1. Concentración de sustrato

2. Concentración de enzima

3. pH

4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

Km y Vmax son característicos para cada pareja

enzima-sustrato

Significado de la constante Km

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato

3. Mide la función de fijación

4. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (V0.5)

5. Se define para un complejo enzima-sustrato

6. Se mide en unidades de concentración

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar

sustrato; una vez que están ocupados todos, por mucho que

aumente la concentración de sustrato, la velocidad

permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico

La concentración de sustrato afecta la velocidad

de reacción catalizada por enzimas

+ E + Buffer de pH apropiado

Gráfico de dobles recíprocos

1 KM 1 1

vo Vmax [S] Vmax

= +

Ecuación de Lineweaver -Burk

y= ax + b

vo =

vmax [S]

KM + [S]

Muchas enzimas catalizan reacciones con dos

o más sustratos

S1= A

S2=B

P1= P

P2= Q

NAD Y NADPH

(SUST.CONDUCTOR)

DESHIDROGENASAS

D-GALACTOSA+ATP-Mg+2 D-GALACTOSA-1P +ADP -Mg+2

galactoquinasa

Desplazamiento simple ordenado o al azar

Ping-Pong

E

E-N + R-OPO3-2 E-N-PO3

-2

R-OH

ENPO3-2 EN + R*-OPO3-

2

R*OH

fosfogliceromutasa

COOH

CHH2N

R1

+

COOH

C O

R2

COOH

CHH2N

R2

COOH

C O

R1

+

Aminotransferasas (Transaminasas)

Catalizan la interconversión reversible de aminoácidos

y cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor

Su papel es importantísimo en el metabolismo de

aminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:

EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)

EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)

E

A B P Q

EA (EAB)-(EPQ) EQ E

E

A P B Q

EA-EP F FB-FQ E

Efecto del pH sobre la actividad enzimática

grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;

imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos.

Succinato y

centro activo de SDH

pH 7

COO-

CH2

CH2

COO-

+H3NC

NH

NH

CH

+H3N

CH

Arg

Lys

Succinato y

centro activo de SDH,

pH 2

COOH

CH2

CH2

COOH

+H3NC

NH

NH

CH

+H3N

CH

COO-

CH2

CH2

COO-

H2N

C

NH

NH

CH

H2N

CH

Succinato y

centro activo de SDH,

pH 13

Efecto de la temperatura

Log V

1. Aceleración de la reacción por la T según la ecuación

de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT) En condiciones definidas de pH, fuerza iónica y S

log v = log C – Ea/2,3RT

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través de

interacciones con el centro activo u otros centros específicos

(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan a

la enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la

molécula, produciendo un cambio conformacional con

repercusión negativa en la actividad enzimática.

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,

con el complejo enzima-sustrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,

impidiendo la fijación del sustrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo

haga o no el sustrato; el inhibidor, por tanto, no impide la

fijación del sustrato a la enzima, pero sí impide la acción

catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-sustrato

una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo

se conoce como Inhibición Anticompetitiva

Inhibición competitiva

KM aparente es mayor que KM real

Vmáx no se modifica

E ES

EI

I

S

E + P

Características:

- Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente exclusivas

- A muy altas concentraciones de sustrato desaparece la inhibición

- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del

sustrato.

- El inhibidor es tan específico como el sustrato

Se define una constante de

equilibrio de disociación del

inhibidor: Ki =

[E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la

Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + I/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy

altas del sustrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia

del inhibidor competitivo.

COO-

CH2

CH2

COO-

FAD FADH2COO-

CH

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDH

Succinato deshidrogenasa COO-

CH2

COO-

Malonato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidores

competitivos

Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes

es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del sustrato,

sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del

orden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que

puede considerarse irreversible

O2N OC

O

O

N+

H3C

CH3

CH3

O2N OP

ON+

H3C

CH3

CH3

-O O-

Sustrato

O2N OC

ON+

H3C

CH3

CH3

-O O-

Estado de transición

O2N OH + O

N+

H3C

CH3

CH3

C

O

HO Productos

Análogo de

estado de transición

Metanol formaldehido

alcohol deshidrogenasa hepática

Etanol acetaldehido

Inhibición no-competitiva

E ES

EI

I

S

E + P

I

ESI

S Inhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI

ni el complejo ESI son productivos

Inhibición acompetitiva

E ES

S

E + P

I

ESI

Inhibición

Anticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse reversiblemente al complejo ES;

el complejo ESI no es productivo

Ks K3

KI

Inhibición Irreversible

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo

químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki,

sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación

del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente

tóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM)

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

Ser

DFP:

diisopropil

fluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas

- Únicamente sobre la Ser activa

- Insecticidas: Parathion, Malathion

- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa

- Neurogases

A. Propiedades generales de las enzimas

B. Principios fundamentales de su acción catalítica

C. Introducción a la cinética enzimática

D. Enzimas reguladoras

Enzimas

Regulación alostérica (union no covalente y reversible de un efector)

Procesos a nivel celular; regulación de ajuste fino

de la actividad enzimática, a través de efectos de

retroalimentación (negativa o positiva)

Regulación por modificación covalente

Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulación

a gran escala de actividades enzimáticas, a través de

modificación covalente de enzimas, provocadas por

señales (transducción de señales)

Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1

Thr a-cetobutirato Ile Treonina

desaminasa

Síntesis de Isoleucina

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera

enzima de la misma, Treonina desaminasa

Retroalimentación negativa en vías metabólicas

Asp + CP Carbamil aspartato CTP

Síntesis de pirimidinas

ATCasa

El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a la

primera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa

Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activada por ATP

ATP

+

Rutas metabólicas controladas por retroalimentación

Glicolisis Fosfofructokinasa ATP

Neoglucogénesis FBP fosfatasa AMP

Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA

Bios. Colesterol HMGCoA reductasa Colesterol

Bios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

Ruta Enzima Inhibidor

1

1: Arogenato deshidratasa:

inhibida por Phe y activada

por Tyr

2: Arogenato deshidrogenasa

inhibida por Tyr

2

En el estudio de las enzimas controladas por realimentación

negativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:

1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación

2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede

desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.

3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor

de la Km aparente, pero sin embargo no son análogos estructurales

del sustrato

Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:

Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrolla

fuera del Centro Activo (Jacob y Monod, 1960)

s s i

Centro

activo Centro

alostérico

Centro

alostérico

Centro

activo

En ausencia de inhibidor,

el sustrato se fija normal-

mente al centro activo

Cuando el inhibidor ocupa

el centro alostérico, tiene

lugar un cambio conformacional

en el centro activo que impide la

fijación del sustrato

Inhibición alostérica

Acción de un activador alostérico

(esquema de una subunidad)

Acción de un inhibidor alostérico

(esquema de una subunidad)

Otra característica importante de las enzimas alostéricas

es que presentan cinéticas anómalas, normalmente

cinéticas sigmoides:

v

s

La presencia de una

sigmoide implica

la existencia de

cooperatividad en la

fijación del substrato

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una

molécula de sustrato favorece la fijación del siguiente, y así

hasta ocuparse toda la molécula

s s s s s s

s

s

s s

+ + +

1 2 3

En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3

Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación de

una molécula de sustrato dificulta la fijación del siguiente.

El comportamiento cooperativo implica:

1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato

por molécula de enzima (estr.cuaternaria)

2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación

Inhibidores y activadoresalostéricos

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(+ Inhibidor)

(+ Activador)

(sin efectores)

V+

V0

V-

Enzimas reguladoras

2. Modulación covalente reversible

• Fosforilación

• Adenililación

• Uridililación

• ADP-ribosilación

• Metilación

• Carbamilación

Suele haber fenómenos de modificación covalente de

enzimas en la respuesta celular a señales químicas:

1. Neurotransmisores

2. Hormonas

3. Factores de crecimiento

4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación

5. Muerte celular programada (apoptosis)

6. Estímulos antigénicos

7. Luz y otros agentes físico-químicos

Formas de modificación covalente, 1

Fosforilación: Protein kinasas

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Ser

ATP ADP

Ser

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

Formas de modificación covalente, 2

Defosforilación: Protein fosfatasas

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Ser Ser

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

C

N

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

H2O Pi

Formas de modificación covalente, 3

Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa

Tyr O

OH OH

N

N N

N

H2NC

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

CH2 O P

O

O-

O CH2

H

H

H

Formas de modificación covalente, 4

ADP-ribosilación: actúa NAD+ como donador del

grupo ADP-ribosa

H

H

H

O

OH OH

N

N N

N

H2N

+

C

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

NHC

NH2

N

O

OH OH

CH2 O P O P O CH2

O O

O-O-H

Activación de la Rubisco por carbamilación

Carboxilación de la ribulosa-1,5-bifosfato por la Rubisco

Formas de modificación covalente, 5

Rotura proteolítica:

Proteinasa

específica

+

N C

N N C C

Zimógeno

Enzima activada

Regulación por compartimentalización

Taninos condensados

Gimnospermas

Monocotiledón

eas

Musgos ,

hepáticas y

helechos

El sistema Ferredoxina-tiorredoxina reduce enzimas

específicas en presencia de luz

Regulación por la Luz tambien llamado Regulación Redox

El nitrógeno de la fenilalanina es

reciclado C6-C3

Ácido p-

cumarico

Ácido

cinámico

ENZIMAS REGULADAS POR LUZ

NADP: Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa

PAL: Fenilalanina amonio liasa

Fructosa 1,6-bifosfatasa

Ribulosa 5-fosfato quinasa

Sedoheptulosa 1,7-bifosfatasa

Rubisco