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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMAN FACULTAD DE BIOQUIMICA QUIMICA Y FARMACIA
INSTITUTO DE ESTUDIOS VEGETALES “Dr. Antonio R. Sampietro”
CATEDRA DE FITOQUÍMICA
Ayacucho 461 – T. E. 0054 381 4107220
4000 San Miguel de Tucumán – República Argentina
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
DE LA ASIGNATURA
FITOQUIMICA
2013
ASIGNATURA FITOQUIMICA
Responsable de Cátedra
Dra María Inés Isla
Plantel docente Alberto Maria Rosa
Isla María Inés Jaime Gloria
Martinez Arriazu Marta Nieva Moreno María Inés
Ordoñez Roxana Sayago Jorge
Sampietro Diego Sgariglia Melina Soberón Rodolfo Torres Sebastian Zampini Catiana
CÉLULA VEGETAL
INTRODUCCIÓN
Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que evita
cambios de forma y posición que las diferencian de las células animales; contienen
plastidios, estructuras que sintetizan y almacenan alimentos siendo los más comunes
los cloroplastos y casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función
de transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho.
La célula vegetal típica presenta, por fuera de la membrana plasmática, la pared
celular, compuesta fundamentalmente por celulosa (polímero compuesto por moléculas
de glucosa). Las moléculas de celulosa se unen en fibrillas, que constituyen el bastidor
estructural de la pared. Muchas células vegetales forman una pared celular primaria
mientras crece la célula, y otra secundaria formada en el interior de la primaria al final
del crecimiento. Ambas paredes, primaria y secundaria son atravesadas por las vías de
transporte de sustancia llamadas plasmodesmos. La pared celular encierra el contenido
vivo de la célula, llamado protoplasto.
Con el paso del tiempo esta pared puede sufrir una serie de cambios producto del
metabolismo y el envejecimiento, manifestándose con deposiciones de diversas
sustancias tales como lignina, grasas (suberina, cutina, ceras), taninos, etc., que pueden
ser reconocidas mediante pruebas químicas. La pared celular delimita a la célula
vegetal, determina su forma y confina al protoplasto. Este está formado por citoplasma,
que a su vez contiene orgánulos, vacuolas y núcleo.
Otra característica típica de la célula vegetal es la presencia de plastidios, los
cuales pueden ser pigmentados (cloroplastos y cromoplastos) o no pigmentados
(leucoplastos). La clorofila es el pigmento fundamental de los cloroplastos, mientras
que los carotenos dan la coloración rojiza o anarajada de los cromoplastos; dentro de los
plastidios no pigmentados se encuentran los elaioplastos, que almacenan grasas (lípidos)
y los amiloplastos, que almacenan almidón; éstos últimos pueden tener formas diversas
e incluso pueden tener valor taxonómico. También las paredes celulares estas
compuestas por ligninas, que aumentan la rigidez, y las ceras que reducen la pérdida de
agua.
Las vacuolas, son muy importantes en la célula vegetal; su contenido acuoso se
denomina jugo celular, y es variable de una célula a otra. El jugo vacuolar puede contener
ácidos orgánicos tales como oxálico, málico, cítrico, algunas veces en forma de sales de
diversos tipos. El oxalato de calcio puede precipitar en forma de estrellas (drusas) o en
forma de agujas (rafidios) que constituyen sustancias ergásticas. Las vacuolas pueden
contener también taninos, mucílagos, proteínas, aceites, pigmentos (antocianinas), etc.,
estos materiales pueden ser sustancias de reserva o residuos metabólicos.
En el caso de las plantas, la remoción de la pared celular es el primer paso, y crucial,
requerido antes de la introducción del ADN directamente a través de la membrana
plasmática. Los biólogos moleculares producen protoplastos cuando preparan para la
transformación a diversos tipos vegetales. A continuación de la producción de
protoplastos, la membrana celular puede hacerse permeable al ADN usando
electroporación (mediante un campo eléctrico) o polietilenglicol. Los protoplastos
fueron asimismo empleados (con un éxito mucho más limitado) para hacer fusión de
protoplastos, en la cual los protoplastos de distintas especies vegetales son tratadas de
tal manera que ambas se fusionan, resultando en células híbridas de especies cruzadas.
OBJETIVOS:
Obtener protoplastos a partir de diferentes órganos de diversas especies
vegetales mediante degradación enzimática de los distintos componentes de la
pared celular.
Evaluar el rendimiento de protoplastos viables.
Distinguir diferentes tipos de paredes celulares mediante técnicas histoquímicas.
Observar plastidos y sustancias ergásticas de muestras vegetales.
PROCEDIMIENTO
A. Preparar 100 ml de una solución 0,5 M de sorbitol (solución isotónica). Llevar a
pH de 6-7 con gotas de NaOH 0,1 N.
B. Pesar 0,1 g de pectinasa (Macerozyme R-10 de Rizopus sp, Yakult, 400-800
U/g1) y 0,2 g de celulasa (Celulasa “Onozuka” RS, de Trichoderma viride, 2
U/mg)2. Colocar ambas enzimas en el mismo recipiente.
C. Agregar 10 ml de la solución de sorbitol 0,5 M, pH 6-7 a la mezcla enzimática
inmediatamente antes de usar ya que las enzimas son inestables y pierden
actividad con la temperatura y el tiempo. Concentraciones finales de enzima:
pectinasa 1% y celulasa 2%.
D. Proseguir la técnica de acuerdo al Protocolo para la obtención de protoplastos
que se detalla a continuación:
1) Lavarse las manos. Tomar el material vegetal (una o dos hojas, o bien láminas
de raíces o tubérculos) de las especies de partida y enjuagarlas abundantemente
con agua corriente y luego secarlas. Raspar ligeramente la cara abaxial de las
hojas con aguja, bisturí u hoja de afeitar. Cortar las hojas o láminas en cuadrados
de aproximadamente 1 cm de lado y ubicarlos en la tapa de una caja de Petri en
cantidad suficiente para cubrirla.
2) Agregar 10 ml de la solución enzimática recientemente preparada en la caja de
Petri y con la ayuda de pinzas, poner a flotar los fragmentos de la muestra en la
superficie de la solución enzimática. En el caso de las hojas, ubicar la epidermis
abaxial (inferior) en contacto con la solución digestiva. Los pedacitos del tejido
vegetal pueden superponerse un poco.
3) Sellar la caja de Petri con parafilm o cinta y llevarla a estufa (37 ºC) mantener
con agitación suave durante 30 minutos.
4) Preparar una muestra control con el material vegetal y 10 ml de sorbitol 0,5 M
sin las enzimas.
1 Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de ácido galacturónico a partir de ácido poligalacturónico por min a pH4.0 a 25ºC. 2 Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de glucosa a partidr de carboximetilcelulosa sódica por min a 40ºC, pH 4.5.
5) Realizar observaciones microscópicas de las muestras con y sin digestión
enzimática: tomar un pequeño volumen de la suspensión de la caja de Petri y
colocarla entre porta y cubreobjetos y buscar protoplastos en todos los campos
microscópicos.
6) Para limpiar los protoplastos de restos celulares y de otras impurezas, una vez
obtenidos filtrar el preparado por gasa y centrifugar a baja velocidad (500 – 1000
rpm). Descartar el sobrenadante y resuspender los protoplastos en 2 ml de
sorbitol 0,5 M (sin enzimas). Repetir el lavado 2 veces y resuspender finalmente
en 1 ml de la solución isotónica.
E. Evaluar el rendimiento de protoplastos viables. A un pequeño volumen de la
suspensión agregar gotas de solución acuosa de Rojo Neutro 0,1 %. El rojo
neutro es útil para coloraciones vitales ya que es captado por las células
(específicamente por los lisosomas y endosomas) y solo las células viables son
capaces de retener el colorante. Luego de algunos minutos realizar un recuento
de células viables y no-viables en cámara cuentaglóbulos y calcular el
porcentaje.
F. Realizar cortes a mano alzada del material en estudio y realizar una coloración
diferencial para observar paredes celulares celulósicas y lignificadas con la
coloración doble Safranina-Verde Rápido de la siguiente manera:
1) Tratar los cortes con hipoclorito de sodio al 50 % durante algunos minutos hasta
clarificar y luego lavar 5-6 veces con agua destilada.
2) Pasar los cortes a alcohol 70 %.
3) Colorear con Safranina a saturación en alcohol 80 % durante 10 minutos.
4) Realizar un pasaje rápido por alcohol 96°.
5) Colorear con Verde Rápido a saturación en alcohol 100° (2 cambios).
6) Observar al microscopio las células que presentan distintos tipos de pared
celular, drusas, rafidios, gránulos de almidón, cloroplastos, etc.
LECTINAS
El término lectina se aplica a proteínas o glicoproteínas de origen no inmune
que reconocen de manera específica carbohidratos, aglutinan células o
precipitan glicoconjugados. Las lectinas poseen por lo menos dos sitios de
reconocimiento a carbohidratos, de ahí su capacidad para aglutinar células,
aunque en la actualidad el término lectina se ha aplicado a proteínas con un
solo sitio de reconocimiento a carbohidratos como es el caso de las selectinas.
Las lectinas no poseen actividad enzimática y no son producto de una
respuesta inmune.
Las podemos definir entonces como proteínas o glicoproteínas que tienen la
capacidad de unirse a carbohidratos, y poseen al menos un sitio no catalítico,
que se une reversiblemente a un monosacárido u oligosacárido específico. Lo
importante de destacar de esta definición son las dos características de la
unión lectina- azúcar: la reversibilidad y la especificidad.
Estas proteínas se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza y han
sido identificadas en diversos organismos como virus, bacterias, hongos,
plantas, así como en vertebrados superiores.
Aunque varias de estas proteínas poseen especificidad por estructuras de
azúcares semejantes, presentan actividades biológicas diversas como son: la
aglutinación de glóbulos rojos (GR) de diferentes especies, la estimulación
mitogénica de linfocitos y la inhibición de la fagocitosis. Debido a la capacidad
de estas proteínas de interactuar con células de la respuesta inmune, algunas
lectinas poseen efectos inmunosupresores, otras son tóxicas, inhiben el
crecimiento de células tumorales y participan en la adhesión celular. Todas las
funciones reportadas para las lectinas tienen en común el reconocimiento de un
receptor oligosacarídico (1,2).
Las lectinas vegetales pueden tener diferentes funciones: participan en la
interacción entre las bacterias fijadoras de Nitrógeno con la raíz de las plantas
de Phabaceas (Leguminosas), poseen actividad mitogénica, pueden tener
efectos protectores en contra de la acción patogénica de ciertos
microorganismos como es el caso de los nemátodos herbívoros.
En diversas especies animales se han reportado evidencias de que las lectinas
participan en fenómenos tales como el reconocimiento y la eliminación de
glicoproteínas del sistema circulatorio, así como de células envejecidas, células
tumorales y microorganismos, mediante un proceso de opsonización y la
participación de células con actividad fagocítica.
Las lectinas también participan en procesos de reconocimiento que permiten la
diferenciación celular, la organogénesis, la migración de linfocitos y como
factores determinantes en la metástasis (3,4,5,6).
Estructuralmente existen características comunes entre las lectinas de una
familia determinada, lo que ha permitido el estudio de la interacción de la
lectina- carbohidrato.
Las lectinas vegetales suelen clasificarse de varias maneras, por ejemplo la
especificidad hacia el monosacárido que inhibe su actividad hemoaglutinante y
hacia las estructuras oligosacarídicas que reconocen, clasificándolas en : a)
Lectinas que reconocen N-glicanos, que son oligosacáridos unidos a un residuo
de asparagina en las proteínas mediante una N-acetil- glucosamina y
b) Lectinas que reconocen a los O-glicanos que son oligosacáridos unidos a un
residuo de serina o treonina en las proteínas mediante una N-acetil-
galactosamina.
También se clasificaba a las lectinas vegetales en base a la estructura en tres
tipos de lectinas:
a) Merolectinas: también llamadas hemilectinas o lectinas monovalentes. Son
pequeñas proteínas que presentan un único sitio de unión a carbohidrato.
b) Hololectinas: o lectinas polivalentes. Presentan dos o más sitios de unión a
carbohidatos que pueden ser idénticos u homólogos por lo que se unen a
azúcares estructuralmente similares o idénticos.
c) Quimerolectinas: Son básicamente proteínas de fusión que tienen además
de un sitio de unión al carbohidrato otro sitio que presenta actividad catalítica
que actúa independiente al sitio de unión al carbohidrato.
Actualmente debido a la gran cantidad de datos cristalográficos de lectinas
vegetales, se ha propuesto una nueva clasificación de las mismas en base a
su estructura molecular (7), la cual tiende a reemplazar a la clasificación
basada en la especificidad y en la cual podemos distinguir seis familias de
lectinas:
1. Lectinas aisladas de Fabaceas (Leguminosas). Es la familia de lectinas
vegetales más estudiada. Generalmente se encuentran constituidas por
dos a cuatro subunidades idénticas de 25 a 30 kDa; cada una de las
subunidades tiene un sitio de unión para iones metálicos Ca++, Mn++ y
Mg++. Una subunidad posee aproximadamente 250 aminoácidos y
presenta una gran homología con las otras subunidades. Está
constituida por doce hojas β antiparalelas conectadas entre si mediante
bucles, lo que genera una estructura aplanada en forma de domo, cuatro
bucles localizados en la parte superior del monómero forman el sitio de
reconocimiento a carbohidrato (7).
2. Lectinas con dominios tipo heveína o específicas de quitina. Los
miembros de esta familia generalmente presentan dos subunidades
idénticas, ricas en cisteína contrariamente a las lectinas de
Leguminosas. Una subunidad está constituida por cuatro dominios tipo
heveína, conteniendo cuatro puentes disulfuro, lo cual origina que no
existan estructuras secundarias regulares a excepción de una pequeña
α-hélice de cinco residuos; cada dominio presenta un sitio de
reconocimiento a carbohidrato, que no necesita la presencia de iones
metálicos.
3. Lectinas específicas de manosa aisladas de Monocotiledóneas. A este
grupo de lectinas pertenecen las de orquídeas, ajo y amarilis, con
secuencias de aminoácidos altamente conservadas. Estas lectinas son
tetraméricas, cada monómero tiene un peso molecular dr 12 kDa, así
como una secuencia de 36 aminoácidos repetidas tres veces. El sitio de
reconocimiento a carbohidrato está constituido por cuatro hojas β
antiparalelas unidas entre sí por giros. El conjunto se asocia de manera
que forma una corona aplanada, dejando aparecer un gran túnel central
(7).
4. Lectinas en forma de prisma β o del tipo jacalina. En este grupo se
encuentran lectinas vegetales que presentan estructuras
tridimensionales muy similares a la de Artocarpus integrifolia (jacalina).
Lectinas tetraméricas glicosiladas, donde cada subunidad contiene una
cadena pesada α y una cadena ligera β antiparalelas arregladas a
manera de un prisma triangular (7).
5. Lectinas relacionadas con proteínas inactivadoras de la síntesis proteica.
Estas proteínas forman parte de los venenos mas tóxicos. Su estructura
molecular es compleja. Están constituidas por dos cadenas, la A y la B,
las cuales son diferentes y se encuentran unidas por dos puentes
disulfuro. La cadena A es la responsable de la toxicidad (actividad de N-
glicosidasa sobre el ribosoma que inactiva la traducción), mientras que
la cadena B, posee la actividad de lectina. La cadena B está constituida
por dos dominios que presentan cuatro subunidades, las cuales
contienen α -hélices y hojas β (7).
6. Lectinas tipo amaranto. Dentro de este grupo encontramos lectinas de
distintas especies de amarantos entre las que se destacan Amaranthus
caudatus y Amaranthus leucocarpus. Cada proteína se encuentra
formada por dos monómeros en los que existen dos dominios N y C
,unidos por una pequeña hélice 310 , cada dominio muestra una
conformación de trébol β semejante a la conformación observada en la
cadena B de la lectina de Ricinus communis (7).
AGLUTINACIÓN E INHIBICIÓN DE LA AGLUTINACIÓN
Cuando las lectinas polivalentes se ponen en contacto con un gran número de
células, como por ejemplo glóbulos rojos, linfocitos o fibroblastos, provocan su
aglutinación o agrupación. Esto se debe a que cada molécula de la lectina
puede unirse a los azúcares presentes en la superficie de células distintas
provocando así su acercamiento. En el caso que las células sean glóbulos
rojos ésto se traduce microscópicamente en la formación de glóbulos rojos
aglutinados.
Si a la lectina se le adiciona una cantidad suficiente del azúcar libre y éste es
reconocido específicamente, al agregar los glóbulos rojos no se observará
aglutinación, reacción que se conoce como inhibición de la hemoaglutinación.
ROL FISIOLÓGICO DE LAS LECTINAS
Hay dos hipótesis que intentan explicar el rol que juegan las lectinas en las
plantas:
Como mediadores en el reconocimiento de moléculas involucradas en la
relación simbiótica entre legumbres y bacterias fijadoras de N2 . La
relación entre bacterias del género Rhizobium y las Leguminosas es
altamente específico y las lectinas juegan un papel crucial en esta
relación simbiótica. Son responsables de una interacción específica
bacteria-especie vegetal. Así por ejemplo se ha encontrado que la
lectina de la soja se une solo con especies de Rhizobium que nodulan
con soja y no con otras bacterias que realizan simbiosis con otras
legumbres.
Como mecanismo de defensa contra insectos y microorganismos
patógenos interactuando con glicoconjugados presentes en estos
organismos. Por ej. Las lectinas que se unen a quitina, reconocen un
carbohidrato que es un constituyente de la pared celular de los hongos y
del exoesqueleto de los invertebrados.
Un ejemplo concreto de lectinas que actúan en el mecanismo de defensa de
las plantas son las Rips de tipo II. Estas Rips son capaces de inhibir la síntesis
proteica actuando en forma irreversible, por lo que detienen la actividad de los
ribosomas principalmente en células eucarióticas. La cadena B se une al
receptor de la superficie celular ( un glicoconjugado) provocando así la entrada
de la cadena A. Dentro de la célula la cadena A inactiva catalíticamente los
ribosomas eucarióticos mediante la ruptura de la unión N–glicosidasa de un
residuo de adenosina del rRNA , es decir que actúan anulando la capacidad
de los ribosomas de interactuar con los factores de elongación, lo que detiene
en forma irreversible la elongación del péptido naciente. La acción molecular de
las Rips involucra la subunidad mayor del rRNA.
Los ribosomas bacterianos son insensibles a las Rips de tipo II, además la
presencia de la pared celular en las bacterias impide la interacción de las
lectinas con los glicoconjugados de su membrana y también impide la entrada
de estas proteínas al citoplasma. De modo que el papel de las lectinas en la
defensa de la planta contra agentes bacterianos sería a través de un
mecanismo indirecto basado en interacciones con los carbohidratos de la pared
celular.
En cuanto al papel de las lectinas en la defensa contra insectos se han
propuesto tres mecanismos posibles:
1. la unión de las lectinas específicas para quitina a la quitina del
exoesqueleto de los insectos
2. La unión de las lectinas (de los vegetales que constituyen la dieta del
invertebrado) a los glicoconjugados expuestos de las células epiteliales
del tracto digestivo del mismo con el consiguiente deterioro local o
sistémico.
3. La unión de las lectinas a las enzimas glicosiladas.
OTRAS APLICACIONES DE LAS LECTINAS
Debido a la única propiedad de ser específico para la unión de azúcares y
glicoconjugados las lectinas tienen una amplia aplicación en investigación y
en laboratorios médicos. Ya sea en solución o en forma inmovilizada,
provee un gran uso en la detección o identificación de diversos
glicoconjugados. La identificación de grupo sanguíneo, receptores de
membrana y la detección de células malignas son algunos de los ejemplos
de las aplicaciones de las lectinas.
Las lectinas inmovilizadas en particular, permiten el aislamiento de grandes
cantidades de glicoconjugados específicos de extractos biológicamente
complejos.
Una de las aplicaciones más importantes en investigaciones médicas es
que las lectinas pueden ser usadas para prevenir el rechazo de injerto de
médula de hueso.
También las lectinas de soja pueden usarse para remover las células T
responsables del rechazo a implantes. Este proceso ha sido probado
satisfactoriamente en deficiencias inmunológicas en niños.
Recientemente se ha demostrado la capacidad de la lectina de poroto para
inhibir el crecimiento de tumores.
PARTE PRÁCTICA
1- OBJETIVO
Extraer y purificar parcialmente la lectina que se encuentra en las
semillas de Lens culinaris (lenteja)
Detectar su presencia mediante reacciones de hemoaglutinación.
Determinar la especificidad de azúcares de la lectina utilizando la
reacción de inhibición de hemoaglutinación.
2- PREPARACIÓN DEL EXTRACTO LECTINICO
Se utiliza el método de Tichá y col. Que se describe a continuación.
- Las semillas de lenteja (25 grs) se dejan en remojo con agua toda la
noche en heladera.
- A continuación se elimina el exceso de líquido y se homogeneizan las
semillas en 50 ml de buffer fosfato de sodio 10 mM, pH 7 con NaCl 0,1 M
(PBS) en licuadora durante 3 minutos.
- Se filtra por gasa doble.
- El filtrado obtenido se centrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos en
centrífuga refrigerada.
- El sobrenadante se somete a una precipitación con sulfato de amonio
sólido (previamente pulverizado en mortero) hasta un 50 % de saturación
(35,30 gr de (NH4)SO4 sólido/100 ml de solución) . Con este procedimiento se
logra precipitar las proteínas del extracto. Esto se debe a que el sulfato de
amonio extrae el agua de solvatación de las proteínas, las mismas se vuelven
inestables y precipitan. La operación se realiza en frío agregando la sal de a
poco, con agitación suave.
- Se centrífuga a 10.000 rpm durante 10 minutos.
- El precipitado se resuspende en un pequeño volumen de NaCl 0,9%
(solución que es isotónica con respecto a los GR).
- Se coloca en un tubo de diálisis previamente hidratado y se dializa 2
horas contra NaCl 0,9 % a 4 ºC.
- El extracto dializado se centrífuga nuevamente a 10.000 rpm
durante 10 minutos.
-Purificación de la lectina de Lens culinaris por cromatografía de afinidad.
- El sobrenadante límpido se siembra en una columna de Sephadex G–
150 preequilibrada con NaCl 0,9% (de 2 x 17 cm). Se produce una adsorción
específica de la lectina a la matriz de dextrano que constituye el Sephadex. A
continuación se lava la columna con NaCl 0,9 % para eliminar las proteínas no
adsorbidas y luego se eluye la lectina de la columna con una solución de
glucosa 0,1M en PBS. Se realiza un pool con las fracciones eluídas que
presentan mayor actividad hemoaglutinante.
Por razones de tiempo se trabajará en el práctico con la fracción obtenida luego
de la diálisis, la cual contiene la lectina parcialmente purificada.
3-TITULACIÓN DEL EXTRACTO
Se determinará la capacidad hemoaglutinante de la lectina utilizando glóbulos
rojos humanos de cualquier grupo sanguíneo.
Lavado de los glóbulos rojos: A 0,5 ml de sangre recogida con anticoagulante
se le agrega 4,5 ml de solución de NaCl 0,9 %; se homogeneiza con cuidado,
invirtiendo lentamente el tubo y se centrífuga a 2000 rpm . Se elimina el
sobrenadante con pipeta Pasteur tratando de no resuspender los glóbulos
rojos. Esta operación de lavado se repite hasta obtener un sobrenadante
límpido (por lo general 3 lavados). Finalmente se resuspenden las glóbulos con
4,5 ml de NaCl al 0,9 % con lo cual se obtiene una solución al 4 %. Los
cálculos se realizan teniendo en cuenta análisis hematológicos (hematocrito)
realizados previamente a la sangre a utilizar que indican que:
100 ml de sangre --------------------40 ml de GR
0,5 ml de sangre -------------------X = 0,2 ml de GR
4 ml de GR-------------------- 100 ml de sangre
0,2 ml de GR-----------------X= 5 ml
En una serie de 8 tubos colocar 0,1 ml de NaCl 0,9 % en cada uno. Agregar al
primero 0,1 ml de extracto lectínico. Agitar. Pasar 0,1 ml al segundo tubo,
agitar, tomar 0,1 ml agregar al tercero y así seguir hasta el último del cual se
toma 0,1 ml y se descarta. Se agrega 0,1 ml de PBS y 0,05 ml de la solución
de GR al 4 %.
0,1 ml de NaCl 0,9 % a cada uno de los tubos
0,1ml de extracto al 1º tubo
Exttacto diluido 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64
En otro tubo se coloca
0,1 ml de GR%
0,1 ml de extracto
Control de extracto sin diluir
Se deja a temperatura ambiente durante 30 minutos y se observa si hay
aglutinación.
El Título está dado por la inversa de la máxima dilución del extracto que
presenta hemoaglutinación.
Se define como Unidad Hemoaglutinante (UHA) a la mínima cantidad de lectina
capaz de producir aglutinación observable a simple vista.
4-ESPECIFICIDAD DE AZUCARES
Con diluciones del extracto que contengan 2 UHA observar el efecto de
glucosa, galactosa, fructosa y manosa (0,2 M) sobre la hemoaglutinación.
Se colocan 0,1 ml del extracto, 0,1 ml de la solución de azúcar 0,2M y 0,05 ml
de suspensión de GR al 4%.
Se debe realizar un control del extracto sin azúcar. Dejar 30 minutos a
temperatura ambiente y observar si hay hemoaglutinación.
Deducir la especificidad de azúcar de la lectina en estudio.
Preparar un informe escrito que contenga los resultados e interpretación
del trabajo realizado.
Referencias
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soybean β-amilase reacted with β-maltose and maltal: Active site components
and their apparent roles in catalysis. Biochemistry 33:7779-7787.
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3.Merrit E A, Sarfaty S, Vander Akker F, L´Hoir C, Martial J A, Y Hol W G
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pentasaccharide. Protein Science 3: 166-175.
4. Sharon N (1984). Surface carbohydrates and surface lectin are recognition
determinants in phagocytosis. Immunol Today 5: 1-5.
5. Barondes S H,(1981). Lectins: Their multiple endogenous celular functions.
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7. Mákela O,(1957). Studies on hemmagglutinins of leguminoseae seeds. Ann.
Med. Exp. Fenn supl 11:1-156
POLISACÁRIDOS DE ORIGEN VEGETAL Y DE APLICACIÓN
FARMACÉUTICA
INTRODUCCIÓN
Los hidratos de carbono o glúcidos, junto con los lípidos y las proteínas,
constituyen los compuestos biológicos más importantes de las células, donde
cumplen funciones esenciales. Intervienen en la ganancia de energía y forman
el material de partida para la síntesis de sustancias orgánicas vegetales y
animales.
CLASIFICACIÓN
Estos compuestos pueden clasificarse en:
a) Monosacáridos: también llamados monosas, son las unidades más
simples entre los glúcidos. Poseen entre 3 y 9 átomos de carbono y no
son hidrolizados por acción de ácidos. Generalmente se encuentran
como ésteres fosfóricos y suelen estar combinados entre sí o con otras
sustancias. Al estado libre sólo se encuentran en pequeña proporción.
b) Oligosacáridos: son azúcares formados por 2 o más monosas (hasta
10) unidas covalentemente. Están muy difundidos en la naturaleza y por
hidrólisis ácida o enzimática originan los monosacáridos que los
constituyen.
c) Polisacáridos: son polímeros de 10 o más unidades de monosas, cuyos
grados de polimerización pueden llegar a varios miles, alcanzando así
elevados pesos moleculares. En la naturaleza la mayoría de los hidratos
de carbono se encuentra en forma de polímeros, los cuales
generalmente cumplen funciones estructurales o de reserva energética.
Las monosas que forman el polisacárido se unen por enlaces
glicosídicos o en forma lineal o ramificada, y pueden ser iguales (en
los homopolisacáridos) o distintas (en los heteropolisacáridos). En
cuanto a la nomenclatura de los polisacáridos, aunque algunos son
designados por nombres convencionales (almidón, celulosa, glucógeno),
generalmente se los designa con el nombre del monosacárido que los
forma más el sufijo “an” o “ano” (xilano, galactano, fructano, etc.).
IMPORTANCIA Y USOS
Desde hace algunos años, los carbohidratos son considerados
importantes componentes de mezclas dietéticas, que generalmente consisten
en productos de origen vegetal resistentes a la digestión, como gomas,
mucílagos, pectinas y celulosa. Se considera que estos compuestos derivan de
la condensación de pentosas (pentosanos: (C5H8O4)n) o de hexosas
(hexosanos: (C6H10O6)n), o de una combinación de ambos.
Gomas y mucílagos se diferencian en su comportamiento frente al agua,
mientras las primeras se disuelven completamente, los últimos no lo hacen y
forman masas viscosas en dicho solvente. En los mucílagos predominan xilosa,
arabinosa y ácidos urónicos, como por ejemplo los de corteza de olmo y los de
semillas de lino, que contienen gran cantidad de ácido galacturónico.
Algunos ejemplos de especies que contienen mucílagos se muestran en
la siguiente tabla:
Nombre Vulgar Parte/s usada/s Contenido de
mucílagos (%)
Preparaciones
Llantén mayor Sumidades aéreas 6,5 Infusión
Ispagul Semillas 10-30 Decocción
Zaragatona Semillas 12-15 Decocción
Lino Semillas 10 Decocción
Malva Flores y hojas 15-20 Infusión
Malvavisco Raíz 5-30 Decocción
Varias especies del género Plantago, conocidas vulgarmente como
“llantén”, contienen mucílagos en la epidermis de la testa seminal. Las semillas
maduras y secas de P. psyllum y P. arenaria se conocen en el comercio como
plantago español y plantago francés, respectivamente, mientras que las de P.
ovata, como ispagul o plantago indio.
Por sus propiedades físico-químicas, los mucílagos representan un
grupo de polisacáridos de gran aplicación en al industria farmacéutica. Se usan
como espesantes o viscosantes en la preparación de ciertas formas
farmacéuticas, como comprimidos y cápsulas. Además, se emplean en el
tratamiento de la constipación, patología caracterizada por una alteración
funcional del tracto gastrointestinal, con localización preferencial en el intestino
grueso. Los mucílagos actúan como laxantes mecánicos no irritantes, ya que al
absorber agua, aumentan su volumen en relación a su masa y estimulan así el
peristaltismo y con ello, el reflejo defecatorio. Por lo general se indican en
personas con estreñimiento crónico sin otra patología. Se administran en forma
de cápsulas, polvos o tisanas y generalmente se emplean las semillas enteras,
no trituradas, para evitar la absorción de lineína y de heterósidos
cianogenéticos (sustancias tóxicas).
Entre las Malváceas son frecuentes las especies con un importante
contenido de estos compuestos. Por ejemplo, Althea officinalis, es usada por
sus propiedades demulcentes, emolientes, diuréticas, anti-inflamatorias y
expectorantes. Sus raíces (infusión) son usadas para afecciones del tracto
digestivo, como estomatitis, gastritis, úlcera péptica, colitis, etc., mientras que
sus hojas se usan para los sistemas urinario (cistitis, uretritis y cálculos
urinarios) y pulmonar (bronquitis, catarros). También tienen aplicación externa
como ungüentos para abscesos y úlceras. Los principios activos de A.
officinalis son: en la raíz, mucílago, 18-35 % consistente en diversos
polisacáridos, uno compuesto por L-rammnosa, D-galactosa, ácidos D-
galacturónico y D-glucurónico, en relación 3:2:3:3; otro, un L-arabinofuranano
con elevado grado de ramificación; también existe una unidad estructural
formada por un trisacárido y otra con una elevada proporción de ácidos
urónicos. Además posee un 35 % de pectinas, 1-2 % de asparagina y taninos;
mientras que las hojas poseen mucílago y un D-glucano de bajo peso
molecular. También se encuentran flavonoides y polifenoles.
PARTE PRÁCTICA
1. OBJETIVOS:
Obtener polisacáridos a partir de una muestra de herboristería (Malva).
Hidrolizar el compuesto obtenido.
Identificar los azúcares resultantes de la hidrólisis mediante
cromatografía en papel.
2. OBTENCIÓN DEL POLISACÁRIDO. La extracción se hará en medio acuoso
y en caliente a partir de material fresco, seco o de muestra de herboristería.
Técnica: pesar 5 gramos de la muestra y agregar 50 ml de agua destilada.
Calentar y mantener en ebullición durante 5 minutos. Filtrar por gasa doble,
medir el volumen y agregar dos partes de etanol 96º al filtrado. Dejar reposar
durante 10 a 15 minutos en frío (baño de hielo o heladera) y centrifugar en
centrífuga clínica durante 15 minutos; eliminar el sobrenadante y resuspender
el precipitado de polisacáridos en un pequeño volumen de agua destilada ( 8-
10 ml) y centrifugar durante 15 minutos para luego recuperar el sobrenadante
donde se encuentran disueltos los polisacáridos.
3. HIDRÓLISIS DE ENLACES GLICOSÍDICOS. Los iones hidrógeno (H3O)+ en
concentraciones adecuadas pueden hidrolizar los enlaces glicosídicos de los
polisacáridos y liberar hidratos de carbono de menor peso molecular:
oligosacáridos o monosacáridos.
Técnica: tomar 2 ml del extracto y agregar 2 ml de H2SO4 2 N, colocar en tubo
con tapa y mantener en BM a 100 ºC durante 20 minutos. Centrifugar durante
10 minutos, tomar 2 ml del sobrenadante y neutralizar con CaCO3 sólido (para
calcular la cantidad necesaria, considerar que el PM del CaCO3 es 100,1 g).
Centrifugar en centrífuga clínica durante 10 minutos y reservar el sobrenadante
para dosar e identificar los azúcares liberados.
4.IDENTIFICACIÓN DE AZÚCARES MEDIANTE ANÁLISIS
CROMATOGRÁFICO.
Se emplea una cromatografía descendente en papel.
Soluciones estándar: galactosa, ramnosa, glucosa, ácido galacturónico y
ácido glucurónico, todos en u
Solvente de corrida: Butanol- piridina-agua (6:4:3).
Reactivos de revelado (técnica de Trevelyan y col.):
1- Solución acuosa de AgNO3 al 40 % (solución madre). De esta
solución tomar 1 ml y llevar a 40 ml con acetona (reactivo de
trabajo).
2- Solución acuosa de NaOH 10 N. De esta solución tomar 50 ml y
llevar a 1000 ml con etanol de 96º (NaOH 0,5 N en alcohol).
3- Solución de tiosulfato de sodio, 25 g/litro.
Técnica de siembra y corrida: En un trozo de papel Whatman Nº 4 de
aproximadamente 12 cm de ancho marcar la línea de siembra a 9-10 cm del
borde. En el extremo opuesto cortar el papel en forma de picos para facilitar el
escurrimiento del solvente. Sembrar alícuotas (siembras puntuales) de las
muestras y de las soluciones testigo, teniendo en cuenta que la sensibilidad del
madera saturada con el sistema de solventes elegido y dejar correr durante12-
20 horas.
Técnica de revelado: impregnar el papel por la solución de AgNO3-acetona,
tratando de que el cromatograma se impregne con la solución de plata de
forma pareja, y secar. Realizar un pasaje por la solución alcohólica de NaOH
0,5 N. Si algunas manchas no aparecieran calentar el papel impregnado en la
solución alcalina con vapor de agua. Cuando las manchas son lo
suficientemente visibles, fijarlas mediante un pasaje por la solución de tiosulfato
de sodio y lavar con abundante agua destilada. La sensibilidad del método es
de 2- 20
A fin de conocer el rendimiento de la extracción (gramos de
polisacárido/gramo de tejido) y determinar la cantidad de extracto que se debe
sembrar en los cromatogramas (microlitros) será necesario conocer el
contenido de azúcares totales y de azúcares reductores de las muestras. El
dosaje de azúcares neutros totales se realiza por el Método del Fenol-Acido
Sulfúrico y para los azúcares reductores se empleará el Método de Somogyi-
Nelson
5. MÉTODO DEL FENOL- H2SO4 (AZÚCARES NEUTROS TOTALES)
Fundamento: los ácidos fuertes en caliente deshidratan las monosas,
formando furfural en el caso de las pentosas e hidroximetilfurfural, con las
hexosas. Estos derivados reaccionan con el fenol dando compuestos de color
amarillo-naranja que absorben a 490 nm.
Reactivos: a) Fenol destilado, al 80 % (P/V)
b) Acido sulfúrico concentrado.
c) Glucosa 1 mM, como solución estándar.
Técnica: Cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de glucosa,
entre 0,05 y 0,30 µmoles para realizar la curva estándar y diluciones de las
muestras problema centrifugadas. Completar con agua destilada hasta 0,8 ml y
agregar en el fondo de los tubos 0,04 ml de fenol 80 %, tratando de no
resuspender la gotita de fenol formada. Luego, cuidadosamente agregar 2ml de
H2SO4 concentrado usando una pipeta de escurrimiento rápido e
inmediatamente mezclar en vortex. Llevar a BM hirviente por 20 minutos.
Enfriar y leer a 490 nm. Procesar simultáneamente un Blanco de Reactivos.
Graficar Densidad óptica (DO) en función de µmoles de glucosa y determinar la
concentración de azúcares neutros totales de las muestras problema.
Sensibilidad del Método: hasta 0,3 µmoles de glucosa.
Advertencia: Tanto el reactivo de fenol al 80 % como el ácido sulfúrico
concentrado son reactivos muy cáusticos que producen serias
quemaduras. Por lo tanto evitar el contacto con piel, mucosas y ropa.
Ante accidentes lavar con abundante agua corriente.
6. MÉTODO SOMOGYI-NELSON (AZÚCARES REDUCTORES)
Fundamento: los azúcares con un grupo aldehído o cetona libre son capaces
de reducir los iones Cu++ del Reactivo. alcalino de Somogyi, en iones Cu+, que
al reaccionar con el ácido arseno-molíbdico del Reactivo de Nelson producen
compuestos coloreados que se leen fotocolorimétricamente a 520 nm.
Reactivos: a) Reactivo cúprico de Somogyi. Se prepara mezclando 1 volumen
de la solución A con 9 volúmenes de la solución B:
Solución A: CuSO4.5 H2O al 10 %.
Solución B: Disolver 28 g. de Na2HPO4 anhidro en 700 ml de agua destilada.
Agregar 40 g
de Tartrato de Sodio y Potasio. 4 H2O. Cuando la disolución es completa
agregar 100 ml de
NaOH 1N y 120 g de Na2SO4 anhidro. Llevar a 900 ml con agua destilada y
dejar en reposo
durante 48 horas, filtrar y guardar en frasco color caramelo.
b) Reactivo de Nelson. Disolver 25 gramos de Molibdato de Amonio. 4 H2O en
450 ml de agua destilada, añadir 21 ml de H2SO4 concentrado. Luego de
mezclar con cuidado (reacción exotérmica) y agregar 3 g de Arseniato disódico.
7 H2O. Dejar en reposo durante 48 horas a temperatura ambiente, filtrar y
guardar en frasco color caramelo.
c) Glucosa 1 mM, como solución estándar.
Técnica: Cargar tubos con cantidades crecientes de la solución de glucosa,
entre 0,05 y 0,30
muestras problema centrifugadas. Completar con agua destilada hasta 0,5 ml,
agregar 0,5 ml del Reactivo de Somogyi y calentar en BM hirviente durante 15
minutos. Enfriar, agregar 0,5 ml del Reactivo de Nelson y 1 ml de agua
destilada. Mezclar y leer a 520 nm. Procesar simultáneamente un Blanco de
concentración de azúcares reductores de las muestras problema.
Sensibilidad del Método: 0,05-
METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS MEDICINALES
INTRODUCCION
Tanto en animales como en vegetales, la energía para los procesos
vitales proviene de una cadena de reacciones de oxidaciones y reducciones
(METABOLISMO) en las que las sustancias producidas (METABOLITOS) son
útiles para el crecimiento o reproducción del organismo que lo sintetiza.
En las plantas se puede distinguir dos tipos de metabolismo:
a- Metabolismo primario
b- Metabolismo secundario
El metabolismo primario comprende los procesos que conducen a la
biosíntesis y degradación de metabolitos primarios: hidratos de carbono,
lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Una característica de este metabolismo
es su similitud en todos los organismos aún entre aquellos que
genéticamente se encuentran muy distantes. En conclusión, estos
metabolitos son: a) esenciales o indispensables para el crecimiento y
desarrollo del individuo, b) uniformes, c) universales d) conservativos.
Podemos definir al metabolismo secundario como el nivel funcional del
metabolismo de la planta que no es indispensable para el desarrollo y
crecimiento de las especies pero si lo es para su supervivencia.
A partir del metabolismo secundario se biosintetizan los llamados
metabolitos secundarios los que fueron considerados durante muchos años
productos de desecho resultantes de la degradación metabólica o formado por
subproductos del metabolismo vegetal. El rasgo característico de los
metabolitos secundarios es su gran diversidad estructural y la alta variabilidad
intraespecífica. Unas 150.000 estructuras químicas han sido aisladas e
identificadas en el reino vegetal y cada una tiene un único grupo de
compuestos secundarios. En general, los metabolitos secundarios cumplen
funciones ecológicas en las plantas:
a- los compuestos volátiles de las flores (terpenos) y los pigmentos de
los pétalos (flavonoides) cumplen la función de atraer polinizadores y
aumentar la velocidad de fertilización.
b- Como señales, por ejemplo en la asociación planta-microorganismo.
c- Protección de la planta frente a agentes físicos: UV, desecación,
evaporación, frío, entre otras.
d- Como compuestos de defensa: en este sentido los metabolitos
secundarios pueden sintetizarse en respuesta al ataque microbiano
(como es el caso de la fitoalexinas) o bien actuar como protoxinas y
ser activados por metabolización durante el ataque (ej. glicósidos
cianogenéticos) o como fitoanticipinas mediante el cual se acumulan
en un tejido blanco en elevadas concentraciones (ej. alcaloides).
BIOSÍNTESIS: La biosíntesis ocurre usualmente en un órgano o tejido
específico, y está temporalmente restringido a un determinado período de vida
de la planta. Su síntesis acompañada por traslocación (a corta o larga
distancia) y su almacenamiento están separados espacialmente. La
característica más notable de los metabolitos secundarios es su lenta velocidad
de recambio (lo que lo diferencia de los metabolitos primarios). Esto parece
razonable para aquellos metabolitos que cumplen su función de defensa.
Solamente las plantas y los microoganismos son capaces de sintetizar
biológicamente el núcleo aromático. Los compuestos fenólicos forman un gran
grupo de sustancias cuyo elemento estructural fundamental que los caracteriza
es al menos un anillo aromático sustituido por un grupo OH libre u ocupado por
otra función: éster, éter, glicósidos. Los mismos pueden biosintetizarse por dos
caminos:
1- Vía del ácido shikímico (Figura 1)
2- Vía del acetato-malonato (Figura 2)
O bien por una combinación de ambas:
3- Biogénesis mixta
Esta secuencia metabólica convierte a los metabolitos primarios eritrosa
4-fosfato y fosfoenolpiruvato (PEP) en los aminoácidos aromáticos: fenilalanina,
tirosina y triptofano y los ácidos p-aminobenzoico y p-hidroxibennzoico. Los
compuestos fenilpropanoides derivan principalmente de la fenilalanina o de la
tirosina.
Figura 1: Esquema de la ruta del ácido shikímico
Figura 2: Esquema de la ruta del acetato-malonato
A partir de estos precursores se forman una gran variedad de
metabolitos secundarios los cuales cumplen importantes funciones en la
planta. Debido a su gran variabilidad estructural, han sido aprovechados por
el hombre como, por ejemplo, agentes terapéuticos en distintas afecciones,
en la industria alimenticia, nutracéutica, entre otras. En las últimas décadas
tuvo un gran desarrollo el estudio de los productos naturales, incluyendo
plantas con potencial aplicación medicinal. Sin embargo, la introducción de
fitomedicamentos a la medicina tradicional o convencional requiere
investigación científica acerca de las reales potencialidades terapéuticas de
las mismas. Para ello, se procura aislar el o los compuestos responsables
de dichas actividades para su posterior incorporación en preparados
farmacéuticos. Así por ejemplo se han informado actividades biológicas de
un gran número de metabolitos secundarios derivados de plantas:
actividades antioxidantes, antiinflamatorias, anticarcinogénicas,
antimicrobianas, etc.
En este trabajo práctico vamos a centrar nuestro estudio en cuatro tipos
de compuestos: cumarinas y flavonoides; glicósidos cianogenéticos y
alcaloides.
Cumarinas
Son lactonas derivadas generalmente de los ácidos o-hidroxi-cinámicos
y pueden clasificarse en cumarinas simples (como la umbeliferona) o
condensadas (como las furanocumarinas como el psoraleno y la xantoxina
o piranocumarinas) [Figura 3]. El principal interés farmacéutico de las
cumarinas radica en su capacidad de actuar como tónicos venosos y
agentes vasculares protectores. Es conocido el uso de Melilotus officinalis
en la medicina folklórica para tratar el uso de los desórdenes circulatorios
debido a la presencia del dicumarol. Históricamente, los psoralenos se han
usado, junto con la luz U.V., en el tratamiento de varias enfermedades de la
piel como el vitiligo, la psoriasis y las micosis de piel.
Figura 3: Estructura básica de una cumarina
Flavonoides
Son compuestos cuya biogénesis es mixta ya que en ella intervienen dos
vías diferentes: se produce la condensación del cumaroil coA (VÍA DEL
ACIDO SHIQUIMICO) con tres moléculas del malonilCoA (VIA DE
ACETATO MALONATO) produciendo una chalcona a partir del cual se
forman por distintos caminos el resto de los flavonoides. Químicamente
están formados por dos anillos aromáticos (A y B) unidos por 3 átomos de C
o por un ciclo de 5 o 6 átomos de C y O (anillo C) Figura 4.
Figura 4: Estructura de los flavonoides
Sus funciones biológicas en la planta son muy diversas: protegen a los
vegetales contra la radiación UV, participan en la interacción planta-
bacterias simbióticas, plantas-microorganismos como fitoalexinas, participan
en la reproducción sexual. Las antocianinas son los flavonoides mas
conocidos pues son de los pigmentos hidrosolubles que dan el color
característico a muchas flores (atrae agentes polinizadores e interviene en
la formación del tubo polínico). En cuanto al uso que le da el hombre, las
antocianinas, al igual que otros flavonoides, disminuyen la fragilidad capilar
y aumentan su resistencia, probablemente debido a que actúan evitando la
degradación del colágeno por inhibición enzimática de la elastasa y de la
colagenasa. Por ello, están indicados en diversos trastornos capilares y
venosos. Aditivamente poseen actividad antiinflamatoria, antiagregante
plaquetaria y, al igual que otros compuestos fenólicos, actividad
antioxidante. Además los antocianósidos se emplean en oftalmología en el
tratamiento de trastornos circulatorios a nivel de la retina. En cuanto a los
isoflavonoides en la actualidad están adquiriendo una gran importancia
pues algunos de ellos han mostrado un interesante efecto estrógenico débil
pero relativamente selectivo sobre los receptores β –estrogénicos. Por esto
es indicado en el tratamiento de la sintomatología asociada al climaterio
además de actuar como inhibidores de tirosina-kinasa y por tanto capaces
de reducir la proliferación celular. Es el caso de la genisteína (5,7,4'-
Anillo A
Anillo B
trihidroxi-isoflavona) y daidzeína (7,4'-dihidroxi-isoflavona) presentes en la
soja.
Glicósidos cianogenéticos
Los precursores primarios de estos compuestos son: fenilalanina y
tirosina que derivan de la vía del acido shikímico y luego se glicosilan (con
mono o disacáridos) y se acumulan en vacuolas. Actúan como protoxinas
de defensa: son activadas por acción de una β-glucosidasa cuando el tejido
es dañado, liberando HCN.
Figura 5: Estructura de la oleandrina, glicósido cianogenético
extraído de las Rosáceas.
OBJETIVOS DEL PRACTICO.
1- Conocer y aplicar técnicas de laboratorio tendientes a extraer,
cuantificar, separar e identificar compuestos derivados del
metabolismo secundario.
2- Conocer los principios activos presentes en diferentes plantas
usadas en medicina popular, así como la aplicación de los mismos
en la elaboración de especialidades medicinales.
3- Elaborar hipótesis, planteos experimentales y resolución de
problemas.
PARTE PRÁCTICA
El problema general en el estudio de los productos naturales de plantas
es que su naturaleza y cantidad dependen de varios factores, tales como
estrés, edad de las plantas, condiciones de recolección, secado y
almacenamiento de la misma. En el práctico se utilizarán dos especies de
plantas usada en medicina popular en nuestra región: Zuccagnia punctata ( n.v.
pus pus) y Larrea cuneifolia (n.v. jarilla macho).
1. Extracción de compuestos fenólicos
El material vegetal es sometido a un proceso de secado, el cual puede
realizarse colocando las muestras en un desecador en oscuridad, o bien en
una estufa de aire forzado (50-52 ºC) o por liofilización. Posteriormente el
material vegetal es pulverizado a pequeñas partículas por trituración en
molinillo o bien usando nitrógeno líquido y un mortero. La extracción de los
compuestos fenólicos se realiza mediante solventes apropiados y puede
incrementarse usando un sonicador o agitación en un baño de agua. Este
paso puede repetirse varias veces para facilitar la extracción de los
compuestos fenólicos.
Técnica: 5 g de muestra vegetal se dejan en contacto con 30 ml de etanol
96º durante 2 h, con agitación en baño de agua a 40 ºC. Se filtra por papel
de filtro y se trabaja con el líquido filtrado.
2. Cuantificación de compuestos fenólicos totales
Los extractos se ensayan individualmente para determinar compuestos
fenólicos totales usando la técnica de Singleton et al. (1999). Esta método
se fundamenta en que los compuestos fenólicos reducen al reactivo de
Folin-Ciocalteau (reactivo de tungsteno y molibdato) para formar un
complejo azulado que absorbe a 765 nm.
Técnica:
Reactivos:
a-solución patrón de ácido gálico (0,3 mg/ml) en alcohol 96º (*).
b- solución de Na2CO3 al 15,9 % en agua.
c- reactivo de Folin-Ciocalteau (Merck).
Metodología: se sigue el siguiente protocolo de trabajo:
Nº de
muestra
Muestra
(µl)
Agua
dest.
(ml)
Reactivo
de Folin
(ml)
2
minutos
a temp.
amb.
Na2CO3
15,9 %
(ml)
Calentar
5 min a
50 ºC.
Enfriar
Leer a
765 nm
1 -------- 2 0,2 0,8
2* 10 1,99 0,2 0,8
3* 30 1,97 0,2 0,8
4* 60 1,94 0,2 0,8
5* 90 1,91 0,2 0,8
Extrac.1 50 (dil) 1,95 0,2 0,8
Extrac.
2
50 (dil) 1,95 0,2 0,8
Se grafica la curva estándar* (muestra 2 a 5): Densidad óptica (DO) en función
de los µg de ácido gálico y se calcula en contenido de compuestos fenólicos en
las muestras (extracto 1 y 2) en µg/ml.
3. Identificación de los compuestos fenólicos y otros metabolitos
secundarios
Cumarinas.
Técnica: cromatografía en capa fina (CCF).
Metodología: en una placa de sílica gel G-60 F254 (4 x 7 cm) se siembra
10 µl de cada uno de los extractos y 10 µl de una solución estándar de
cumarina.
Como solución estándar se usará:
a- solución alcohólica de cumarina de 3 mg/ml
b- una solución de cumarina extraída de una especialidad medicinal
(Esberiven Depot®). La gragea se pulveriza en mortero y se añade 5
ml de etanol para extraer el principio activo. Se recupera este
preparado, se centrifuga a 6000 rpm y el sobrenadante obtenido se
utiliza como solución estándar.
Solventes de corrida: cloroformo: acetato de etilo (60:40).
Detección: la identificación se efectúa al UV de onda larga (366 nm, UV
Lamp Model UV 5L-58 Mineralight Lamp) observándose una intensa
fluorescencia azul o verde azulada correspondiente a las cumarinas.
Esta fluorescencia se intensifica al exponer la placa a vapores de
amoníaco o al rociarla con una solución hidroalcohólica de KOH al 5%.
3.2 Flavonoides.
Técnicas: cromatografía en capa fina (CCF) y reacciones de
identificación.
Metodología 1: en una placa de sílica gel G-60 F254 (4 x 7 cm) se
siembra 10 µl del extracto y 10 µl de una solución estándar de rutina.
Como solución estándar se usará:
c- solución alcohólica de rutina de 0,15 mg/ml
d- una solución de flavonoides extraída de una especialidad medicinal
(Daflón®). La gragea se pulveriza en mortero y se añade 5 ml de
etanol para extraer el principio activo (hesperidina). Se recupera este
preparado, se centrifuga a 6000 rpm y el sobrenadante obtenido se
usa como solución estándar.
Solventes de corrida: acetato de etilo:ácido fórmico:ácido acético:agua
(100:11:11:27)
Detección: Los componentes separados son visualizados bajo luz ultravioleta
(254 y 360 nm). Los flavonoides poseen espectros con intensas absorciones en
el espectro ultravioleta, se pueden distinguir dos bandas principales: banda II
(240 – 285 nm.) y la banda I (300 – 550 nm.) Figura 7. Posteriormente, las
placas son asperjadas con reactivos químicos de relevado tales como el
reactivo de productos naturales (NPG, solución metanólica de 2-aminoethyl
diphenylborate al 1%)
254 nm: el estándar rutina fluórese como una mancha azul oscuro.
365 nm: se observa una intensa fluorescencia amarilla, azul o verde
dependiendo de la estructura química del compuesto. Esta fluorescencia
puede ser intensificada por el agregado de reactivos químicos de
revelado como el NP (natural product reagent).
Figura 7: Máximos de absorción en la región del UV de los flavonoides
Como reactivo de revelado también se usa el FeCl3 o AlCl3 al 1% en agua. El
AlCl3 forma quelatos con los grupos hidroxilos adyacentes a los grupos
carbonilos tanto en C5 como C3. El AlCl3 también forma quelatos con grupos
hidroxilos en posición orto, aunque es inestable en medio ácido.
Metodología 2: Las reacciones de coloración pueden usarse también
para evidenciar la presencia de flavonoides, una de las más específicas
es la Reacción de Shinoda, de la que resultan coloraciones
características según el tipo de núcleo de los flavonoides. La técnica
consiste en colocar un volumen determinado del extracto en un tubo de
ensayo. Luego se agregan granallas de Magnesio y gotas de ácido
clorhídrico concentrado. Observar la coloración.
Coloración de los flavonoides frente a la reaccion de Shinoda.
Tipo de
flavonoide
Color de reacción de
Shinoda
Chalconas No hay coloración
Auronas No hay coloración
Isoflavononas No hay coloración
Isoflavonas Amarillo rojizo
Flavanonas Azul magenta, violeta,
rojo.
Flavanonoles Rojo a magenta
Flavonas y
flavonoles
Amarillo a rojo.
Metodología 3: Existen otras técnicas para la identificación de los
flavonoides que no serán utilizadas en este trabajo práctico tales como:
espectrofotometría ultravioleta, espectrofotometría infrarroja,
espectrofotometría de masa, difracción de rayos X y resonancia
magnética nuclear.
3.3. Glicósidos cianogenéticos.
Técnica: El ensayo para detectar en las drogas los heterósidos
cianogenéticos se denomina ensayo de Grignard. Se basa en la
capacidad de los heterósidos cianogenéticos presentes en plantas para
desprender HCN al tomar contacto con agua. Este se combina luego con
picrato de sodio para dar isopurpurato sódico de color rojo ladrillo
(Figura 8).
Figura 8: Estructura del glicósido cianogenético: amigdalina
Metodología: Se coloca el material vegetal (hojas de Manihot flabelifolia,
pepitas de damasco o ciruela) cortado en pequeños trozos en contacto
con un volumen de agua destilada en un erlenmeyer de 250 ml. Se tapa
el erlenmeyer con un tapón de goma del cual se cuelga un trozo de papel
de filtro tratado previamente con una solución saturada de picrato de
sodio. Se macera en un baño termostatizado a 30ºC para producir la
hidrólisis enzimática. El HCN se desprende y reacciona con el picrato de
sodio. El desprendimiento es rápido y tiene lugar en el transcurso de unos
15 minutos. Para dar como negativo el ensayo se esperan 3 horas. El
desprendimiento también se puede producir añadiendo un ácido débil. Se
puede valorar posteriormente el HCN liberado mediante el método de
Liebig-Deniges.
Amigdalina glucosa + ácido cianhídrico + benzaldehído
Figura 9: Esquema del proceso de hidrólisis de la amigdalina.
Bibliografía
1- Singleton, V.; Orthofer, R.; Lamuela-Raventos, R. (1999). Analysis of
total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means
of Folin Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology , 299, 152-178.
2- Dey J, Harborne JB. Methods in Plant Biochemistry. Volume 1 Plant
Phenolics. Academic Press 1989.
3- Wagner H., Bladt S., Zgainsky E.M. Plant Drug Analysis. In A Thin Layer
Chromatography Atlas. Springer. Berlin 1984, pp. 320.
4- Markham, K.R., 1982. Ultraviolet-visible absorption spectroscopy.
Techniques of Flavonoid Identification. Academic Press, New York, pp.
36–51.
5- Krebs K.G., Heusser D. and Wimmer H. Spray Reagents In Layer
Chromatography a Laboratory Handbook. Stahl, E. Eds. Springer-Verlag,
Berlin, 1969, pp 854-905.
ACTIVIDAD DEPURADORA DE RADICALES LIBRES DE EXTRACTOSDE
PLANTAS MEDICINALES
La síntesis química ha sido una fuente importante de sustancias
farmacológicamente activas para la industria farmacéutica. Sin embargo, en los
últimos años también se ha incrementado el uso de productos naturales de
origen vegetal. Esto se debe a que el metabolismo secundario, cuyo proceso
evolutivo empezó hace miles de años, ha sido capaz de generar una
sorprendente diversidad de compuestos químicos. Actualmente se están
desarrollando programas destinados a la búsqueda de principios activos con
actividad antibacteriana, antiinflamatoria, antivirales y antitumorales en plantas
utilizadas tradicionalmente como medicinales o que presentan características
ecológicas determinadas.
Desde hace algunos años, la destrucción del medio ambiente (deterioro de la
capa de ozono, smog, humo de cigarrillos, rayos UV beta, etc.) generan en el
hombre una serie de trastornos agudos y crónicos que provocan un estado de
fatiga, agotamiento y estrés. Una causa de ello es el aumento desmedido de
los llamados "radicales libres".
Radicales libres: un radical libre es una molécula o átomo que posee en su
capa externa un electrón desapareado. Esta condición particular hace que sean
altamente reactivos para con las moléculas vecinas y su vida como tal es muy
corta. Trata de corregir su estado de inestabilidad tomando un electrón del
elemento más cercano.
Los radicales son las denominadas formas activadas del oxígeno (O2) que se
forman a partir de éste, por la ganancia de un electrón. Aunque en sentido
estricto no todas las formas son radicales libres, todas son inestables o tóxicas
(cuadro 1).
Cuadro 1
Fórmula Denominación Estabilidad Radical Libre
O2 Oxígeno Molecular Estable NO
O2– Ion Superóxido Inestable SI
HOOH Peróxido de
Hidrógeno
El menos inestable NO
OH - Radical Oxhidrilo Muy inestable SI
O2· Oxígeno singulete El más inestable SI
Producción en el organismo: los radicales libres se forman por activación del
oxígeno a través de dos caminos:
a) ganancia de energía (raramente).
b) ganancia de un electrón.
En condiciones normales se generan en bajas concentraciones (cuadro 2) en
los sistemas biológicos tales como:
• Respiración mitocondrial: en el proceso de respiración celular.
• Síntesis de prostaglandinas que participan en eventos fisiológicos y
patológicos (inflamación).
• Fagocitosis leucocitaria: los glóbulos blancos utilizan los radicales libres como
mecanismo de defensa. Al englobar gérmenes forman fagosomas con radicales
libres en su interior, destruyendo así al agresor.
• Radiaciones: las radiaciones ionizantes de la luz UV y visible producen
radicales libres por ganancia de energía. Fotoquímicamente los eventos
empiezan por la toma de energía electrónica de un fotón, la cual es suficiente
para romper un enlace covalente. El O2 molecular es el principal compuesto
excitado y produce O2·(oxígeno singulete). Este ataca preferentemente a
aminoácidos y ácidos grasos poliinsaturados (a mayor número de dobles
enlaces mayor suceptibilidad al ataque)
Cuadro 2
Las rutas no-fotoquímicas involucran la interacción del O2 molecular con
radicales libres para producir nuevas especies radicales que contienen O2.
Este tipo de reacciones pueden ocurrir directamente o bien ser promovidas por
enzimas tales como la lipoxigenasa.
En una primera etapa se produce la formación de un radical R* a partir de un
precursor no-radical:
RH → R•
Esta fase se conoce como fase de iniciación de la autoxidación. Este proceso
* es generalmente lento y se denomina también "periodo lag".
Luego sigue una fase de propagación donde hay formación de
radicales peroxi ROO•por reacción del radical formado con el oxígeno
molecular:
R• + •O-O• → ROO•
Estos radicales reaccionan con compuestos orgánicos que contengan H2 (RH).
ROO• + R′H→ROOH + R'•
Finalmente cuando todo el oxígeno o especies hidrogenadas han reaccionado,
la cascada de reacciones llega a su fase de terminación para dar productos
inactivos (no-radicales).
ROO• + R• → ROOR
2ROO•→ ROOR + O2
Mecanismos de defensa: se denominan antioxidantes o captadores de
radicales libres a sustancias capaces de captar y neutralizar de manera
perdurable a los radicales libres y a las diferentes formas activadas del
oxígeno. Más que una sola sustancia son generalmente cadenas de reacciones
o de sistemas antioxidantes destinados a regenerar sus diferentes compuestos.
Existe un sistema antioxidante fisiológico (mecanismo de defensa adaptativo),
constituido por múltiples sistemas enzimáticos acoplados. Estos sistemas
antioxidantes constituyen los antioxidantes endógenos y son
fundamentalmente dos:
(a) Superóxidodismutasa (SOD): son metalo-proteínas intracelulares que
transforman al radical superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno.
2 O2• + 2 H+→H2O2 + O2
El peróxido de hidrógeno es luego removido por
(b) Catalasa (CAT)
2 H2O2→ 2 H2O + O2
(c)o Peroxidasas (principalmente la glutatión peroxidasa GSH-Px) donde el
glutatión pasa a su forma oxidada.
H2O2 + 2 GSH → GS-SG + 2 H2O
La acción de la SOD está acoplada a las de las CAT/GPx para evitar la
acumulación de peróxido. Estos sistemas de defensa se activan
constantemente pues deben neutralizar los radicales libres lo antes posible
para impedir la producción del daño. Existen situaciones en que la producción
de radicales libres está anormalmente aumentada, generándose un proceso
llamado "estrés oxidativo". Este concepto expresa una situación de
desequilibrio entre las velocidades de producción y metabolización de radicales
libres y durante la cual se desbordan las defensas naturales, atacando blancos
tales como:
I. Membranas: las membranas de una célula (membrana externa y membrana
de las organelas) están formadas por una bicapa lipídica con diversos tipos de
proteínas incrustadas en su estructura. Los lípidos de la membrana contienen
ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) que determinan la solidez del conjunto y
es precisamente a ese nivel que las células son vulnerables al ataque de los
radicales libres. Estos al reaccionar con los AGPI, no sólo los oxidan sino que
generan una reacción en cadena (efecto cascada) de autooxidación de unos a
otros que termina finalmente por desestructurar la arquitectura de la membrana
y decreta la muerte celular (fig. 1).
II. Proteínas: las proteínas en sus diversas funciones (receptores,
transportadores, proteínas estructurales, enzimas) pueden ser afectadas,
especialmente aquellas que poseen un grupo sulfhidrilo (SH). También son
afectadas aquellas proteínas de larga duración como el colágeno o la elastina
de la piel.
III. Ácidos nucleicos: el ataque es directamente a nivel cromosómico, con
desnaturalización del ADN. Esto genera graves consecuencias sobre la
transmisión genética y por lo tanto sobre la síntesis proteica.
Todas estas acciones determinan lesiones y se ha adjudicado la acción
deletérea de los radicales libres en numerosos procesos patológicos
(envejecimiento, isquemia celular, procesos inflamatorios agudos y crónicos,
intoxicaciones, ciertos cánceres, etc.).
La producción de radicales libres se incrementa también considerablemente en
procesos infecciosos e inflamatorios, como también en enfermedades
degenerativas del sistema nervioso (mal de Alzheimer, enfermedad de
Parkinson), alteraciones del cristalino (cataratas, presbicia), arteriosclerosis,
adicciones, etc. Todas estas situaciones involucran un estado de estrés
oxidativo que a la vez puede ser causa y/o consecuencia de cada patología en
particular. Es así que el tratamiento combinado con antioxidantes produce
beneficios terapéuticos frente a diversas patologías y constituye una efectiva
modalidad de quimioprevención.
Fig. 1
Si los sistemas endógenos de protección contra los radicales libres son
excedidos en su capacidad, la neutralización de ellos dependerá entonces de
otros compuestos (antioxidantes exógenos) aportados por la dieta. Los más
conocidos son el ácido ascórbico (Vitamina C), α-tocoferol (Vitamina E), β-
carotenos, ubiquinona o coenzima Q, la mayoría de origen vegetal.
Uno de los antioxidantes sintéticos más usados es el Hidroxitoluenobutilado
(BHT) debido a su estabilidad y bajo costo. Sin embargo se han impuesto
restricciones en el uso del mismo debido a que compuestos tóxicos y/o
carcinogénicos se formarían durante su degradación. De allí el interés en el
aislamiento y uso de antioxidantes naturales.
El descubrimiento de que muchos compuestos fenólicos inhiben la oxidación de
lípidos, contribuyó a su aislamiento en plantas y su posterior aplicación
terapéutica. La estructura fenólica parecería ser primordial para dicha actividad;
así flavonoides (quercetina), tocoferoles, catequinas, taninos, ácido
clorogénico pueden actuar como antioxidantes o tener un efecto sinérgico entre
sí.
La vitamina E es sintetizada exclusivamente por el reino vegetal. Se encuentra
bajo la forma de acetato, su forma más activa biológicamente es el a-tocoferol.
Su alta solubilidad en lípidos explica su eficiente acción antioxidante in vivo de
estos compuestos. Estudios recientes demostraron que las vitaminas E y C y
los β-carotenos actúan en conjunto. La primera hipótesis de su mecanismo de
acción sería: la vitamina E reacciona con los radicales libres oxidándose. Los
carotenoides luego activan a la vitamina E oxidada, mientras que la vitamina C
hidro-solubiliza a los radicales libres, los que se eliminan luego por la orina.
Sin embargo, se vio que algunos compuestos que presentan acción
antioxidante, en determinadas condiciones favorecen la formación de un radical
libre, o sea presentan una acción pro-oxidante. Por ejemplo, el ácido
clorogénico y la catequina tienen una probada acción antioxidante en
lipoproteínas de baja densidad (LDL), cuya oxidación es factor importante en la
iniciación y progresión de la arterosclerosis. Cuando estos compuestos se
agregan en la fase de iniciación, inhiben la oxidación de las LDL, pero cuando
se agregan a la fase de propagación, actúan como aceleradores de la
oxidación de las LDL (pro-oxidantes). El mismo fenómeno se observó con el
ácido ascórbico, el cual actúa como antioxidante o pro-oxidante de acuerdo a
su concentración, a la presencia de iones metálicos o la fase de oxidación en la
cual es agregado. De acuerdo a esto, el daño celular dependerá del balance
entre el sistema de defensa antioxidante y el mecanismo pro-oxidante (fig. 2)
Fig. 2
PARTE PRACTICA
1) Reducción del DPPH:
Se usará un método colorimétrico rápido y simple para determinar la actividad
antioxidante de extractos etanólicos de plantas que son utilizadas
tradicionalmente en medicina popular en nuestro país.
El reactivo DPPH (1,1-difenil 2-picrilhidrazil) es un radical libre estable,
presenta un máximo de absorción a 514 nm dando en solución un color
púrpura.
Cuando este reactivo reacciona con un compuesto antioxidante forma DPPH
reducido por donación de un átomo de hidrógeno. En este estado cambia su
absortividad molar, el color vira de púrpura a amarillo en forma proporcional al
número de electrones capturados.
Para el ensayo se utilizará extracto vegetal y sustancias con conocida actividad
depuradora de radicales libres: Hidroxitoluenobutilado (BHT) y quercetina.
Reactivos:
* DPPH (300 µM) en etanol de 96° (3 mg en 25 ml de etanol)
* Extracto vegetal: 2,5 gr de muestra vegetal (Larrea divaricata) se deja en
contacto con 25 ml de etanol de 96° durante 2 horas, con agitación en baño de
agua a 40° C. Se filtra por papel de filtro.
* BHT:
* Quercetina: mg/ml
Procedimiento:
Blanco: 2 ml de etanol
Control: 1,5 ml de etanol + 0,5 mi de DPPH
Ensayos: 0,5 mi de DPPH + diferentes volúmenes de las sustancias a ensayar.
Completar a 2 ml con etanol.
Dejar a temperatura ambiente durante 20 minutos y leer a 514 nm llevando a
cero con alcohol. La reducción del DPPH se evalúa por comparación con un
control y los resultados se expresan en relación a dicho control.
2) Test de blanqueo del β-caroteno:
Reactivos
β-caroteno 0,2 mg/ml de cloroformo
Acidolinoleico
Tween20
Extractos alcohólicos de plantas medicinales
Mezcla de incubación: A 1 ml de 6 caroteno se le agrega 0,02 mi de ácido
linoleico, 0,2 mi de Tween 20 y 0,2 mi de extracto etanólico o etanol (control).
Mezclar y evaporar a sequedad. Agregar 25 ml de agua oxigenada de 20
volúmenes. Calentar a 50° C durante 30-60 minutos. A intervalos de 10 minutos
se lee densidad óptica a 470 nm usando agua destilada como blanco. Se
calcula actividad antioxidante como % de inhibición relativa.
LABORATORIO
Muestra ensayada:
Extracto (μl)
μg de
compuestos
fenólicos
DO 514
%
Actividadresidua
l
% Actividad
antioxidante
Control 100 0
25
50
75
100
150
a) Graficar DO 514 en función de μg de compuestos fenólicos c) Determinar y graficar Actividad Residual y Porcentaje de Actividad Antioxidante en función de μg de compuestos fenólicos. REFERENCIAS
EFECTO ANTIMICROBIANO DE EXTRACTOS DE PLANTAS MEDICINALES
1. Introducción
Las plantas deben sobrevivir al ataque de un gran número de
microorganismos, particularmente bacterias y hongos, y además, como están
fijas al sustrato terrestre del que deben extraer diversos nutrientes (H2O, sales,
compuestos nitrogenados, etc.), forzosamente están en la mutua competencia
por su alimento.
Las plantas superiores, tal como hoy las conocemos, son la resultante
de una coevolución con todas las formas vivas: bacterias, hongos animales
herbívoros y con las plantas inferiores. Esta coevolución se remonta a la
diferenciación biológica entre animales y vegetales, y llevó a la creación de
diversos mecanismos de interacción entre todas las formas vivas. Solo tendían
a sobrevivir aquellas formas vegetales que presentaban características
morfológicas o químicas favorables (espinas, mejores cutículas aislantes, mal
gusto o toxicidad).
Para defenderse del efecto nocivo de otros vegetales, las plantas
superiores son capaces de producir sustancias químicas denominadas
alelopáticas.
Por otra parte, como respuesta al ataque de microorganismos, también
producen y acumulan sustancias conocidas como fitoalexinas.
La existencia de una respuesta por el huésped frente a la invasión por
un microorganismo implica el reconocimiento de la presencia del parásito por la
planta huésped, es decir, que la planta debe poseer un sistema de alarma que
ponga en marcha sus mecanismos defensivos. Esta alarma puede ser química
y/o eléctrica. Las alarmas químicas han recibido el nombre genérico de
elicitores, los que se definen como sustancias que provocan la síntesis y
acumulación de fitoalexinas en el organismo del huésped. Sin embargo, la
biosíntesis de fitoalexinas no es solo provocada por factores biológicos, sino
que también puede ser estimulada por factores tales como heridas,
intoxicaciones, irradiaciones, etc.
Este mecanismo de las plantas, de elaborar productos químicos para
defenderse de sus predadores fue aprovechado por el hombre quien comenzó
a ensayar el efecto de extractos vegetales sobre diversos microorganismos en
la búsqueda de compuestos con actividad antimicrobiana.
La búsqueda de sustancias con actividad antimicrobiana selectiva, y que
además carezcan de efectos tóxicos sobre los animales y vegetales, es un
tópico importante en las investigaciones realizadas sobre productos naturales.
La respuesta de los microorganismos a los productos naturales es muy
heterogénea, debido a la fuerte dependencia de los métodos aplicados y de las
especies microbianas a evaluar. Un ensayo antimicrobiano estandarizado debe
cumplir con diversas condiciones (Dey & Harborne, 1991):
1- La sustancia a evaluar debe ponerse en contacto con la membrana celular
o pared celular del microorganismo seleccionado para la prueba.
2- Deben existir parámetros de fácil medición que provean evidencia
cuantitativa del crecimiento del microorganismo utilizado.
3- La elección de los microorganismos depende principalmente del propósito
de la investigación. Para propósitos generales se deben seleccionar los
microorganismos más representativos de los principales grupos de
patógenos, teniendo en cuenta también sus patrones de resistencia.
4- Las sustancias a evaluar se deben disolver y diluir en solventes puros o
mezclas de ellos. Estos solventes deben ser inocuos para el crecimiento
microbiano,
5- Las mezclas cuyos componentes posean solubilidad diferencial en agua,
deben ser ensayados en un sistema de solventes que asegure un contacto
apropiado entre el organismo a evaluar y el producto bioactivo. Esto se
suele aplicar en muestras con aceites esenciales, cuya solubilidad en agua
suele ser baja.
Los ensayos para determinar actividad antimicrobiana de productos naturales
pueden ser técnicas de difusión y de dilución.
2. Consideraciones generales
2.1. Conservación de los microorganismos: los microorganismos son
preservados por crecimiento continuo o por enfriamiento. El crecimiento
continuo se realiza en medio nutritivo agarizado, y los microorganismos así
crecidos se conservan a bajas temperaturas para disminuir los intervalos entre
subcultivos. Por enfriamiento, las bacterias son conservadas a -20°C (o -70°C)
usualmente en medio BHI (brain-heart infusion, infusión de cerebro y corazón)
semisólido (por agregado de agar al 1,5 % m/v), adicionado con glicerol al 1,5
% v/v como crioprotector. También existen bacterias que se conservan a
temperatura ambiente en agua como es el caso de la cepa gran negativa
Pseudomonas aeruginosa.
2.2. Activación del crecimiento: las bacterias conservadas en medio BHI
semisólido se incuban a 37°C durante 2 hs y luego son sembradas por
estriación (Fig. 1) en un medio nutritivo, como agar Mueller Hinton (MH) para
obtener colonias individuales. Se incuban las placas (invertidas para evitar la
contaminación por agua de condensación) a 37 °C durante 20-24 hs, y tras
este período se observa el crecimiento bacteriano. Los inóculos a emplear en
los ensayos se preparan a partir de éstas bacterias, pues se considera que
están en fase logarítmica de crecimiento, etapa en la que el cultivo es más
homogéneo.
Figura 1: Esquema de la siembra por estriación de bacterias
3. Métodos de difusión
3.1. Ensayo de difusión en pocillos: en esta técnica se prepara un medio
nutritivo agarizado en caja de Petri, se deja solidificar y se
practican perforaciones (pocillos) con la ayuda de un sacabocados estéril.
Se prepara una suspensión bacteriana (de concentración definida), y se
siembra en la superficie del medio solidificado. Se coloca en los pocillos
diferentes diluciones de la sustancia a evaluar o diferentes sustancias a
igual concentración, y se deja que los compuestos difundan en el
medio, esta difusión dependerá de la solubilidad de las sustancias
constituyentes y sus tamaños. Luego de la incubación, los organismos
sensibles a la muestra
ensayada no crecen alrededor de los discos, observándose áreas llamadas
“halos de inhibición”. Esta técnica provee una medida relativa de la actividad
antimicrobiana, ya que sus resultados son cualitativos o semicuantitativos,
además estos resultados se ven afectados por varios factores, como la
capacidad de difusión de la muestra en el medio o el espesor de la capa de
medio de cultivo. Sin embargo, tiene la ventaja de ser un ensayo fácil de
realizar, de bajo costo y que no consume mucha cantidad de muestra. Se
puede utilizar como ensayo preliminar para evaluar la actividad antimicrobiana
de una (o varias) sustancias o extractos (Fig. 2).
Figura 2: Esquema de una prueba de difusión en agar (izquierda). Esquema de
la forma de medir los halos de inhibición (derecha).
3.2. Ensayo de difusión con discos: esta técnica es similar a la anterior, pero
en lugar de practicar perforaciones en el medio de cultivo, se aplican discos de
papel de filtro impregnados con la sustancia a evaluar, y se deja que ésta
difunda. Los resultados se observan midiendo los halos de inhibición.
3.3. Ensayo Bioautográfico: permite la identificación in situ de la actividad
antimicrobiana del o de los compuestos separados por Cromatografía en Capa
Fina (CCF). Primero los componentes de una muestra son separados mediante
CCF y luego de evaporar la fase móvil, la placa cromatográfica es puesta en
contacto con el medio de cultivo semiblando inoculado con una cepa
bacteriana. Los compuestos antimicrobianos son identificados como “zonas de
inhibición” del crecimiento bacteriano, las cuales pueden ser puestas en
evidencia atomizando la placa con un indicador coloreado (Homans & Fuchs,
1970). Se pueden emplear sustancias redox como indicadoras del crecimiento,
tales como las sales de tetrazolio (amarilla), que por acción de las
deshidrogenasas de las bacterias vivas, se transforma en formazán (azul). Las
zonas de inhibición del crecimiento se observan como zonas de color amarillo
pálido en contraste con un fondo color azul (Fig. 3). Los valores de Rf de las
áreas de inhibición (amarillas) son comparados con los valores de Rf de las
correspondientes bandas en placas de CCF reveladas con otros reactivos. La
sal de tetrazolio más utilizada para este ensayo es el MTT [bromuro de 3-(4, 5-
dimetiltiazol-2-il)-2, 5- difeniltetrazolio]. Este método es muy usado para la
purificación de sustancias guiada por actividad biológica (Zampini et al., 2009).
Figura 3: A) Cromatografía en capa fina de extractos vegetales revelada con
Vainillin/H2SO4 (revelado para terpenoides). Fase móvil: acetato de etilo/ácido
fórmico/ácido acético/agua (100:11:11:27). Se indican los valores de Rf. B)
Bioautografía, las zonas claras representan compuestos con actividad
antimicrobiana sobre la cepa Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Métodos de dilución
4.1. Dilución en agar (macrodilución): en este ensayo se preparan varias
cajas de Petri con el compuesto o extracto a evaluar diluido en un medio
nutritivo (como agar MH) en diferentes concentraciones. De este modo queda
el extracto a evaluar incorporado a la matríz del medio de cultivo. Sobre el
medio solidificado se inocula de forma puntual diferentes cepas bacterianas
(Fig. 4). Luego se incuban las placas a 37°C 20-24 hs, pasado este tiempo se
evalúa el crecimiento microbiano (CLSI, 2006). Las ventajas de este ensayo
radican en la posibilidad de obtener datos cuantitativos de la actividad
antimicrobiana, como la concentración inhibitoria mínima (CIM) para varias
especies bacterianas de forma simultánea. La CIM es la mínima
concentración de extracto (o sustancia) a la cual no se observa
crecimiento bacteriano. Algunas desventajas de este método son la alta
cantidad de extracto que se requiere, por lo que no se suele aplicar en las
etapas de purificación de los compuestos, y la gran cantidad de material
requerido para el ensayo. Este ensayo se suele emplear para evaluar la
actividad antimicrobiana de un mismo extracto sobre diferentes cepas
bacteriana.
Figura 4: Método de macrodilución en medio sólido de un extracto de Ligaria
cuneifolia. En el control se observan las zonas de crecimiento de 26 cepas
ensayadas. Al aumentar la concentración del extracto a ensayar se incrementa
la sensibilidad microbiana (10 cepas son sensibles a una concentración de 2
mg/mL, mientras que 20 cepas son sensibles a una concentración es de
12mg/ml)
4.2. Dilución en caldo (microdilución): En esta técnica se preparan
diluciones seriales de un compuesto (o extracto vegetal) en los pocillos de
policubetas de poliestireno de 96 perforaciones (Fig. 5). Las suspensiones
bacterianas se preparan en caldo nutritivo, como por ejemplo caldo MH, y se
agregan a los pocillos que contienen las sustancias a evaluar. Se encuban las
policubetas cerradas a 37°C durante 20-24 hs. Tras la incubación se evalúa el
crecimiento bacteriano y se determina los valores de CIM (CLSI. 2006). Se
puede emplear un indicador de crecimiento, como el MTT (usado en los
ensayos bioautográficos descripto previamente) o Alamar BlueR, cuyo
fundamento es que en ausencia de actividad metabólica microbiana, toma color
azul, y cambia a color rojo por efecto de la actividad metabólica microbiana.
Este método presenta varias ventajas, entre ellas, la velocidad de realización,
bajo coste, bajas cantidades de muestra requeridas, exactitud y
reproducibilidad en los resultados obtenidos. Además, el ensayo de
microdilución brinda la posibilidad de obtener la concentración bactericida
mínima (CBM), mediante un posterior cultivo en medio nutritivo agarizado, de
alícuotas tomadas de los pocillos de las policubetas donde no se observa
crecimiento. La CBM es la concentración necesaria para producir la muerte del
99,9% de un inóculo original en un determinado período de tiempo.
Figura 5: Esquema de siembra en policubeta de 96 pocillos. CE: control de
esterilidad del medio de cultivo. CC: control de crecimiento. Desde la columna 4
a la 12 se preparan concentraciones crecientes del extracto
5. Parte Práctica
Objetivo
Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos vegetales preparados a
partir de partes aéreas de Larrea divaricata y Zuccagnia punctata sobre cepas
bacterianas patógenas Gram negativas (Escherichia coli ATCC 25922) y Gram
positivas (Staphylococcus aureus ATCC 25923) mediante la técnica de difusión
en agar con pocillos (ver apartado 3.1.). Las cepas se adquieren
comercialmente de la ATCC (American Type Culture Collection).
Materiales y Métodos
-Preparación del extracto vegetal: preparar un extracto alcohólico mediante
el método de maceración, y uno acuoso por decocción a partir de las plantas
seleccionadas para ensayar su efecto sobre bacterias patógenas humanas.
Previo a ser utilizada, la decocción debe centrifugarse a 6000 rpm durante 5
minutos, para separar residuos poco solubles, y esterilizarse por filtración (con
una jeringa de 10 mL se hace pasar la decocción a través de un soporte que
contiene una membrana estéril de 0,22 µm, que retiene las células bacterianas
que podrían hallarse en el extracto como contaminantes; el líquido filtrado se
recolecta en tubos estériles). El extracto alcohólico o tintura no requiere
esterilización puesto que el solvente en este caso impide el crecimiento
microbiano.
-Medio de cultivo: se empleará el medio de cultivo Mueller Hinton agar
(Britania), éste es un medio recomendado universalmente para la prueba de
sensibilidad a los antimicrobianos y para el aislamiento y cultivo de
microorganismos exigentes en requerimientos nutricionales. Es un medio muy
completo, que no contiene componentes termolábiles por lo que puede ser
esterilizado mediante autoclavado. Posee una gran estabilidad en el pH y
composición.
Composición del medio MH agar en g/L
Infusión de carne---------------------------------------300,0 g
Peptona ácida de caseína------------------------------17,5 g
Almidón-------------------------------------------------1,5 g
Agar------------------------------------------------------15,0 g
pH del medio: 7,3±0,1
Preparación: suspender 3,7 g del polvo en 100 ml de H2O destilada; dejar
embeber 10 a 15 minutos. Calentar con agitación frecuente y hervir durante un
minuto. Repartir en tubos de ensayo (10 mL/tubo). Esterilizar en autoclave a 1
atmósfera de presión durante 20 minutos. Luego distribuir en cajas de Petri
estériles (20 mlL por caja).
-Otros materiales: esterilizar en autoclave sacabocados de 7 mm de diámetro,
tubos con solución fisiológica, tubos vacíos, frascos con hisopos, frascos con
tips para micropipetas, filtros de 0,22 µm (colocados en una caja de Petri).
Esterilizar en estufa a 180°C 4 cajas de Petri de vidrio. Preparar solución de
etanol 70% v/v (para limpiar y desinfectar el área de trabajo) y solución de
hipoclorito de sodio al 10 % (para decontaminar todo el material con restos
patogénicos).
-Preparación del inóculo: se prepara una suspensión bacteriana a partir de
un cultivo de microorganismos en fase logarítmica. Se toman 4 o 5 colonias y
se suspenden en 2 mL de solución fisiológica estéril. Luego se ajusta el
inóculo, usando un espectrofotómetro, hasta una densidad óptica de 0,08 a 0,1
determinada a una longitud de onda de 625 nm. Esta turbidez equivale al 0,5
de la escala de Mac Farland (escala turbidimétrica que relaciona la turbidez de
una suspensión con la concentración microbiana). Una turbidez equivalente al
0.5 de Mc Farland representa aproximadamente 108 UFC/mL (unidades
formadoras de colonias/mL) para bacterias de rápido crecimiento (Andrews,
2005). La estandarización de inóculo es esencial, ya que el tamaño de la zona
de inhibición es muy dependiente de la densidad del inóculo utilizado. Las
suspensiones ajustadas deben utilizarse en un lapso de tiempo de no más de
15 minutos después de ajustar la turbidez de la suspensión del inóculo
-Prueba de inhibición:
-Fundir el medio de cultivo estéril contenido en los tubos, agregarlos en las
cajas de Petri estériles y dejar solidificar durante 15 minutos.
-Una vez solidificado el medio de cultivo, realizar 4 perforaciones equidistantes
con el sacabocados estéril.
- Sumergir un hisopo estéril en la suspensión bacteriana ajustada. El hisopo
debe ser rotado varias veces y presionado firmemente contra la pared interna
del tubo sobre el nivel de líquido. Esto remueve el exceso de inóculo.
-Inocular la superficie de una placa de agar Mueller -Hinton por rayado con el
hisopo sobre toda la superficie. Este procedimiento es repetido rayando dos o
más veces, rotando la placa aproximadamente 60º cada vez para asegurar una
distribución uniforme del inóculo. Una vez finalizada la inoculación, el hisopo se
descarta en solución de hipoclorito de sodio al 10%.
-Colocar en cada perforación 30 µL de distintas diluciones del extracto (20, 40 y
80 µg de compuestos fenólicos), y en un pocillo colocar igual volumen de agua
destilada estéril o alcohol como control negativo, si el extracto ensayado es
acuoso o alcohólico, respectivamente.
–Incubar las placas en estufa a 37 °C durante 20-24 hs
RESULTADOS
-Observar y medir los halos de inhibición en tres direcciones (como se indica en
Fig.3) y calcular el promedio.
-Registrar los datos en la siguiente tabla.
-Graficar diámetro del halo de inhibición (mm) en función de la cantidad de
extracto vegetal sembrado (µg de compuestos fenólicos).
-Analizar los resultados obtenidos.
MICROORGANISMO: EXTRACTO VEGETAL:
Bibliografía
- Andrews, JM (2005). BSAC standardized disc susceptibility testing method (versión
4). Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56, 60-76.
-Zampini, IC, Isla, MI., Schmeda-Hirschmann, G. (2009) Antimicrobial and antioxidant
compound from the infusion and polar extract of Baccharis incarum (wedd.) Perkins.
Journal of the Chilean Chemical Society 54 (4): 289-293
-Dey, PM, Harborne, JB (1991). En: Methods in Plant Biochemistry. Volume 6: Assays
for Bioactivity. (Hostettmann, K Ed). Academic Press Limited, London.
-Homans, AI, Fuchs A (1970). Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a
methods for detecting fungitoxic substances. Journal of Chromatography, 51, 327-329.
-Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). (2006). Methods for dilution
antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; Approved Standard-
Seventh Edition document M7-A7.
µg de compuestos
fenólicos
Promedio del
diámetro del
halo (mm)
% de
crecimiento
% de
inhibición
0 (control negativo)
0 100 0
BIOENSAYO DE GENOTOXICIDAD DE EXTRACTOS VEGETALES
INTRODUCCIÓN
Los bioensayos de toxicidad son una herramienta intensamente utilizada en
países desarrollados con el objeto de evaluar en forma efectiva y eficiente los
efectos tóxicos agudos y crónicos de la contaminación en los organismos vivos.
Se conocen más de 200 bioensayos de corta duración que permiten detectar
los efectos genotóxicos y potencial mutagenicidad de contaminantes
ambientales u otros agentes.
En las últimas décadas los efectos mutagénicos han sido evaluados utilizando
plantas superiores y sistemas microbiológicos.
Dentro de los bioensayos mas utilizados para el estudio de mutaciòn génica y
aberraciones cromosómicas podemos citar: Test de aberraciones
cromosómicas en raíces de Allium cepa/Vicia faba, Test de mutación de pelos
estaminales de Tradescantia paludosa, mutación de micronúcleos de
Tradescantia y el Test de mutación embrional de Arabidopsis thaliana.
Entre los microorganismos más empleados para evaluar estos procesos se
encuentran, cepas de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y Salmonella
typhimurium que producen cambios en la mitosis, en la conversión genética, en
el crossing over etc. El contenido de DNA de los procariotas no está protegido
como el de los eucariotas, de allí que los ensayos con plantas superiores que
son sistemas eucarióticos tienen estrecha relación con sistemas eucarióticos
animales y humanos. Las plantas tienen una activación metabólica, semejante
a animales y una capacidad de reparar su DNA ante alteraciones genéticas por
mecanismos similares a los humanos. En las raíces de plantas se producen
varios tipos de aberraciones tales como células binucleadas, metafases
arrestadas, aglutinación de cromosomas, células poliploides, cromosomas
fragmentados, etc.
Las principales ventajas de estos bioensayos con plantas son simplicidad en el
manejo de las técnicas, realizables en cortos períodos de tiempo, rápidos
resultados, bajo costo y alta sensibilidad. No se requieren condiciones estériles
para realizar estos test, como en los estudios microbiológicos, la mayoría se
realiza en condiciones in vivo los cuales dan una respuesta real de la vida. Se
puede hacer un relevamiento a gran escala de muchos agentes en el menor
tiempo posible. Además las plantas pueden manifestar los efectos genotóxicos
causados por sobredosis y daños fisiológicos visibles. Estos parámetros
secundarios pueden ser usados para determinar la dosis apropiada para
mutágenos y antimutágenos usados en experimentación.
ACIDOS NUCLEICOS: DIVISION CELULAR
Los ácidos nucleicos, son las “macromoléculas informativas de la célula viva”
conocidos como DNA y RNA, los cuales son polinucléotidos cuyas moléculas
equivalen a secuencias lineales de nucleótidos. En todos los organismos
celulares, tanto procariotas como eucariotas, el DNA sirve para almacenar y
multiplicar (replicar) la información hereditaria; el RNA, en cambio sirve para
realizarla. El proceso vital de multiplicación y reproducción lo cumple el DNA
(función autocatalítica: produce síntesis de más moléculas de DNA sólo él
puede replicarse a excepción del RNA de virus y viroides)) al mismo tiempo
organiza las secuencias de los RNA y, a través de ellos las secuencias de
aminoácidos de las moléculas proteicas. Mediante esta función heterocatalítica
el DNA puede manifestar la información genética, y los factores hereditarios
(genes o genotipo) se hacen visibles en forma de fenes o fenotipo (caracteres
externos del organismo).
Los ácidos nucleicos están contenidos en el núcleo celular en forma de
cromatina, sustancia fundamental que constituye la base física de la herencia.
El núcleo por lo general es esférico y lenticular, se encuentra incluido dentro de
la masa citoplasmática y está limitado por una doble membrana llamada
carioteca, además puede contener 2 o más cuerpos esféricos, refringentes
denominados nucleolos, ricos en RNA, donde se forman las sustancias
precursoras de los ribosomas que luego son expulsadas del núcleo. El nucleolo
suele desaparecer durante las primeras etapas de la división celular para
reaparecer en las etapas finales de la misma. El núcleo controla todo el
citoplasma ya que posee las instrucciones para la formación de proteínas, es
decir los materiales de los que dependen todas las estructuras y funciones
celulares. Cuando se produce la división o multiplicación celular estas
instrucciones deben replicarse y cada una de las células hijas recibe un
duplicado que se logra por la cariocinesis o división mitótica del núcleo.
La división celular es el fenómeno mediante el cual los organismos aumentan
el número de las células somáticas, o bien dan origen a las células sexuales o
gametas. En la mayoría de los organismos todo el proceso de división y
reproducción celular se conoce con el nombre de ciclo celular (Figura 1). Este
ciclo celular se compone fundamentalmente de tres procesos. El primero de
ellos conocido como interfase está relacionado con la replicación del DNA y
las proteínas que conforman los cromosomas. El segundo proceso la mitosis
(Figuras A-I) o división nuclear, en la que de un núcleo se originan dos núcleos
hijos con la misma herencia, es decir que las dos dotaciones cromosómicas
con ayuda del huso mitótico se distribuyen exactamente igual entre los dos
núcleos hijos resultantes. El tercero, la citocinesis o división citoplasmática
comprende la división de las células de tal modo que cada mitad reciba un
núcleo y la mitad del citoplasma. La mitosis va unida frecuentemente a la
citocinesis pero no siempre.
ESQUEMA CICLO CELULAR
Figura 1
Interfase: primera fase del ciclo celular necesaria en la preparación para la
mitosis, es la verdadera fase de trabajo de la cromatina. Es el período en el
cual la cromatina celular se duplica y el material genético se replica fielmente.
Dura más que toda la mitosis. Gracias a investigaciones con isótopos se ha
sabido que la replicación del DNA cromosómico se produce en un período
intermedio de la interfase. A este período se le llama fase S (de síntesis de
ADN), además durante toda la interfase se forman RNA y proteínas, tanto
histonas como no histonas, previo a la fase S se encuentra la fase G1 (período
de crecimiento celular previo a la replicación de ADN) y una fase G2 (período de
crecimiento posterior a la replicación de ADN y preparación para la mitosis por
tanto la interfase es un período de síntesis y crecimiento. Existe una fase G0
donde el ciclo celular se detiene en la fase mitótica la célula no se divide y se
produce la diferenciación que dará lugar a una célula hística o madura.
Mitosis: segunda fase del ciclo celular en la cual se produce la división nuclear,
los dos núcleos hijos contienen el mismo número y tipo de cromosomas.
Para simplificar la descripción del proceso de la mitosis se la ha dividido en
cuatro fases: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. (Figura 1).
En las células de los meristemas el ciclo celular es permanente, se encuentran
en activa división mitótica y persisten en el cuerpo de las plantas desarrolladas.
Por lo general poseen paredes delgadas, protoplasma denso, vacuolas
pequeñas y núcleo grande. La mitosis se detiene cuando pasa a la etapa de
diferenciación o de células hísticas. Teniendo en cuenta las características
histológicas del meristema, en el práctico, se determinará la actividad
genotóxica de extractos vegetales sobre las raíces de Allium cepa.
A. Interfase Hacia el final de la interfase, la
cromatina (que ya se a
duplicado) se condensa
formando cromosomas.
B-C-D. Profase
Comienza la mitosis. Los
cromosomas son claramente
distinguibles bajo el microscopio
óptico. Son de Naturaleza doble.
Se comienzan a formar los
microtúbulos del huso mitótico. La
membrana nuclear se colapsa
totalmente. El nucleolo
desaparece.
E. Metafase temprana
El centrómero de cada
cromosoma se adhiere a los
microtúbulos del huso en
formación. Cada cromosoma es
conducido hacia el ecuador celular por los microtúbulos.
F. Metafase Tardía
Se han completado en este
momento las fibras del aparato
del huso. Los microtúbulos mas
cortos se adhieren en el
centrómero para conectar cada
cromátida con un polo. Otros
microtúbulos corren de un polo
al otro.
G. Anafase
Cada centrómero se
divide, lo cual permite la
separación de las
cromátidas hermanas. Los
microtúbulos del aparato
del huso guían a las dos
cromátidas de cada cromosoma hacia los
polos.
H. Telofase Temprana
Se comienzan a condensar vesículas
en la nueva placa celular.
Comienzan a formarse también las
nuevas membranas celulares cuando
los cromosomas llegan a los polos.
I. Telofase tardía
La nueva membrana nuclear ya está
completa y la cromatina de los
cromosomas se despliega. También se
termina la nueva pared celular entre las
dos células recién formadas.
Test de aberraciones cromosómicas de Allium cepa
Es un bioensayo de toxicidad aguda (72 hs) semiestático. El bulbo de Allium
cepa posee el tallo reducido a un órgano cónico, pequeño, llamado disco
caulinar, cubierto por catáfilas nutricias reservantes y por catáfilas externas de
protección a partir del cual se originan raíces adventicias. Cuando los bulbos
son rehidratados se activa la brotación y se estimula el crecimiento de la planta
iniciándose el crecimiento de las raíces. Sin embargo ante la presencia de
sustancias tóxicas, la división celular de los meristemas radiculares puede
afectarse retardando el proceso de mitosis o alterando algún proceso de
elongación de las células radiculares, produciéndose además aberraciones
cromosómicas. Esta clase de alteraciones inhibe el crecimiento normal de la
raíz por lo que la fitotoxicidad de un compuesto puede ser determinada a través
de la medición de este parámetro. La concentración del extracto necesaria para
producir la inhibición al 50% del crecimiento en longitud de las raíces, se
conoce como CILr50 (concentración inhibitoria de longitud radicular 50). A partir
de esta dosis se analiza la genotoxicidad de los extractos a distintas
concentraciones para precisar cual es la dosis menos tóxica.
PARTE PRACTICA
1- OBJETIVOS
Aplicar el Test de aberraciones cromosómicas para comprobar la
fitotoxicidad de extractos vegetales.
Determinar la actividad genotóxica de extractos vegetales sobre los
ápices radiculares de bulbos de cebolla.
2- REACTIVOS Y MATERIAL BIOLÓGICO
.Bulbos de cebolla (Allium cepa), preferentemente pequeños y de igual tamaño.
.Recipientes de 4 cm de diámetro por 5 cm de altura.
.Matraces aforados de 500 - 1000 ml para hacer las diluciones.
.Pipetas volumétricas.
.Probetas
.Regla u otro elemento de medición.
.Agua mineral o Medio nutritivo de Hoagland
.Extractos vegetales preparados según técnica de prácticos anteriores.
.Lupa
.Microscopio
.Porta y cubreobjetos
.Orceína al 5% o Carmín acético al 2% en ácido acético al 45%
.Reactivo de Schiff
3- TEST DE ALLIUM CEPA L.
Para la realización de este bioensayo los bulbos deben limpiarse eliminando las
catáfilas externas secas y removiendo, con un cuchillo o instrumento punzante,
los restos de tejido y raíces del área radicular, evitando en lo posible dañar los
primordios radiculares. Se colocan en agua durante 48 horas, hasta que se
produce el crecimiento de los ápices radiculares y luego se ponen en contacto
con extractos vegetales, en concentraciones crecientes (100 - 10000 ppm). Se
realizan los correspondientes controles de agua destilada y alcohol de la
graduación correspondiente a los extractos vegetales, y controles positivos
(dicromato de potasio) y se dejan en contacto durante 48 a 96 horas.
Los ensayos se realizan por triplicado, tomándose muestras cuando se
han completado de 2-4 ciclos de división celular. Transcurrido el tiempo de
contacto con el extracto, se mide la longitud de las raíces y se determina la
fitotoxicidad del mismo por inhibición del crecimiento en longitud. La
concentración del extracto donde se produce la inhibición al 50% del
crecimiento en longitud de las raíces, se conoce como CILr50 (concentración
inhibitoria de longitud radicular 50). Se observa el aspecto macroscópico de las
mismas a la lupa para evaluar la presencia de anomalías (necrosis, tumores,
ganchos ,etc.)
Una vez determinada la CILr 50 se analiza la genotoxicidad de los extractos
llevando los bulbos a agua para reanudar el ciclo celular normal de las cebollas
y así observar a qué concentración se producen aberraciones cromosómicas o
anomalías microscópicas.
ANALISIS CITOGENETICO
Para efectuar este análisis se cortan de 5 - 15 ápices radiculares, los cuales
se fijan en etanol absoluto - ácido acético (3:1, v:v ) durante 18 a 24 horas.
Luego se conservan en etanol 70 % a 4º C. Los ápices radiculares se
hidrolizan en HCl 1N a 60 ºC durante 5 - 10 minutos o a temperatura ambiente
durante 20 - 60 minutos. Posteriormente se pone en contacto con una gota de
Reactivo de Schiff durante 15 minutos en oscuridad. Se realizan preparados
microscópicos, aplicando la técnica de aplastado (squash), en orceína acética,
o carmín acético. Se analizan 5 campos por muestra, observando
microscópicamente 7500 células. Se calcula el índice mitótico determinado por
el cociente entre el número de células en división y el número total de células
observadas ( % IM ), índice de fases mitóticas y frecuencia de anomalías
microscópicas (células binucleadas, citoplasma granuloso, micronúcleos, c-
mitosis, puentes, cromosomas fragmentados, etc.) cuyos valores se expresarán
en las tabla correspondiente.
RESULTADOS
.Efectuar la medición de las raíces y obtener el promedio de las tres
repeticiones, descartando los valores extremos. El efecto fitotóxico se
expresa como porcentaje de inhibición respecto del control.
.Calcular los índices para las distintas etapas de división celular y
expresarlos en la tabla.
.Observar a la lupa y dibujar detalladamente las alteraciones o daños
producidos sobre las raíces a las diferentes diluciones ensayadas.
.Observar al microscopio óptico las aberraciones o anomalías de las
mismas.
PARAMETRO
CONTROL AGUA
CONTROL POSITIV
O
CONTROL 100 ppm
CONTROL 1000
ppm
CONTROL 10000
ppm
EXTRACTO 100 ppm
EXTRACTO 1000
ppm
EXTRACTO 10000
PPM
M I%
RL [mm]
MA %
Ma %
I I %
P I %
PM I %
MI %
A I %
T I %
MI % : Indice mitótico (Frecuencia de divisiones
mitóticas)
P I % : Indice Profásico
RL
[mm]
: Longitud de raíz PM I
%
: Indice Prometafásico
MA % : Aberraciones macroscópicas M I % : Indice Metafásico
Ma % : Aberraciones microscópicas A I % : Indice Anafásico
I I % : Indice interfásico T I % : Indice Telofásico
Fitoterapia: Diseño de un trabajo práctico. Análisis de la factibilidad de su
realización en el laboratorio. Preparación de una monografía.
Los objetivos planteados para este trabajo práctico son:
Que el alumno:
A) Diseñe un trabajo práctico en el que se demuestren las propiedades
medicinales de plantas utilizadas popularmente como medicinales en
Argentina.
B) Realice un análisis de la factibilidad de realización en las instalaciones
del laboratorio de Fitoquímica en base a la infraestructura disponible.
Para ello:
El alumno deberá:
1- Realizar una adecuada búsqueda bibliográfica sobre el tema sugerido
por la Cátedra utilizando los recursos disponibles.
2- Establecer hipótesis y planteos experimentales que le permitan validar
los usos populares de las plantas seleccionadas
3- Evaluar los recursos disponibles en la Cátedra para realizar los análisis
químicos/biológicos, utilizando metodología moderna y ensayos que
puedan ser realizados en un trabajo práctico de no mas de 3 horas
4- Realizar la experimentación en el laboratorio para comprobar la
factibilidad de realización
5- Elaborar una monografía que deberá tener la estructura de una guía de
trabajos prácticos: Marco teórico y diseño experimental.
6- Exposición oral del trabajo realizado
Para cumplir con estos objetivos:
Se sugiere la formación de grupos de trabajos de hasta cuatro alumnos
El proyecto debe ser elaborado durante el cuatrimestre de manera que la
monografía se presente al finalizar los trabajos prácticos.
El docente guía atenderá todas las consultas necesarias para lo cual
establecerá un cronograma de trabajo con los distintos grupos.
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