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CAPTULO 4

DETERMINAO DOS TEORES DE COMPOSTOS FENLICOS EM

Dimorphandra mollis Benth.

A teoria o que decide o que podemos observar.

EISTEIN

1. INTRODUO

Compostos fenlicos pertencem classe de compostos que inclui

diversidade de estruturas simples e complexas, com pelo menos um anel

aromtico no qual, ao menos um hidrognio substitudo por um grupamentohidroxila (SIMES et al,1999) (figura 1).

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1.1. Biossntese dos compostos fenlicos

Sua origem biossinttica est relacionada a duas rotas biogenticas: a via

do cido chiqumico (carboidratos) e via do acetato-malato (malonil-CoA e acetil-

CoA) (figura 2) (MANN,1996).

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Figura 2: Rota biossinttica resumida nos vegetais superiores dos compostos

fenlicos, adaptado de CARRAPIO (1998).

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PAL

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1.2. Classificao, distr ibuio e propriedades dos compostos fenlicos

a. Classif icao

So classificados de acordo com o tipo de esqueleto principal (C6), que

constituir o anel benznico e com a cadeia substituinte (CX) (figura 1). Assim,

por exemplo, os fenis simples e as benzoquinonas C6; os flavonides e

isoflavonides C6-C3-C6 (figura 3 a); taninos hidrolisveis (C6-C1)n e

taninos condensados (C6-C3-C6)n (figura 3 b e c) (SIMES et al,1999).

Figura 3: Estrutura principal de flavonides (a) e estruturas de taninos

hidrolisveis cido elgico, cido glico (b) e taninos condensados

procianidina (c).

(b)(b)

Proacianidina (c)

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Outra classificao est relacionada com a ocorrncia no reino vegetal dos

compostos fenlicos, assim, so amplamente distribudos como os derivados de

cidos benzicos e de cidos cinmicos, cumarinas, flavonides, de polmeros

(taninos e ligninas) ou so de distribuio restrita como fenis simples,

antraquinonas, xantonas, naftoquinonas (SIMES et al,1999).

b. Distribuio

Compostos fenlicos esto amplamente distribudos em vegetais e em

microorganismos (COSTA &PROENA DA CUNHA,2000).

Dentre os compostos fenlicos pertencentes ao metabolismo secundrio

dos vegetais encontram-se estruturas como cidos fenlicos, dos derivados de

cumarina, pigmentos hidrossolveis, ligninas, taninos, e ainda fazem parte de

protenas, alcalides e terpenides (PROENA DA CUNHA et al,2003).

Os derivados do cido benzico so amplamente encontrados nas

gimnospermas e angiospermas. O cido glico ocorre em plantas lignificadas, as

cetonas fenlicas tem distribuio restrita, e os derivados do cido cinmico

possuem ampla distribuio, podendo ser encontrados como steres livres ou

heterosdeos (SIMES et al,1999).

Os steres de cido cafico so marcadores taxonmicos em Lamiaceae Os

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c. Propriedades

Contribuem no sabor, odor e colorao de diversos vegetais sendo muito

usados, os compostos fenlicos, como flavorizantes (aldedo cinmico e vanilina)

e corantes na indstria alimentcia, na cosmecutica (PROENA DA CUNHA et al,

2003).

Enfatizam-se, tambm a atividade antioxidante dos derivados fenlicos (Ilex

paraguariensis erva mate, Camellia sinensis ch, dentre outros) e a atividade

antibacteriana, antiviral e antifngica dos steres do cido cafico (Echinaceae

purpurea, Plantago major) (SIMES et al,1999).

Nos vegetais ressaltam-se na defesa a herbivoria, na inter-relao entre

animal-vegetal; na inibio da germinao de sementes, do crescimento de

fungos e em alelopatia. HARBORNE (1985) enfatiza a importncia marcante dos

fenilpropanides como supressores do apetite de insetos.

1.3. Flavonides e Taninos

1.3.1. Flavonides e Flavonis

Os flavonides so compostos fenlicos que possuem 15 tomos de

carbono em seu ncleo fundamental, constitudo de duas fenilas ligadas por uma

cadeia de trs carbonos entre elas (C6-C3-O2-C6) (figura 3a) Nos compostos

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Figura 3 a Estrutura e numerao bsica de flavonides

Flavonides podem ser encontradas na forma aglicosilada, como, porexemplo, a quercitina, naringenina ou ainda miricetina (figuras 4a, 4b e 4c), porm

mais freqente encontr-las no reino vegetal na forma glicosilada, unidas a

molculas de acares como a ramnose, rutinose (03 molculas de glicose)

(figura 5) ou ainda possvel mistura de glicosdeos, como a rhamno-glucosdeos,

formando respectivamente os derivados flavonides glicosilados (SPANOS &

WROLSTAD, 1992).

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Figura 4: Estruturas qumicas de Flavonides. A. Quercetina, B. Naringerina, C.

Miricetina.

a Quercetina (Flavonol)

b Naringerina (Flavanona)

c Miricetina (Flavonol)

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Figura 5:Estrutura qumica de flavonides heterosdeos (C e O )

a Quercetina 3-O-glicosdeo

b Isovitexin (flavona glicosdeo)

1.3.1.1. Biossntese de f lavonides

Os flavonides so biossintetizados a partir da via do acetato e chiquimato.

As etapas da biossntese de flavonides iniciam-se com o metabolismo de

fenilpropanides. A fenilalanina (figura 6a) passa por desaminao pela enzima

phenylalanine ammonia lyase ou fenilalanina amnia liase (PAL) formando cido

cinmico (figura 6b) (JONES, 1984). As vias subseqentes envolvem reaes de

hidroxilao do cido cinmico (SEYFERT, 1982) em p-Cumaril que origina p-

Cumarato CoA que por meio da enzima p Cumarato CoA ligase forma p Cumaril

Glicona

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Figura 6: Estruturas da fenilalanina (6a) e do cido cinmico (6b) e reao de

desaminao da PAL

Fenilananina (a) PAL cido cinmico (b)

Figura 7.Representao esquemtica simplificada da biossntese de flavonides

(PEDRIALI et al, 2005).

NH3

cido f enolp irvico Fenilalanina

cido Cinmi co

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Flavonol (2-fenil-benzo-alfa-pirona)

Quercetina

UDP-Glicose

Rutina

UDP-L-Ramnose Quercetina 3-glucosid e

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Figura 8: Estruturas qumicas dos principais flavonides

a. Flavonas e Flavonis e seus heterosdeos (O e C-Heterosdeos)

So compostos que possuem, na posio C3, hidroxila (OH), sendo

freqentemente oxigenados, substitudos com hidroxilas e ou metoxilas ou ainda,

acila, C-metila, metileno, pirano, dentre outras. Em flavonas, no ncleofundamental R=H, e em flavonis R=OH. A maioria das flavonas e flavonis

identificadas em plantas est sob a forma conjugada, ou seja, ligada a um ou

Flavona Antoci anidina Isoflavona

Flavonona Flavanol Flavonol

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Os heterosdeos constituem grupo importante de compostos orgnicos,

produzidos, em geral, pelo reino vegetal e que, pela ao dos cidos, bases ou

enzimas, se desdobram numa parte acar e a outra no acar (aglicona).

Essas partes esto ligadas entre si pelo intermedirio do tomo de carbono

anomrico do acar (SIMES et al, 1999).Todos os heterosdeos possuem em comum a caracterstica de, por

hidrlise, se desintegrarem em um acar e a poro aglicona (genina). So,

portanto, carboidratos ligados a no-carboidratos (aglicona). A aglicona que

determina, geralmente, a ao do heterosdeo (BRUNETON,1995).

Os heterosdeos mais difundidos na natureza so os O - heterosdeos, nos

quais, a parte acar a aglicona, que so normalmente ligadas pela funo

acetal. Encontram-se, todavia, igualmente N - heterosdeos, S - heterosdeos e C

- heterosdeos nos quais, o carbono anomrico do acar est unido aglicona

por um tomo de nitrognio (azoto), ou um tomo de enxofre ou um tomo de

carbono (por exemplo, casimiroedine (N - heterosdeo), sinigrina (S - heterosdeo)

e alona (C - heterosdeo). A aglicona est s vezes ligada ao acar pela funo

ster (COSTA,2000).

Em geral, os heterosdeos so compostos slidos, incolores e constituem

substncias de reserva dos organismos vegetais ou atuam como estimulantes A

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Os primeiros heterosdeos isolados eram produtos condensados da

glicose, motivo pelo qual foram chamados de glicosdeos; termo depois

generalizado aos heterosdeos e hoje, reservado somente queles derivados da

glicose (EVANS &TREASE, 1996). Reconheceram-se vrios compostos da natureza

anloga, mas derivados de outras oses designados de galactosdeos,ramnosdeos (TYLER et al, 1997). So denominados, de acordo com o nmero de

molculas de acar presente em sua estrutura como oligo-heterosdeos ou poli-

heterosdeos.

Nos flavonis, os heterosdeos, contm a poro acar ligada a poro

no-glicdica (genina ou aglicona), que neste caso pigmento. Entre os flavonis

heterosdeos tm-se 3-rutinosdeo quercetina (rutina) (figura 9) e 7-glicosdeo

luteolina.

Quadro 1: Estrutura qumica de flavonas e flavonis

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Figura 9:Estrutura qumica da Rutina (3-rutinosdeo quercetina).

Fonte: PubChem Substance Summary, 2006

b. Di-hidrof lavonides (Flavanonas e Flavanonis)

As flavanonas so caracterizadas pela ausncia da dupla ligao

(olefnica) nos carbonos 2 e 3, possibilitando o posicionamento do anel B em

posio R ou S (SILVA, S et al, 2003). Tambm caracterizado pela ausncia de

hidroxila na posio 3 (quadro 2). As flavanonas so intermedirios biossintticos

da maioria das classes de flavonides. Podem possuir sabor amargo ou doce,

devido as configuraes esteroqumicas, agindo como defesa a herbivoria e ao

mesmo tempo como alimento (SIMESet al,1999).

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c. Flavanas, Leucoantocianidinas e proantocianidinas

Esses compostos fazem parte de uma classe de flavonides, junto aos

biflavonides e mais recentemente os isoflavonides, nos quais e possvel

encontrar estruturas oligomerizadas. Caracterizadas pela ausncia de ligao

olefnica entre os carbonos 2 e 3, e tambm da hidroxila na posio 3 (quadros 3e 5) (SIMESet al,1999).

Quadro 3: Estrutura qumica das flavanas

Fonte: SILVA,S et al(2003)

Isoflavonides so caracterizados por uma cadeia arila-C3-arila, mais do

tipo difenil-1,2-propano (figura 10 quadro 5). Os substituintes mais comuns so

os grupamentos hidroxilas, metoxilas e metilenodioxila. Possuem distribuio

taxonmica restrita, ocorrendo em Fabaceae. Biogeneticamente so formados via

chaconas. Distribuem-se em isoflavonas, isoflavononas, pterocarpanos,

isoflavanas, cumestanos (Costa, 2000).

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Figura 10:Estrutura qumica da Isoflavona

d. Chalconas

O termo chacona utilizado na caracterizao da famlia de compostos

que possue o ncleo fundamental o 1,3-diarilpropano, modificado pela presenade ligao olefnica, de grupamento cetona e ou de grupo hidroxila. Caracterstica

marcante desse grupo possuir pigmentao amarela que passa a vermelha em

meio alcalino. As cores tm importante papel em sistemas ecolgicos, pois esto

implicadas na polinizao por insetos e pssaros (quadro 4 e 5).

Quadro 4: Estrutura qumica da Chaconas

Nome R2 R3 R4 R3 R4

Marena OH OH O-glic OH OH

Okanina OH OH OH OH OH

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quando a delfinina, ou seus derivados, complexa-se com o copigmento do tipo

flavona e com metais catinicos que promovem a emisso de luz caracterstica

(quadro 5).

Algumas espcies vegetais tm outro flavonide, a cianidina, que permite

coloraes do vermelho at o magenta, como ocorre em plantas como asRosaceae (GOTTLIEB, 1982; KONDOet al., 1992). Ainda destaca-se a cor vermelha

prpura caracterstica das orqudeas, onde o flavonide (cianidina, glicosdeo

peonidina) associa-se a copigmentos e a metais (FIGUEIREDO et al., 1999;

BLOOR;1998).

Figura 11:Antocianinas (a) e Malonilawobanina (delfinina) (b)

Quadro 5: Principais sub-classes de flavonides e suas coloraes

Sub- Classes Cor Flavonides representativos

a b

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b. Proteo radiao UV-B

A radiao ultravioleta B (280-315 nm) a faixa do espectro solar de

menor comprimento de onda e maior energia. Ao incidir nas folhas, a radiao

UV-B absorvida pelos pigmentos complexos formados pelos flavonides, que,

de modo geral, absorvem na mesma regio fornecida pelo UV-B, funcionando

assim, como filtro e evitando que a radiao atue sobre outras molculas

celulares importantes, como o DNA, modificando-o e levando-o, a formao de

clulas defeituosas (HARBORNEet al, 2000). Gentipos mais resistentes aos danos

da radiao UV-B promovem aumento nas snteses de flavonides e de outros

polifenis, como flavonas e glicosdeos flavonnicos.

H evidncias que plantas submetidas radiao UV-B artificial promovem

mudanas nas rotas sintticas dos flavonides, alterando a sua concentrao nas

clulas epidrmicas (Pinus silvestris, Oryza sativa), de folhas cerosas

(Gnaphalium luteo-album), folhas pilosas (Quercus ilex) e talos (Marchantia

polymorpha) (SILVA,S et al, 2003).

c. Proteo antimicrobiana

Os flavonides so os agentes constitutivos que produziro as fitoalexinas

em resposta a ataques microbianos (GRAYER & HARBORNE 1994; HARBORNE 1994)

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metoxilas ou glicosilas provoca a diminuio da atividade do composto; exceto em

chalconas hidroxiladas que so mais efetivas, quanto maior o nmero de

hidroxilas, como foi demonstrado por GAFNERet al. (1996).

d. Interao Planta-animal

Os polifenis (flavanas polimricas, proantocianidinas, flavonas, flavonis

e isoflavonas) de baixo peso molecular tm funo de destaque na proteo

vegetal contra herbvora (insetos e animais) (HARBORNE,1995 e 1999).

Trs glicoflavonas a schaftosideo, isoschaftosideo e a neoschaftosideo,

foram isoladas de plantas de arroz e testadas como inibidores da ao de insetos

como o Niloparvatta lugens, tendo resultado na inibio da atividade de ingesto

da seiva (GRAYERet al., 1994). Em arroz, tambm, foi identificado que a flavanona

sacuranetina e o cido clorognico tm suas concentraes foliares aumentadas

em respostas infeco do nematide Ditylenchus angustus (PLOWRIGHTet al.,

1996). A sacuranetina, ainda, aumenta no excesso de radiao UV e de fungos,

sendo de vital importncia na proteo das plantas de arroz (DILLONet al., 1997).

Alguns gneros de insetos como Helicoverpa, Heliothis, Lymantria e

Trichoplusia, so pouco tolerantes a flavonides glicosilados, principalmente no

segundo estgio larval BENINGER & ABOU-ZAID (1997) verificaram que extratos

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glicosdeos flavnicos derivados da quercitina 3-galactosideo (3-dirhamnosil

galactosdeo; 3-rutinosideo; 3- rhamnosil galactosideo) (HARIBAL &RENWICK, 1996

e 1998).

Ainda, na defesa contra a herbivoria, as procianidinas, podem se

condensar, em muitas formas, originando taninos (STEVENSet al., 1998). Segundo

LAWLERet al (1998) plantas como os Eucalyptus ovatae o Eucalyptus viminalis,

que servem de alimentos de ursos Koalas, mostraram a presena de polifenis

floroglucinol, macrocarpol G e jensenona, que esto relacionados as procianidinas

geradoras de taninos. Dietas artificiais com concentraes de cerca de 2% de

macropol G reduzem o consumo alimentar em cerca de 90%, indicando o carter

protetor dessa substncia herbivoria.

e. Propriedades farmacolgicas

Hoje, conhece-se cerca de 4.200 flavonides que desempenham os mais

diversificados funes biolgicas no organismo humano (PEDRIALIet al, 2005).

Flavonides possuem a capacidade inibir a xantina oxidase, enzima

responsvel pela oxidao de tecidos, sendo, portanto, capazes de inibir a

formao de radicais livres e o combater o envelhecimento precoce. A

capacidade de remoo de radicais livres dos flavonides pode prevenir

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Figura 12:Regies estruturais dos flavonides com alta atividade de seqestro

de radicais livres (PEDRIALIet al, 2005)

Alm disso, os radicais livres atuam como pr-oxidantes sobre as

lipoprotenas de baixa densidade (LDL), possibilitando a deposio e formao de

placas arteriosclerticas no endotlio, facilitada pela aderncia dos macrfagos

(DE VRIESet al., 1998). Foi demonstrado que certos flavonides tm a capacidade

de impedir que o LDL tenha modificao oxidativa, fornecendo assim proteo

contra riscos arteriosclertico (WHALLEY et al., 1990; MANGIAPANE et al., 1992;

RANKINet al., 1993).

Ainda tambm foram relatados diversos efeitos biolgicos importantes

como antitumoral, antiulcerognica, anti-hemorrgicas, tratamento de doenas

circulatrias, hipertenso e cofator da vitamina C, atividade estrognica, atividade

antiinflamatria e muitas outras (MANTLE et al, 1999; DI CARLO et al, 1999;

H & W 2000 R N t l 2001 S t l 1999)

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1.3.2. Taninos

Taninos so compostos fenlicos de grande interesse econmico e

ecolgico estando presentes na maioria das plantas e podendo variar de

concentrao nos tecidos vegetais, dependendo da idade e do crescimento da

planta, da parte coletada, da poca ou, ainda, do local de coleta (TEIXEIRAet al,

1990; SIMON et al.,1999; LARCHER, 2000).

A palavra tanino largamente usada, particularmente em bibliografia

botnica, originalmente derivada do termo tanante, implicando que a matria-

prima vegetal curta couro a partir de peles (HASLAN, 1965; 1988).

A maioria dos compostos fenlicos no encontrada no estado livre na

natureza, mas na forma de steres ou de heterosdeos sendo, portanto, solveis

em gua e em solventes orgnicos polares. Tm peso molecular compreendido

entre 500 e 3000 Daltons, possuindo a habilidade de formar complexos insolveis

em gua com protenas, gelatinas e alcalides (MELLO et al, 2001). Ainda so

responsveis pela adstringncia de muitos frutos e produtos vegetais, devido

precipitao de glucoprotenas salivares, o que ocasiona a perda do poder

lubrificante (BRUNETON, 1995).

A ligao entre taninos e protenas ocorre, provavelmente, atravs de

pontes de hidrognio entre os grupos fenlicos dos taninos e determinados stios

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Por serem fenlicos, os taninos so muito reativos quimicamente, formam

pontes de hidrognio, intra e intermoleculares. Um mol de taninos pode ligar-se a

doze moles de protenas; e com base nessa propriedade pode-se identificar

taninos por teste de precipitao de gelatinas (MELLO et al, 2001). Estes

compostos so facilmente oxidveis, tanto pelas enzimas vegetais especficas

quanto por influncia de metais, como cloreto frrico, o que ocasiona o

escurecimento de suas solues (SIMESet al,1999).

No Brasil, vrias espcies so pesquisadas por suas propriedades

tanantes; entre as principais esto Stryphnodendron adstringens(Martius) Coville,

Dimorphandra mollis Benth., Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenam, Acacia

mearnssiDe Wild, Psidium guajavaL. e Myracrodruon urundeuva(Engl.) Fr. All.

(TEIXEIRAet al., 1990;BRANDO, 1992; RODRIGUESet al., 1992; MAGALHES et al.,

1997; CALDEIRAet al., 1998; SANTOSet al., 2002, MELLOet al, 2001).

1.3.2.1. Classif icao dos taninos

Classicamente, segundo a estrutura qumica, os taninos so classificados

em dois grupos: hidrolisveis e condensados (figuras 3b e 3c).

Os taninos hidrolisveis consistem de steres de cidos glicos e cidos

elgicos (hexahidroxidifnicos) glicosilados (figura 3b) formados a partir do

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Amplamente encontrados no reino vegetal, os taninos condensados ou

proantocianidinas so polmeros de flavan-3-ol e/ ou flavan-3,4-diol, produtos do

metabolismo do fenilpropanol (HELDT,1997;HEIL et al,2002).

As proantocianidinas, assim denominadas provavelmente pelo fato de

possurem pigmentos avermelhados da classe das antocianidinas, como cianidina

e delfinidina (figuras 10a e 10b) e tm rica diversidade estrutural, resultante de

padres de substituies entre unidades flavnicas, diversidade de posies entre

suas ligaes e a esteroqumica de seus compostos (BRUNETON, 1995).

MELLO & SANTOS (2001) ressaltaram ainda que a ocorrncia desses

compostos comum em angiospermas e gimnospermas, principalmente em

plantas lenhosas. Considerando a proporo da ocorrncia de taninos em famlias

das Angiospermas arranjadas de acordo ao sistema de classificao de

Cronquist, somente 4% de 228 espcies testadas por MOLE(1993) foram positivas

a taninos. Nas ordens Polygonales e Plumbaginales apenas uma nica famlia de

cada tem taninos, e em famlias de Caryophyllales tais compostos estavam

ausentes. Nas Moraceae, os taninos presentes esto em quantidade insuficiente

a precipitao de protenas (MONTEIROet al,2005).

1 3 2 2 Propriedades biolgicas de taninos

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Compostos fenlicos em vegetais, principalmente taninos, tm

reconhecidamente a funo de inibirem herbvoros, pois em altas concentraes,

frutos, folhas, sementes ou demais tecidos jovens tornam-se impalatveis aos

fitfagos e, ainda, combinado a algumas protenas, estes tecidos resistem

fortemente putrefao (VOLZet al2001).

Foi verificado por REYNOLDSet al. (1965) que macacos africanos tem alta

rejeio por plantas com alto teor de tanino, porm, alguns chipanzs possuem

tolerncia ao tanino, principalmente quando h maior nvel de acar livre, como

no caso de figos (Ficus caricaL.), onde aps a ingesto dos frutos, as sementes

(taninos) so regurgitadas.

RODRIGUES et al (1992) e MAGALHES et al (1997) estudam o aspecto

antinutricional de cultivares com altos teores de taninos e sua resistncia a

pragas.

HELDT (1997) informa que em savanas sul africanas, as folhas de accia

so recursos alimentares do antlope kudu. Essas folhas contm taninos que,

em baixas quantidades, no afetam sua qualidade nutricional. Quando estas

rvores so predadas pelos antlopes, liberam o etileno, hormnio vegetal que

induzir, em cerca de 30 minutos, o aumento da sntese de taninos em rvores

vizinhas Os nveis de taninos aumentam tanto que os mamferos podem chegar

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ratos com dieta rica em taninos, conseguem induzir liberao maior de protenas

salivares se protegendo contra o efeito da adstringncia.

b. Interao planta-ambiente

Estudos sobre variaes do teor de taninos mostram que h diferenas

quando as plantas so coletadas e analisadas em perodos distintos (TEIXEIRAet

al, 1990; SIMONet al, 1999; PANSERAet al, 2003).

Polifenis de baixo peso molecular e elagitaninos foram analisados em

HPLC, por SIMNet al(1999) em quatro espcies de carvalho (Quercus robusL.,

Q. petraea Liebl., Q. pyrenaica Wild. e Q. faginea Lam.) obtidos do extrato da

madeira. As coletas foram realizadas antes e depois de um ano e, durante este

processo, as concentraes de polifenis de baixo peso molecular aumentaram e

a concentrao de elagitaninos, dmeros e monmeros, diminuram, concluindo

que a sazonalidade natural afeta a composio qumica devido a processos de

desidratao e maturao. As modificaes qumicas foram similares nas quatro

espcies.

Os efeitos da poluio na atmosfera podem alterar a resistncia de

Tibouchina pulchraCogn. herbivoria. O estudo de duas localidades no Sudoeste

do Brasil mostrou que as altas taxas de poluio atmosfrica induzem o aumento

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sazonalidade distintos e as variaes de galoilglucose e elagitaninos so

especficas por possurem caminhos biossintticos prprios.

c. Propriedades farmacolgicas

O uso de medicamentos com taninos est relacionado suas propriedades

adstringentes, sendo empregada como antidiarrico, anti-sptico; cicatrizante na

proteo da pele e mucosas (MONTEIROet al,2005)

Ao precipitar protenas, os taninos propiciam efeito antimicrobiano e

antifngico. Ainda so hemostticos e, como precipitam alcalides, podem servir

de antdoto em casos de intoxicaes (BRUNETON,1995).

Em processos de cura de feridas, queimaduras e inflamaes, os taninos

auxiliam formando camada protetora (complexo tanino-protena e/ ou

polissacardeo) sobre tecidos epiteliais lesionados (MELLO et al, 2001).

Provavelmente, devido habilidade de ligar-se s protenas e outras

macromolculas, os taninos tm atividades txicas.

AYRESet al(1997) verificaram que a rpida mortalidade de insetos tratados

com taninos condensados parece ser devido atividade txica destes compostos

e no pela inibio da digestibilidade. Associa-se a alta toxicidade ao maior peso

da molcula

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minerais podendo, ainda, em alta concentrao, desenvolver cncer de boca

(mucosa) e esfago (CHUNGet al, 1998; SINGHet al, 2001).

Vrias doenas degenerativas como cncer, esclerose mltipla,

arteriosclerose e o prprio processo de envelhecimento esto associados a altas

concentraes intercelulares de radicais livres. Taninos, tambm, atuam como

captadores de radicais livres, os quais interceptam o oxignio ativo formando

radicais estveis (MELLOet al, 2001).

CHUNGet al(1998) hipotetizam que os taninos tm duplo efeito devido ao

efeito quimiopreventivo contra carcinognese ou antimicrobiano e aos efeitos

carcinognico, hepatotxico ou antinutricionais. A atividade anticarcinognica

evidenciada por CHUNGet al(1998), que ressaltam que os japoneses consomem

o ch verde (Camelia sinensis), rico em cido tnico e outros polifenis, em

grandes quantidades e o risco de cncer gstrico mostra-se baixo. Taninos das

espcies Quercus suber L. e Q. cocciferaL. tem efeito gastroprotetor, variando

entre 66 e 91% (KHENNOUFet al, 2003). CHUNGet al(1998) relataram que nozes

contendo cerca de 25% de taninos podem ser responsveis pela alta incidncia

de cncer de esfago em determinada localidade dos EUA, onde pessoas

comumente as consomem aps o almoo.

Molculas de taninos esto sendo testadas com a inteno de se

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que a atividade anti-HIV exibida por taninos devida inibio da transcriptase

reversa, dificultando assim a replicao viral.

SCALBERT(1991) relata que taninos condensados e hidrolisveis no tm

diferenas significantes frente a fungos e bactrias, visto que o efeito da

toxicidade relacionado estrutura molecular do tanino ainda desconhecido.

Muitas bactrias so sensveis aos taninos, dentre elas Staphylococcus

aureus, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracise Shigella dysenteriaee, em

concentraes mnimas (0,5 g/L), o fungo Fomes annosus tem seu crescimento

inibido (CASTROet al, 1999).

NISHIZAWAet al(1990) demonstraram significante atividade bactericida do

decocto da raiz de Nuphar variegatum Durand contra microorganismos

patgenos. Relataram que, por sculos, o rizoma e as razes foram usados na

medicina popular por suas propriedades afrodisacas, hemostticas, adstringentes

e sedativas. O rizoma, em especial, empregado na cura de infeces diversas e

o decocto da raiz no tratamento de infeces dos olhos, garganta e dores

internas. A anlise cromatogrfica (HPLC) do extrato aquoso da raiz dessa planta

evidenciou dois galotaninos e dois elagitaninos, sendo reconhecidos por

nupharina A e nupharina B.

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2. OBJETIVOS

Avaliar metodologias de extrao do flavonide rutina em frutos e folhas

de Dimorphandra mollis Benth., a fim de proporcionar agregao de

valor comercial e qualitativo aos coletores/ moradores das regies de

Cerrado.

Desenvolver nova tecnologia que permita aumento da extrao de

compostos fenlicos em Dimorphandra mollis Benth., especialmente

dos flavonides rutina e quercetina, compostos farmacologicamente

ativos, a fim de agregar maior valor financeiro aos coletores da espcie.

Identificar e quantificar os teores de compostos fenlicos,

especialmente os flavonides rutina e quercetina em Dimorphandra

mollisBenth.

Analisar o desenvolvimento crescimento e os compostos do

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Comparar os teores de compostos fenlicos e flavonides em folhas e

frutos de plantas adultas de Dimorphandra mollisBenth. coletados no

Cerrado em reas do norte de Minas.

Confrontar os teores de compostos fenlicos e flavonides em folhas e

frutos de plantas adultas de Dimorphandra mollisBenth. coletados em

reas de cerrado do norte de Minas e em plantas cultivadas em Viosa,

em ambiente protegido (telado) mediante tratamentos homeopticos.

Identificar e separar por meio de cromatografia em camada delgada,

grupos especficos de compostos farmacologicamente ativos em

Dimorphandra mollis Benth. e em seus subprodutos (p de frutos,

folhas, frutos, sementes).

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3. MATERIAIS E MTODOS

3. 1. Obteno das amostras

3.1.1. Amostras de campo

Folhas totalmente expandidas e frutos no primeiro estdio de maturao(totalmente verdes) (figuras 1 e 2) de plantas adultas de Dimorphandra mollis

foram coletados no ms de abril/ maio de 2006, no Cerrado do norte de Minas, na

macro-regio de Montes Claros por meio de podo/ ou tesoura de poda. As

coordenadas de campo foram obtidas em GPS, constituindo doze tratamentos,

com quatro repeties (TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TRF-MOC 01 a TRF-MOC

12), totalizando 96 amostras (Anexo 1/ figura 3).

Figura 1: Folhas totalmente expandidas de Dimorphandra mollis.

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Figura 2:Frutos no primeiro estdio de maturao de Dimorphandra mollis.

Fonte: arquivo pessoal

3.1.2. Amostras cult ivadas

Frutos de plantas matrizes de D. mollisforam coletados em Montes Claros,

nos meses de agosto a outubro de 2005. Aps a secagem natural (luz solar, a

temperatura ambiente mdia de 350C), os frutos foram abertos manualmente

(figura 4), selecionadas as sementes colocadas em sacos de plsticos e em papel

Kraft e transportadas ao Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de

Viosa.

Figura 4: Frutos e sementes de D. mollis

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3. 2. Seleo e Obteno dos tratamentos

3.2.1. Amostras de campo

Os tratamentos TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TRF-MOC 01 a TRF-MOC

12 foram armazenados em sacos plsticos e transportados ao Laboratrio de

Melhoramento Vegetal, do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal

de Viosa onde foram identificados, pesados, armazenados em embalagens de

papel Kraft, dispostos em bandejas em estufa de ventilao forada a temperatura

de 38oC at peso constante.

3.2.2. Amostras cult ivadas

As sementes selecionadas foram pesadas em balana analtica (Toledo

Mettler) e separadas em 16 tratamentos (25 sementes por repetio) com 4

repeties (TR-VIC 01 a TR-VIC 16), no Laboratrio de Melhoramento Vegetal.

Em seguida, procederam-se a embebio, germinao e avaliao do

crescimento (padres fitotcnicos) das sementes/ plntulas. Os medicamentos e

preparados homeopticos adotados foram:

01 gua destilada;

02 gua destilada 6 CH;

03 gua destilada 12 CH;

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10 Etanol 70% 6 CH

11 Etanol 70% 12 CH

12 Carbo vegetabilis12 CH;

13 Caryocar brasiliensis(Pequi) 6 CH;

14 Caryocar brasiliensis(Pequi) 12 CH;

15 Dimorphandra mollisfungi 6 CH;

16 Dimorphandra mollisfungi 12 CH.

3.3. Conduo do experimento3.3.1. Amostras de plantas cult ivadas

Na embebio os tratamentos foram dispostos em bqueres, com 10 mL de

gua destilada e 1mL (20 gotas) de preparados homeopticos, em delineamento

inteiramente casualizado. A aplicao dos tratamentos homeopticos foi feita em

duplo-cego. Em seguida, as sementes dos tratamentos TR-VIC-01 a TR-VIC-16

foram novamente pesadas em balana analtica (Toledo Mettler), distribudas em

64 caixas gerbox (16 tratamentos com 4 repeties), previamente preparadas,

procedendo-se a incubao dos tratamentos em BOD temperatura de 35oC,

com fotoperodo de 12 horas, por 21 dias. Durante a germinao, foram

consideradas sementes germinadas aquelas que emitiram radcula primria de 4

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casa de vegetao telada nas dependncias do Departamento de Fitotecnia, da

Universidade Federal de Viosa.

Acompanhou-se o desenvolvimento das plntulas, avaliando nmero de

folhas, espessura/ dimetro e altura do caule por 63 dias. A cada sete dias foram

reaplicados nos tratamentos TR-VIC-01 a TR-VIC-16, os devidos preparados

homeopticos.

Depois de 65 dias, as plantas dos tratamentos TR-VIC-01 a TR-VIC-16 foram

coletadas, identificadas, pesadas em balana analtica (Micronal B200),

armazenadas em embalagens de papel Kraft, dispostas em bandejas em estufade ventilao forada temperatura de 38oC at peso constante.

3.4 Manipulao dos Preparados homeopticos

A manipulao dos preparados homeopticos foi feita de acordo com o

Manual de Normas Tcnicas da Farmcia Homeoptica (ABFH, 2003) e

Manipulao de Preparados Homeopticos (RODRIGUES-DAS-DRES,ANDRADE &

CASALI, 2007).

3.5 Aplicao dos preparados homeopticos

3 5 1 Embebio e Germinao

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3.5.2 Plantas cult ivadas

Nos tratamentos TR-VIC-01 a TR-VIC-16, a cada sete dias, foram

reaplicados os devidos preparados homeopticos sendo cada vaso regado com

100 mL de gua com 0,1 mL (100 L = 2 gotas) de preparado homeoptico

(1:1000).

3.6. Preparo das amostras

3.6.1. Preparo do extrato metanlico

Aps a secagem, pesou-se em balana analtica (Micronal B200) 400 mgdos tratamentos TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12, TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12, TR-

VIC-01 a TR-VIC-16, todos com quatro repeties, que foram tratados com cerca

de 5 mL de metanol PA (Merck), por 24 horas. Em seguida, foram filtrados em

papel de filtro Reagen (R42, 9cm) e o extrato (5mL) armazenado em frascos de

10 mL transparentes, com tampa.

3.7. Triagem fi toqumica

3.7.1 Preparo dos extratos

O preparo dos extratos seguiu a metodologia de WAGNER et al (1996)

(esquema I Extratos 1 2 3 4 e 5) onde foram elaborados extratos em

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homogeneizao desses tratamentos, a amostra TRF-MOC e dos frutos (TFR-

MOC 01 a TFR-MOC 12) pelo mesmo procedimento, obteve-se a amostra TFR-

MOC. Das plantas cultivadas de D. mollis(TR-VIC 01 a TR-VIC 16) procedeu-se

idntica homogeneizao dos tratamentos originando a amostra TR-VIC; das

sementes provenientes de frutos de plantas matrizes de D. mollis, comps-se

amostra TRS-MOC; e ainda, dos frutos, aps secagem em estufa de ventilao

forada a temperatura de 40 0C, moagem em moinho de facas, homogeneizao,

quarteamento e classificao do p obtido, teve-se a amostra TR-PO.

Assim, foram elaborados extratos de TF-MOC, TR-VIC, TRS-MOC, TFR-MOC e TR-PO utilizados na identificao de flavonides, taninos; leos

essenciais, saponinas, cumarinas, alcalides, antraquinonas e carditnicos.

3.7.1.1.Plantas cultivadas

Em plantas cultivadas de D. mollis(TR-VIC 01 a TR-VIC 16) fez-se anlise

fitoqumica especial de flavonides e taninos, visando identificar a presena ou

ausncia de flavonides (rutina, quercetina) e taninos (cido tnico vermelho,

cido tnico branco).

De tal forma que foram elaborados extratos metanlicos conforme extrato 1

da metodologia de WAGNER et al (1996) (esquema 1) organizados em TR-VIC 01

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cromatogrficas do tipo (Merck GF 254, Alugram SilG UV 254, Polygram SilG UV

com espessura de 0,250 mm); como fase mvel solventes (Reagen, Sigma,

Merck, Synth) em diversas polaridades segundo WAGNER et al (1996), e

reveladores adequados (esquema 1). Os reagentes, fases mveis, reveladores

foram preparados segundo WAGNER et al(1996).

Nas anlises cromatogrficas foram avaliados os extratos TF-MOC, TR-

VIC, TRS-MOC, TFR-MOC e TR-PO e comparados aos Rfs de padres de

flavonides (rutina, quercetina), taninos (cido tnico); leos essenciais (eugenol,

terpenol, mentol, anetol); saponinas (saponina padro Merck); cumarinas(cumarina padro Merck); alcalides (reserpina, quinina, estricnina, pilocarpina,

atropina, brucina); antraquinonas (antraquinona padro Merck, alona, emodina) e

carditnicos (digoxina, Digitalis), e ainda padro de cido clorognico. Todas as

placas cromatogrficas foram refeitas e re-analisadas com quadro repeties.

As placas cromatogrficas foram digitalizadas aps a revelao, analisados

os Rfs das amostras e dos padres, comparados e identificados quanto

presena ou ausncia dos compostos.

3.7.2.1 Plantas cultivadas

A triagem dos compostos foi realizada por Cromatografia em camada

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(Nuclear) em taninos (esquema 1). Os reveladores e fase mvel foram

preparados segundo WAGNER et al(1996).

Nas anlises cromatogrficas foram avaliados os extratos dos 16

tratamentos e suas 4 repeties (TR-VIC 01 a TR-VIC 16), analisados e

comparados aos Rfs de padres de flavonides (rutina, quercetina Sigma e

Merck) e de taninos (cido tnico branco e cido tnico vermelho CRQ e Vetec).

Todas as placas cromatogrficas foram refeitas e re-analisadas com trs

repeties; sendo, em seguida a revelao, digitalizadas, e por meio dos Rfs das

amostras e dos padres, identificados nos tratamentos (TR-VIC 01 a TR-VIC 16)

presena ou ausncia de rutina, quercetina e cido tnico.

Figura 4:Desenho esquemtico de Cromatografia em Camada Delgada

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ESQUEMA I: TRIAGEM FITOQUMICA Identificao dos compostos presentes

por Cromatografia em camada delgada (CCD) nos extratos 1, 2, 3, 4 e 5 (WAGNER

et al, 1996)

EXTRATO 1

0,5 g de p

5 mL de Metanol a 60 C

5 minutos

Filtrar

Extrato 1

leos essenciais Heterosdeos Antracnicos Flavonides

Terpenos Taninos

FM:DCM/ACOET(93:7) FM: ACOET/MEOH/H2O (100:17:13) FM: ACOET/MEOH(75:25)

FE:slica gel 60 F254 FE:slica gel 60 F254 FE:slica gel 60 F254REVELADOR: Vanilina/H2SO4 REVELADOR: KOH 5 % em Etanol REVELADOR: AlCl3/vanilina/H2SO4

Padres: Terpenol Padres:Alona Padres:Quercetina

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EXTRATO 2.

2 g de p

10 mLETOH 70%

Refluxo 10 min.

Filtrar

Evaporar a 5 mLExtrato 2

Saponinas

FM:CHCl3/MEOH/H2O(60:30:4)

FE:slica gel 60 F254

Revelador:Vanilina/H2SO4

Padres: Saponina Merck

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EXTRATO 3

1 g de p

10mL de MEOH

Banho-maria 30 min.

Filtrar

EvaporarExtrato 3

Cumarinas

FM:ACOET/MEOH/GUA (100:17:13)


Revelador:KOH 5%a 10% em MEOH

Padres: Cumarina Merck

Lapachol

Bergapteno

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EXTRATO 4.

1 g de p

20 mLETOH 50%

10 ML sol de acetato 10%

Refluxo 15 min.

Resfriar

Filtrar

Filtrado 1

cido actico (SR) pH= 5

Funil de separao

Extrair 15mL de DCM (3X)

Na2SO4

Evaporar

Resduo (1mL DCM/ ETOH 1:1)

Extrato 4

Cardiotnicos

FM:ACOET/ MEOH/ H2O (100:13,5:10)


Revelador:SbCl3

Padres: Digoxina Merck

Digitalis

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EXTRATO 5.

1 g de p

10 mLH2SO40,05M

5 min.

Resfriar

FiltrarFiltrado 1

1mL NH4OH conc.

Funil de separao

Diluir 10 mL de H2O

Extrair com ter

Na2SO4

Filtrar

Evaporar

Resduo (0,25mL de MEOH)

Extrato 5

Alcalides

FM:ETOH/ MEOH/ H2O (100:13,5:10)


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3.8. Quantificao de compostos fenlicos por doseamento

espectrofotomtrico

Determinou-se a concentrao de compostos fenlicos nos tratamentos

TR-VIC 01 a TR-VIC 16; TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-

MOC 12 de acordo com a metodologia de JAYAPRAKASHA et al (2001) e de

Singh et al(2001).200 L dos extratos metanlicos dos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC

16; TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12, foram

misturados com 1000 L do Reagente de Folin Ciocalteu (1:10) e com 800 L

de soluo carbonato de sdio a 7,5%. Procedeu-se homogeneizao dos

tratamentos, deixando-os em repouso a temperatura ambiente por 30 minutos

e em seguida as concentraes de compostos fenlicos foram medidas

quantitativamente em 765 nm em espectrofotmetro Shimadzu Modelo UV1601

(esquema 2) e os resultados expressos em g/mL de cido tnico.

3.8.1 Curva Padro

A curva padro de compostos fenlicos teve como substncia padro

cido tnico (CRQ). Pesou-se 100 mg de cido tnico e dilui-se com metanol a

80% (Merck), em balo volumtrico de 10 mL, obtendo soluo estoque (SE)

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Procedeu-se homogeneizao, deixando-os em repouso a temperatura

ambiente por 30 minutos e em seguida as concentraes de compostos

fenlicos foram medidas quantitativamente em 765 nm em espectrofotmetro

Shimadzu Modelo UV1601 (esquema 3) e os resultados expressos em g/mL

de cido tnico.

Esquema 2: Metodologia de quantificao de compostos fenlicos por

doseamento espectrofotomtrico.

Extratos metanlicos (200 L)

TR-VIC 01 a TR-VIC 16 (64 amostras)

TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 (48 amostras)

TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 (48 amostras)

1000 L de Folin Ciocalteau

800 L de Carbonato de sdio (7,5%)

Homogeneizar

30 minutos Temperatura ambiente

Cubetas espectrofotomtricas

ABSORBNCIA

760 nm

E 3 C d lib d f li

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Esquema 3: Curva de calibrao de compostos fenlicos

CONCENTRAO DO PADRO DE CIDO TNICO (C76H52O46)PM = 1700

C= M onde: M= massa em mg;V V = volume em mL.

100 mg (C= 100 mg/10ml = 10 mg/ mL)

q.s.p. de metanol 80% (MEOH 80%)

Balo volumtrico de 10 mLHomogeneizar

SOLUO ESTOQUE - SE (0,1:10)= 10 mg/ mL

Alquota 1 mL

99 mL de MEOH 80%

Balo volumtrico de 100 mL

Homogeneizar

SOLUO AMOSTRA SA(10:100) = 0,1 mg/ mL = 100 g/mL

Alquotas

100L (10g) 200L(20 g) 300L(30g) 400L (40g ) 500L(50g)

(0,01 mg/ mL)

Alquotas de 100 L a 500 L de Soluo Amostra

1000 L de Folin Ciocalteau (q.s.p 2000 L)

800 L de Carbonato de sdio (7,5%)

Homogeneizar

3 9 Q tifi d fl i d t t f t t i

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3.9 Quantificao de flavonis por doseamento espectrofotomtrico

A concentrao de flavonis nos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16;

TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 foi adaptada da

metodologia de JAYAPRAKASHAet al (2001) e de BUTLERet al(2002).

500 L dos extratos metanlicos dos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC

16 e TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 foram misturados com 2500 L de soluode Vanilina 0,5% (Nuclear) em metanol (Merck) e cido clordrico 4% (HCl -

Reagen). Procedeu-se homogeneizao dos tratamentos, deixando-os em

repouso a temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por 20 minutos e em

seguida as concentraes de flavonis foram medidas quantitativamente em

500 nm em espectrofotmetro Shimadzu Modelo UV1601 (esquema 4). De

forma similar, o branco foi preparado com 2500 L de soluo de Vanilina 0,5%

(Nuclear) em metanol (Merck) e 2500 L de cido clordrico 4% (HCl) (Reagen)

em metanol (Merck) em seguida as foi medido quantitativamente em 500 nm

em espectrofotmetro Shimadzu Modelo UV1601 (esquema 4). A concentrao

do branco foi subtrada dos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16; TRF-MOC 01

a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 e os resultados expressos em

g/mL de rutina.

Os tratamentos TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 (frutos) foram analisados

Shimadzu Modelo UV1601 (esquema 4) devido alta concentrao de

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Shimadzu Modelo UV1601 (esquema 4), devido alta concentrao de

flavonis.

3.8.1 Curva Padro

A curva padro de flavonis teve como substncia padro rutina padro

Sigma Pesou-se 100mg de rutina e dilui-se com metanol a 70% (Merck), embalo volumtrico de 10mL, obtendo-se a soluo estoque (SE) com 10 mg/mL

de rutina. Da soluo estoque (SE) retirou-se uma alquota de 1mL e dilui-se

com metanol 70%, em balo volumtrico de 100 mL constituindo a soluo

amostra (SA) com 0,1 mg/ mL ou 100 g/mL, da qual foram retiradas alquotas

de 100 L a 500 L, com as concentraes de 10 g a 50 g, que foram

misturados com 2500 L de soluo de Vanilina 0,5% (Nuclear) em metanol

(Merck) e cido clordrico 4% (HCl). Procedeu-se homogeneizao dos

tratamentos, deixando-os em repouso a temperatura ambiente, ao abrigo da

luz, por 20 minutos e em seguida as concentraes de flavonis foram medidas


(esquema 5) e os resultados expressos em g/mL de rutina.

3.9.2 Quantificao de flavonis em diversos solventes orgnicos

Adicionou se em seguida os 16 tratamentos que foram constitudos por

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Adicionou-se, em seguida, os 16 tratamentos que foram constitudos por

10 mL dos solventes Metanol e suas diluies (MEOH P.A.; MEOH 70%;

MEOH 50%); Etanol e suas diluies (ETOH; ETOH 70%; ETOH 50%); Acetato

de etila (ACOET); Acetato de etila/ metanol (ACOET/MEOH (75:25);

ACOET/MEOH (50:50); Acetato de etila e diclorometano (ACOET/DCM (50:50);

ACOET/DCM (25:75); Diclorometano ou cloreto de metileno (DCM); Acetona

(ACONA); Acetona e gua (ACONA/H2O (75:25); ACONA/H2O (50:50); e da

testemunha gua (H2O), organizados em TR-SOLV 01 A TR-SOLV 16.

TR-SOLV 01 MEOH

TR-SOLV 02 MEOH 70%

TR-SOLV 03 MEOH 50%

TR-SOLV 04 - ETOH 70%

TR-SOLV 05 ETOH 50%

TR-SOLV 06 ETOH

TR-SOLV 07 ACOET

TR-SOLV 08 ACOET/ MEOH 75:25

TR-SOLV 09 ACOET/ MEOH 50:50

TR-SOLV 10 ACOET/ DCM 50:50

TR-SOLV 11 ACOET/DCM 25:75

Aps 24 horas os tratamentos TR-SOLV 01 A TR-SOLV 16 foram

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Aps 24 horas, os tratamentos TR SOLV 01 A TR SOLV 16 foram

filtrados em papel de filtro Reagen R 42, 9cm. O resduo foi desprezado e o

extrato separado em 4 repeties (TR-SOLV 01 r1 a r4 at TR-SOLV 16 r1

a r4). De cada repetio retirou-se alquota de 500 L que foram misturados

com 2500 L de soluo de Vanilina 0,5% (Nuclear) em metanol (Merck) e

cido Clordrico 4% (HCl). Procedeu-se homogeneizao dos tratamentos,

deixando-os em repouso a temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por 20

minutos e em seguida as concentraes de flavonis foram medidas


(esquema 4) e os resultados expressos em g/mL de rutina.

Esquema 4: Metodologia de quantificao de flavonis por doseamento

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Esquema 4: Metodologia de quantificao de flavonis por doseamento

espectrofotomtrico

Extratos metanlicos (500 L)

TR-VIC 01 a TR-VIC 16 (64 amostras)

TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 (48 amostras)

TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 (48 amostras)

2500 L de Vanilina 0,5% em MEOH

2500 L de HCl 4% em MEOH

Homogeneizar

20 minutos Temp. ambiente Abrigo da luz (escuro)


ABSORBNCIA

500 nm

Branco

2500 L de Vanilina 0,5% em MEOH


Homogeneizar

20 minutos Temp. ambiente - Abrigo da Luz (escuro)


ABSORBNCIA

500 nm

Esquema 5: Curva de calibrao de flavonis

5/26/2018 06 - capitulo 4

57/124

q

CONCENTRAO DO PADRO DE RUTINA

C= M onde: M= massa em mg; PM= 610,5V V = volume em mL.

100 mg (C= 100 mg/10ml = 10 mg/ mL)

q.s.p. de metanol 70% (MEOH 70%)


Homogeneizar

SOLUO ESTOQUE - SE (0,1:10)= 10 mg/ mL

Alquota 1 mL

99 mL de MEOH 70%


Homogeneizar

SOLUO AMOSTRA - SA(10:100) = 0,1 mg/ mL = 100 g/mL

Alquotas

100L (10g) 200L(20 g) 300L(30g) 400L (40g ) 500L(50g)

(0,01 mg/ mL)

Alquotas de 100 L a 500 L de Soluo Amostra

2500 L de Vanilina 0,5% em MEOH (q.s.p)


Homogeneizar

3.10. Avaliao e determinao do f lavonide Rutina por HPLC

5/26/2018 06 - capitulo 4

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p

A concentrao de flavonol rutina nos tratamentos foi adaptada da

metodologia de OLIVEIRAet al(2001).

Os tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16; TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e

TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 foram cromatografados em HPLC/ UV (Shimadzu

SPD 10AV), nas seguintes condies: coluna Novapak Water C18; 250 x 4.6

milmetros, tamanho da partcula 5 m, tendo como fase mvel metanol (Vetec

Espectrofotometria) e gua acidificada a pH 3,0 com cido fosfrico P.A.

(Vetec). A eluio foi feita por gradiente tendo como fase mvel metanol/ gua

1:1 (0 a 10 minutos) e metanol/ gua 7:3 (10 a 20 minutos), com trmino de

eluio em 25 minutos, dbito (fluxo) de 1ml/minuto, a 339 nm e injeo de 20

L.

Alquotas de 500 L dos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16 e de TRF-

MOC 01 a TRF-MOC 12 diludas em 500 L de fase mvel (metanol:gua 1:1)

constituram os 20 L injetados na determinao de rutina nas amostras. Em

TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 , utilizou-se de 100 L diludos em 900 L de

fase mvel (metanol: gua 1:1). Aps o clculo da rea dos picos encontrados

em cada tratamento e de suas repeties (4) fez-se a integrao das reas

calculando a concentrao de rutina (g/ mL) devidamente multiplicada pelos

70% (Merck) obtendo a soluo amostra (SA) da qual tomou-se alquotas nas

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59/124

concentraes de 1250 ppm a 100 ppm, das quais 20 L foram injetados em

aparelho HPLC UV (Shimadzu SPD 10AV), nas mesmas condies descritas

nas anlises dos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16; TRF-MOC 01 a TRF-

MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 (OLIVEIRAet al, 2001).

3.11. Extrao e Processamento de rut ina em extrato aquoso

Pesou-se em balana analtica (Micronal B200) 50 gramas de p de

Dimorphandra mollis que foram tratados com 250 mL de gua destilada a

temperatura de 60o

C (Banho-maria Tecnal TE 184) em erlenmeyer de 500

mL, por 15 minutos, formando soluo de colorao marrom amarelada, em

seguida a preparao obtida foi filtrada em papel de filtro Reagen R42 e

aquecida ebulio em chapa aquecedora (Tecnal). Aps aquecimento por

cerca de 30 minutos ocorre a formao de precipitados (PPt-PO) que foram

filtrados em papel de filtro Reagen R42, transferidos com auxlio de esptula

metlica a placas de Petri colocadas em estufa (Fanen) a temperatura de 35oC,

at a secagem (peso constante). A gua usada na filtragem (gua-me)

aquecida foi imediatamente submetida temperatura de 8oC, em geladeira

convencional, por 60 minutos, onde houve a formao de cristais, que foram re-

BRAS. IV (2003) (esquema 6) e concentrao calculada em percentual (m/ m)

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de flavonides calculados como quercetina (C15H10O7).

Onde: A = absorvncia medida;m = massa da droga (g);Pd = determinao de gua (%).

A identificao de PPt-PO em CCD (figura 4) teve como suporte (fase

estacionria) placas cromatogrficas do tipo (Merck 60 GF 254, Alugram SilG

UV 254, Polygram SilG UV com espessura de 0,250 mm); como fase mvel

solventes acetato de etila/ metanol (ACOET/ MEOH - 75:25)(Reagen e Merck,

respectivamente), reveladores cloreto de alumnio (AlCl3) (Reagen) na

deteco de flavonides e vanilina sulfrica (vanilina/ H2SO4) (Nuclear) e

padres de rutina e quercetina (Sigma e Merck), segundo WAGNER et al(1996).

3.12. Extrao e Processamento de rutina em extrato metanlico

Pesou-se em balana analtica (Toledo Mettler) 150 gramas de p de

Dimorphandra mollis que foram tratados com quantidade suficiente de Metanol

P.A. a temperatura de 25oC em erlenmeyer de 1500 mL, por cerca de 168

A=x 5

50 x m x (100 Pd)

Aps a secagem, calculou-se o rendimento obtido na extrao e

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identificou-se o extrato (TR-EXT) por cromatografia em camada delgada (CCD)

e doseou-se os flavonides por espectrofotometria segundo a metodologia da

FARM. BRAS. IV (2003) (esquema 6) e concentrao calculada em percentual

(m/ m) de flavonides calculados como quercetina (C15H10O7).

Onde: A = absorvncia medida;m = massa da droga (g);

Pd = determinao de gua (%).

A identificao de TR-EXT em CCD (figura 4) teve como suporte (fase

estacionria) placas cromatogrficas do tipo (Merck 60 GF 254, Alugram SilG

UV 254, Polygram SilG UV com espessura de 0,250 mm); como fase mvelsolventes acetato de etila/ metanol (ACOET MEOH - 75:25)(Reagen e Merck,

respectivamente), reveladores cloreto de alumnio (AlCl3) (Reagen) na

deteco de flavonides e vanilina sulfrica (vanilina H2SO4) (Nuclear) e

padres de rutina e quercetina (Merck), segundo WAGNER et al(1996).

A= x 5 50 x m x (100 Pd)

Esquema 6: Doseamento de flavonides segundo FARM. BRAS. IV (2003)

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(adaptado de RODRIGUES-DAS-DRES & CASALI In: Plantas Medicinais e

Aromticas: Controle de Qualidade. UFV, 2007)

3.13 Processamento de dados e anlise estatstica

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63/124

Os dados obtidos foram submetidos anlise de varincia e teste de

mdia (Dunnett, Tukey) a 5% de probabilidade, utilizando os programas

Sistema para Anlises Estatsticas (SAEG) e Gentica Quantitativa e

Estatstica Experimental VS (GENES).

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 RESULTADOS

4.1.1 Triagem fitoqumica nos tratamentos TF-MOC, TFR-MOC, TRS-MOC,

TR-VIC e TR-PO

Anlises cromatogrficas por camada delgada (CCD) dos flavonides

tendo como padres Rutina (Rf = 0,54) e Quercetina (Rf = 0,68), com fase

estacionria slica-gel (Merck GF 254, Alugram SilG UV 254, Polygram SilG UV

com espessura de 0,250 mm), fase mvel MEOH/ ACEOT (25:75) e revelador

AlCl3foram positivos nos tratamentos TF-MOC, TR-VIC,TR-PO e TFR-MOC e

negativo em TRS-MOC. Em TR-VIC no foram detectados outros flavonides,

em TF-MOC detectou-se flavonides com Rf = 0,45 (figura 1); em TFR-MOC

com Rf = 0,56; em TR-PO com Rf = 0, 45 e Rf = 0,78 (quadro 1, figura 1).

Em CCD de taninos com padro de cido tnico (Rf = 0,65), com fase

Na anlise de leos essenciais (terpenos) por CCD utilizaram-se os

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padres de Anetol (Rfs = 0,85; 0,80; 0,69; 0,53); Mentol (Rf = 0,69); Eugenol

(Rf = 0,62) e Terpinol (Rfs = 0,66, 0,80), com fase estacionria slica-gel

(Merck GF 254, Alugram SilG UV 254, Polygram SilG UV com espessura de

0,250 mm), fase mvel DCM/ ACOET (93:7) e revelador vanilina sulfrica

(Nuclear) foram negativos em todos os tratamentos TF-MOC,TR-VIC, TRS-

MOC, TR-PO e TFR-MOC (quadro 1).

Em heterosdeos antracnicos (antraquinonas, antronas) com

antraquinona padro Merck (Rfs = 0,77; 0,48; 0,32), com fase estacionria

slica-gel (Merck GF 254, Alugram SilG UV 254, Polygram SilG UV com

espessura de 0,250 mm), fase mvel ACEOT/ MEOH/ H2O (100:17:13) e

revelador KOH 5% em ETOH foram negativos nos tratamentos TF-MOC, TR-

VIC (Rfs = 0,80; 0,73; 0,43; 0,30); TR-PO (Rfs = 0,43; 0,30); TFR-MOC (Rf =

0,45; 0,30) e TRS-MOC; (quadro 1, figura 2).

Em cumarinas, tendo como padro Cumarina Padro Merck (Rf =0,62),

Bergapteno Merck (Rf = 0,73) com fase estacionria slica-gel (Merck GF 254,

Alugram SilG UV 254, Polygram SilG UV com espessura de 0,250 mm), fase

mvel ACOET/MEOH/GUA (100:17:13) e revelador KOH 5% em MEOH,

foram negativos em todos os tratamentos (quadro 1).

to pouco saponinas com saponina padro Merck (Rf = 0,66), utilizando como

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fase estacionria slica-gel (Merck GF 254, Alugram SilG UV 254, Polygram

SilG UV com espessura de 0,250 mm), fase mvel fase mvel

CHCl3/MEOH/H2O(60:30:4) e revelador vanilina sulfrica (Nuclear).

Em anlise dos Heterosdeos cardiotnicos e dos padres de Lanatosdeo

C (Rf = 0,50) e de Digitonina Merck (Rfs = 0,77 e 0,11), fase estacionria


espessura de 0,250 mm), fase mvel fase mvel ACOET/MEOH/H2O

(100:13,5:10) e revelador vanilina sulfrica (Nuclear), os tratamentos TF-MOC;

TFR-MOC (Rf = 0,50) e TR-PO (Rfs = 0,50; 0,11) tiveram Rfs semelhantes aoLanatosdeo C e em TR-PO a Digitonina, no entanto, com intensidade de

colorao foi menos intensa, sendo identificados como fracamente positivo ().

Quadro 1: Perfil fitoqumico por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) em

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folhas (TRF-MOC); frutos (TFR-MOC); p de frutos (TR-PO); sementes (TRS-

MOC) provenientes de Montes Claros e em plantas cultivadas (TR-VIC) de

Dimorphandra mollis.

TRATAMENTOS

PADRES Rf TF-MOC TR-VIC TFR MOC TR PO TRS-MOC

0,68 + + + + -

FLAVONIDES 0,45 + + + + -

TANINOS 0,65 + + - - -

0,77 - - - - -

ANTRAQUINONA 0,48 - - - - -

0,85 - - - - -

0,80 - - - - -

0,69 - - - - -

0,62 - - - - -

LEOS 0,53 - - - - -

0,84 - - - - -

0,76 - - - - -

0,68 - - - - -

ALCALIDES 0,66 - - - - -

0,77 - - - - -

0,50 - -

CARDIOTNICOS 0,11 - - - -

0,73 - - - - -

CUMARINA 0,62 - - - - -

Legenda: Positivo (+) valores de Rfs iguais ou muito prximos aos dos padres

Figura 1: Cromatografia em Camada delgada de Flavonides em slica gel e

revelador AlCl3 com os padres de Rutina (Rut); Quercetina (Querc) e os

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revelador AlCl3, com os padres de Rutina (Rut); Quercetina (Querc) e os

tratamentos TF-MOC, TR-VIC, TR-PO, TFR-MOC e TRS-MOC .

FM:ACOET/ MEOH (75:25)FE:slica gel 60 F254REVELADOR: Cloreto de AlumnioPadres:Rutina

Quercetina

Figura 2:Cromatografia em Camada delgada de Antraquinonas em slica gel e

revelador KOH 5% em ETOH, com o padro de Antraquinona padro e os

tratamentos TF-MOC, TR-VIC, TR-PO, TFR-MOC e TRS-MOC.

TFR-MOC TRF-VIC TRF-MOC TR-PO TRS-MOC RUT QUERC TFR-MOC TRF-VIC TRF-MOC TR-PO TRS_MOC RUT QUERC

4.1.1.1. Triagem fitoqumica por Cromatografia em Camada Delgada em

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Plantas cultivadas

O resultado da triagem por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

nos extratos metanlicos dos 16 tratamentos e suas 4 repeties (TR-VIC 01 a

TR-VIC 16) de plantas cultivadas de D. mollis revelou a presena (+) ou

ausncia (-) de compostos fenlicos e comparados aos Rfs de padres dos

flavonides rutina (Rf = 0,32), quercetina (Rf = 0,78) e de taninos: cido tnico

branco (Rf = 0,48) e cido tnico vermelho (Rf = 0,68) (quadro 2 figura 3).

A presena de taninos (Rf = 0,68) foi detectada nos tratamentos gua

destilada (Testemunha) (Rf = 0,66), gua destilada 12 CH (Rf = 0,77),

Phosphorus 6 CH (Rf = 0,80), Phosphorus 12 CH (Rf = 0,75), Kali

phosphoricum 6 CH (Rf = 0,75),Sulphur 6 CH (Rf = 0,80), Sulphur12 CH (Rf =

0,75), ETOH 6 CH (Rf = 0,77), ETOH 12 CH (Rfs = 0, 66; 0,50), Fungos 6 CH

(Dimorphandra mollis fungi) (Rf = 0,65), Fungos 12 CH (Dimorphandra mollis

fungi) (Rf = 0,63, Pequi 12 CH(Caryocar brasiliensis frutis) (Rf = 0,65) e no

visualizados em gua 6 CH (Rfs = 0,81; 0,60; 0,28 e 0,10), Cyrtopodium1D

(Rf = 0,15); Carbo vegetabilis 12 CH (Rf = 0,30), e Pequi 6 CH (Caryocar

brasiliensis frutis) (Rf = 0,10). O tratamento ETOH 12 CH (Rfs =0, 66; 0,50)

sobressaiu-se aos demais devido relativa presena ( fracamente positivo)

(Dimorphandra mollis fungi) (Rf = 0,35), Fungos 12 CH (Dimorphandra mollis

f i) (Rf 0 35) P i 12 CH (C b ili i f ti ) (Rf 0 24)

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fungi) (Rf = 0,35), Pequi 12 CH (Caryocar brasiliensis frutis) (Rf = 0,24) e

negativa em Cyrtopodium1D (Rf = 0,15) e Pequi 6 CH (Caryocar brasiliensis

frutis) (Rf = 0,10).

O flavonide Quercetina (Rf = 0,78) foi positivo em gua destilada (Rf =

0,74), gua 6 CH (Rf = 0,81),gua 12 CH (Rf = 0,77),Phosphorus6 CH (Rf =

0,78), Sulphur 6 CH (Rf = 0,80), Sulphur12 CH (Rf = 0,75), ETOH 6 CH (Rf =

0,80), ETOH 12 CH (Rfs = 0,78), Fungos 6 CH (Dimorphandra mollisfungi) (Rf

= 0,79), Fungos 12 CH (Dimorphandra mollis fungi) (Rf = 0,78).Pequi 12 CH

(Caryocar brasiliensis frutis) (Rf =0,75) e negativo em Phosphorus 12 CH,Carbo vegetabilis12 CH, Cyrtopodium1D (Rf = 0,15),Kali phosphoricum 6 CH

e Pequi 6 CH(Caryocar brasiliensis frutis) (Rf = 0,10) e (quadro 2).

Figura 3: Cromatografia em Camada delgada de Flavonides em slica gel e

revelador vanilina sulfrica, com os padres de Rutina (R); Quercetina (Q) e

taninos (AC e T) em plantas de Dimorphandra mollis (TR-VIC 01 a 16, r1 a r4),

cultivadas em Viosa e tratadas com preparados homeopticos, nos meses de

abril a junho de 2006 (63 dias).

T1R1 T1R2 T1R3 T1R4 T2R1 T2R2 T2R3 ACTAN1 ACTAN2 RUT QUERC T2R3 T2R4 T3R1 T3R2 T3R3 T3R4 T4R1 ACTAN2 ACTAN1 QUERC

Quadro 2: Anlise do perfil fitoqumico em Cromatografia em Camada Delgada

(CCD) de plantas de Dimorphandra mollis cultivadas em Viosa e tratadas com

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(CCD) de plantas de Dimorphandra mollis, cultivadas em Viosa e tratadas com

preparados homeopticos, nos meses de abril a maio de 2006 (63 dias) de

compostos fenlicos (Rutina, Quercetina, cido tnico e Taninos).

COMPOSTOS FENLICOS

TRATAMENTOS Rutina Quercetina

cido

tnico Taninos

TR-VIC 01 gua destilada

(TESTEMUNHA) + + + -

TR-VIC 02 gua destilada 6 CH + + + -

TR-VIC 03 gua destilada 12 CH; + + - -

TR-VIC 04 Phosphorus6 CH + + + -

TR-VIC 05 Phosphorus12 CH + - + -

TR-VIC 06 Cyrtopodium1D - - - -

TR-VIC 07 Kali phosphoricum12 CH + - + -

TR-VIC 08 Sulphur 6 CH + + + -

TR-VIC 09 Sulphur 12 CH + + + -

TR-VIC 10 Etanol 70% 6 CH + + + -

TR-VIC 11 Etanol 70% 12 CH + + + +/-

TR-VIC 12 Carbo vegetabilis12 CH + - - -

TR-VIC 13 C. brasiliensisfrutis 6 CH - - - -

TR-VIC 14 C. brasiliensisfrutis 12 CH + + + -

TR-VIC 15 D. mollisfungi 6 CH + + + -

TR-VIC 16 D mollis fungi 12 CH + + + -

4.1.2 Quantif icao de flavonides em diversos solventes orgnicos

A quantificao de flavonis nos solventes orgnicos visa identificar a

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A quantificao de flavonis nos solventes orgnicos visa identificar a

polaridade que os flavonis rutina e quercetina so melhores extrados e

portanto teriam maior rendimento (figura 4). Dentre os tratamentos, TR-SOLV

15 ACONA/ H2O (50:50) tem teor mdio (tm) de flavonides de 104,39

g/mL, seguido de TR-SOLV 14 ACONA/ H2O (75:25) (tm =37,68 g/mL) e

de ETOH 50% (tm =36,36 g/mL) conforme no quadro 3.

As menores solubilidades foram em TR-SOLV 13 ACONA (tm = 8,10

g/mL), TR-SOLV 08 ACOET/ MEOH (75:25) (tm = 8,52 g/mL) e em TR-

SOLV 09 ACOET/ MEOH (50:50) (tm = 8,57g/mL) (quadro 3, tabela 1).

Tabela 1: Resumo da anlise de varincia dos Teores mdios de flavonis

(TMF g/mL) nos tratamentos TR-SOLV 01 a TR-SOLV 15 e a testemunha TR-

SOLV 16 gua destilada.

Quadrados Mdios

F.V. G.L. TMF

TRAT 15 2250,75**

RESDUO 48 13,10

Quadro 3: Teores mdios de flavonis (g/mL) nos tratamentos TR-SOLV 01

a TR-SOLV 15 comparados as testemunhas TR-SOLV 16 gua destilada (*)

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(testemunha 1) e TR-SOLV 04 ETOH 70% (*)(testemunha 2)COMPARAES

DUNNETT

TRATAMENTOS MDIAS

TUKEY

H2O ETOH

TR-SOLV 15 ACONA/ H2O (50:50) 104,39 A * *

TR-SOLV 14 ACONA/ H2O (75:25) 37,68 B * *TR-SOLV 05 ETOH 50% 36,36 B

* *TR-SOLV 16 H2O (gua destilada -

TESTEMUNHA 1)

21,92 C

*TR-SOLV 03 MEOH 50% 20,71 CD

*

TR-SOLV 02 MEOH 70% 19,90 CDE *TR-SOLV 12 DCM 14,00 CDEF

*TR-SOLV 10 ACOET/ DCM (50:50) 13,00 CDEF

*TR-SOLV 01 MEOH 12,60 DEF

*TR-SOLV 11 ACOET/ DCM (25:75) 12,37 DEF

*TR-SOLV 04 ETOH 70%

(TESTEMUNHA 2)

12,36 DEF

*TR-SOLV 07 ACOET 11,89 DEF

*TR-SOLV 06 ETOH 11,15 EF

*TR-SOLV 09 ACOET/ MEOH

(50:50)

8,57 F

*TR-SOLV 08 ACOET/ MEOH

(75:25)

8,52 F

*

Figura 4:Colorao dos extratos dos tratamentos TR-SOLV 01 MEOH; TR-

SOLV 02 MEOH 70%; TR-SOLV 03 MEOH 50%; TR-SOLV 04 - ETOH

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70%; TR-SOLV 05 ETOH 50%; TR-SOLV 06 ETOH; TR-SOLV 07 ACOET; TR-SOLV 08 ACOET/ MEOH (75:25); TR-SOLV 09 ACOET/

MEOH (50:50); TR-SOLV 10 ACOET/ DCM (50:50); TR-SOLV 11 ACOET/

DCM (25:75); TR-SOLV 12 DCM; TR-SOLV 13 ACONA; TR-SOLV 14

ACONA/ H2O (75:25) ;TR-SOLV 15 ACONA/ H2O (50:50) comparados

testemunha TR-SOLV 16 H2O,utilizados em determinao dos teores mdiosde flavonis (g/mL).

Fonte: arquivo pessoal

4.1.3 Quantificao de compostos fenlicos por doseamento

espectrofotomtrico

A concentrao de compostos fenlicos nos tratamentos TR-VIC 01 a

TR-VIC 16; TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 e

suas repeties (r1 r2 r3 e r4) foram avaliadas estatisticamente por anlise de

tratamentos TR-VIC 09 Sulphur 12 CH (810,14 g/mL ), seguido de TR-VIC

05 Phosphorus 12 CH (tm = 709,83 g/mL); TR-VIC 11 ETOH 12 CH ( tm =

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p ( , g ); (

595,71 g/mL ); TR-VIC 10 ETOH 6 CH (tm = 536,70 g/mL); TR-VIC 16

Fungos 12 CH (Dimorphandra mollis fungi) (530,78g/mL); TR-VIC 03 H2O

12 CH (tm = 446,80 g/mL) e TR-VIC 08 Sulphur 6 CH (tm = 426,23 g/mL).

Os menores que a testemunha foram em TR-VIC 13 Pequi 6 CH (Caryocar

brasiliensisfrutis 6 CH) (tm = 1,36 g/mL) e TR-VIC 06 Cyrtopodium1 D (tm

= 55,83g/mL) (quadro 4, tabela).

Os tratamentos TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 tiveram os teores mdios

(tm) maiores em folhas TRF-MOC 12 (tm = 126,70 g/mL), TRF-MOC 04 (tm =118,91g/mL), TRF-MOC 05 (tm =117,35 g/mL) e os menores em TRF-MOC

06 (tm = 76,98 g/mL) e TRF-MOC 10 (78,20 g/mL), correspondendo

respectivamente aos pontos catalogados na figura 3 (anexo 1 - GPS) Pt-P01,

Pt-284, Pt-285, Pt-286 e Pt-290 (quadro 5). Em frutos TFR-MOC 01 a TFR-

MOC 12 (quadro 6), os teores mdios (tm) maiores foram TFR-MOC 11 (tm =

1430,51 g/mL), TFR-MOC 12 (tm = 1404,25 g/mL), TFR-MOC 05 (tm =

1243,63 g/mL) e os menores em TFR-MOC 10 (tm = 446,43 g/mL) e TFR-

MOC 04 (618,17 g/mL), correspondendo respectivamente aos pontos

catalogados na figura 3 (anexo 1- GPS) Pt-291, Pt-P01, Pt-285, Pt-290 e Pt-

Tabela 2: Resumo daanlise de varincia dos teores de compostos fenlicos (TCF), flavonis (TMF), flavonides por HPLC (FH)

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288

p ( ), ( ), p ( )

em microgramas por mililitro (g/mL) em folhas (TRF-MOC), frutos (TFR-MOC) e plantas cultivadas (TR-VIC) de D. mollis.

*** F significativo ao nvel de 10% de probabilidade.

** F significativo ao nvel de 1% de probabilidade.

* F significativo ao nvel de 5% de probabilidade.

QUADRADOS MDIOS QUADRADOS MDIOS

TRF-MOC TFR-MOC TRF-VICF.V. GL

TCF TMF FH TCF TMF FH

GL

TCF TMF FHTRAT 11 1062,93 255,75 153918,4 423692,6 6857,41 24047,07 15 0,86** 187,10** 44377,81**

RESIDUO 36 922.45 219,02 116892 275524,6 10560,54 22422,27 48 0,19 41,33 3723,97

CV (%) 30,37 42,27 58,20 53,96 43,41 43,40 14,94 29,33 54,22

Quadro 4: Teores mdios de compostos fenlicos (g/mL) de plantas de

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Dimorphandra mollis cultivadas em Viosa (MG) correspondentes aos

tratamentos TR-VIC 02 a TR-VIC 16 comparados a testemunha (TR-VIC 01

gua destilada).

COMPARAESTRATAMENTOS MDIAS

TUKEY DUNNETT

TR-VIC 09 Sulphur 12 CH2,70

A*

TR-VIC 16 D. mollisfungi 12 CH2,60

A*

TR-VIC 05 Phosphorus12 CH2,59

A*

TR-VIC 10 Etanol 70% 6 CH2,58

A*

TR-VIC 12 Carbo vegetabilis12 CH2,58

A*

TR-VIC 11 Etanol 70% 12 CH2,53

AB*

TR-VIC 14 C. brasiliensisfrutis 12 CH2,52

AB*

TR-VIC 03 gua destilada 12 CH2,51

AB*

TR-VIC 02 gua destilada 6 CH

2,46

AB

*TR-VIC 15 D. mollisfungi 6 CH2,42

AB

TR-VIC 08 Sulphur 6 CH2,41

AB

TR-VIC 07 Kali phosphoricum12 CH2,33

AB

TR-VIC 01 gua destilada (TESTEMUNHA)2,24

AB

TR-VIC 04 Phosphorus6 CH

2,09

AB

TR-VIC 06 Cyrtopodium1D1,76

B*

TR-VIC 13 C.brasiliensisfrutis 6 CH0,80

C*

Obs: dados transformados log (CF+5)

Quadro 5:Teores mdios de compostos fenlicos (CF) (g/mL) e flavonis (F)

( / L) f lh d Di h d lli d t t t TRF MOC 01

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(g/mL) nas folhas de Dimorphandra mollisdos tratamentos TRF MOC 01 a

TR-MOC 12.

MDIASTRATAMENTOS

COMPOSTOS

FENLICOS

FLAVONIS

TRF MOC 12 126,70A 30,58A

TRF MOC 04 118,91A 38,05A

TRF MOC 05 117,34A 37,42A

TRF MOC 11 113,16A 34,89A

TRF MOC 08 100,20A 31,42A

TRF MOC 07 98,91A 55,10A

TRF MOC 09 97,92A 27,32A

TRF MOC 02 96,90A 34,21A

TRF MOC 01 91,80A 32,00A

TRF MOC 03 82,96A 34,52A

TRF MOC 10 78,20A 38,79A

TRF MOC 06 76,97A 25,74A

As mdias seguidas de uma mesma letra no variam estatisticamente pelo

Quadro 6: Teores mdios de compostos fenlicos (g/mL) e flavonis

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(g/mL) nos frutos de Dimorphandra molliscorrespondentes aos tratamentos

TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12.

MDIASTRATAMENTOS

COMPOSTOS

FENLICOS

FLAVONIS

TFR MOC 11 1430,51A 176,21A

TFR MOC 12 1404,25A 211,02A

TFR MOC 05 1243,62A 220,63A

TFR MOC 06 1213,87A 229,47A

TFR MOC 02 1187,41A 263,15A

TFR MOC 03 1044,41A 229,47A

TFR MOC 08 886,73A 221,47A

TFR MOC 01 777,31A 208,63A

TFR MOC 09 723,56A 337,47A

TFR MOC 07 695,92A 231,37A

TFR MOC 04 618,71A 228,00A

TFR MOC 10 446,43A 283,58A

4.1.4 Quantificao de flavonis por doseamento espectrofotomtrico

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A concentrao de flavonis nos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16;

TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 e suas

repeties (r1, r2, r3 e r4) foi avaliada estatisticamente por anlise de varincia

e teste de mdia (Tukey e Dunnett) (quadros 5, 6 e 7).

A equao de calibrao de flavonis, com concentraes de 10 g/mL

(= 0,01 mg/ mL) a 50 g/mL (0,050 mg/ mL) = 0,0095 x (r2= 0,9933). Os

maiores teores mdios (tm) foram nos tratamentos TR-VIC 12 Fungos 12 CH

(Dimorphandra mollis fungi) (tm = 29,05g/mL), TR-VIC 03 ETOH 6 CH

(28,10 g/mL); TR-VIC 10 Sulphur12 CH (tm = 27,79g/mL) e menores em

TR-VIC 13 Pequi 6 CH (Caryocar brasiliensis frutis) (ns**), TR-VIC 06

Cyrtopodium1D (tm =18 g/mL) (quadro 7).

Em TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 (folhas) tiveram os teores mais altos

em TRF-MOC 07 (tm = 55,10 g/mL), TRF-MOC 10 (tm = 38,78 g/mL) e os

mais baixos em TRF-MOC 06 (tm = 25,74 g/mL) e TRF-MOC 09 (tm = 27,31

g/mL) correspondendo respectivamente aos pontos catalogados na figura 3

(GPS) Pt-287, Pt-290, Pt-286, Pt-289 (quadro 5). Em TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 (frutos), os teores mdios (tm) maiores em frutos TFR-MOC 09 (tm =

337 47 g/mL) TFR-MOC 10 (tm = 283 58 g/mL) e os menores em TFR-MOC

Quadro 7:Teores mdios de flavonis (g/mL) de plantas de Dimorphandra

mollis cultivadas em Viosa (MG) correspondentes aos tratamentos TR-VIC 02

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molliscultivadas em Viosa (MG) correspondentes aos tratamentos TR-VIC 02

a TR-VIC 16 comparados a testemunha (TR-VIC 01 gua destilada).

ComparaesTratamentos Mdias

Tukey Dunnett

TR-VIC 01 gua destilada (TESTEMUNHA) 19,47 A

TR-VIC 02 gua destilada 6 CH 28,10 A

TR-VIC 03 gua destilada 12 CH 19,21 A

TR-VIC 04 Phosphorus6 CH 19,58 A

TR-VIC 05 Phosphorus12 CH 24,63 A

TR-VIC 06 Cyrtopodium1D 18,00 A

TR-VIC 07 Kali phosphoricum12 CH 21,31 A

TR-VIC 08 Sulphur 6 CH 24,00 A

TR-VIC 09 Sulphur 12 CH 27,79 A

TR-VIC 10 Etanol 70% 6 CH 25,58 A

TR-VIC 11 Etanol 70% 12 CH 26,79 A

TR-VIC 12 Carbo vegetabilis12 CH 24,32 A

TR-VIC 13 C. brasiliensisfrutis 6 CH B *

TR-VIC 14 C. brasiliensisfrutis 12 CH 19,42 A

TR-VIC 15 D. mollisfungi 6 CH 23,42 A

TR VIC 16 D lli f i 12 CH 29 05 A

4.1.5. Avaliao e determinao do flavonide Rutina por HPLC

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82/124

A concentrao de rutina nos tratamentos TR-VIC 01 a TR-VIC 16; TRF-

MOC 01 a TRF-MOC 12 e TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 e suas repeties (r1,

r2, r3 e r4) foi avaliada estatisticamente por anlise de varincia e teste de

mdia (Tukey e Dunnett) (quadros 8, 9 e 10).

A equao de calibrao de rutina padro, com concentraes de 1000

ppm a 100 ppm = 42161x 99244 (r2 = 0,999) e o cromatograma do

padro de Rutina com 1000ppm est disposto na figura 5.

Os maiores teores mdios (tm) foram nos tratamentos TR-VIC 15 -

Fungos 6 CH (D. mollis fungi ) (tm = 338,46 g/mL) (figura 11), TR-VIC 01

gua destilada (testemunha) (tm = 276,86 g/mL e TR-VIC 12 - Carbo

vegetabilis 12 CH (tm = 250,58 g/mL) e menores TR-VIC 13 Pequi 6 CH

(Caryocarbrasiliensisfrutis) (nd), TR-VIC 07 - Kali phosphoricum 12 CH (tm =

7,30 g/mL) e TR-VIC 03 gua destilada 12 CH (tm = 9,20 g/mL) (figura 6)

(quadro 8).

Em TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12 (folhas) tiveram os teores mais altos

em TRF-MOC 09 (tm = 876,31 g/mL) (figura 7), TRF-MOC 01 (tm = 874,81g/mL) e TRF-MOC 08 (tm = 716,60 g/mL) e os mais baixos em TRF-MOC 12

(tm = 257 29 g/mL) e TRF-MOC 07 (tm = 318 87 g/mL) (quadro 9);

respectivamente aos pontos catalogados na figura 3 (Anexo 1 - GPS) Pt-288,

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Pt-292, Pt-286, Pt-291.

Figura 5:HPLC Cromatograma de padro de Rutina na concentrao de 750

ppm.

Condies : Coluna Novapak Water C18; 250 x 4.6 milmetros, partcula 5 m;

eluio por gradiente: fase mvel metanol/ gua (1:1) (0-10 min) e (7:3) de (10-

20min); fluxo 1mL/min; deteco 339nm. Diluio 500 L amostra: 500 L de

Figura 6:HPLC Cromatograma de tratamento TR-VIC 12 Carbo vegetabilis12

CH (tm = 250,58 g/mL).

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( g )



20min); fluxo 1mL/min; deteco 339nm. Diluio 500 L amostra: 500 L de

FM.

Figura 7: HPLC Cromatograma de tratamento TRF-MOC 09 (tm = 876,31

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g/mL).



20 min); fluxo 1mL/min; deteco 339nm. Diluio 500 L amostra: 500 L de

FM.

Figura 8: HPLC Cromatograma de tratamento TFR-MOC 08 (tm = 56052,03

g/mL).

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20 min); fluxo 1mL/min; deteco 339nm. Diluio 100 L amostra: 900 L de

FM.

Quadro 8: Teores mdios de rutina (g/mL) em plantas de Dimorphandra

molliscultivadas em Viosa (MG) correspondentes aos tratamentos TR-VIC 02

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a TR-VIC 16.

COMPARAESTRATAMENTOS MDIAS

Tukey Dunnett

TR-VIC 15 D. mollisfungi 6 CH 338,46 A *

TR-VIC 01 gua destilada (TESTEMUNHA) 276,86 AB

TR-VIC 12 Carbo vegetabilis12 CH 250,58 AB

TR-VIC 11 Etanol 70% 12 CH 206,90 ABC *

TR-VIC 10 Etanol 70% 6 CH 149,37 BCD *

TR-VIC 09 Sulphur 12 CH 127,92 BCD *

TR-VIC 14 C. brasiliensisfrutis 12 CH 121,37 CD *

TR-VIC 04 Phosphorus6 CH 87,52 CD *

TR-VIC 05 Phosphorus12 CH 56,74 CD *

TR-VIC 02 gua destilada 6 CH 52,88 CD *

TR-VIC 16 D. mollisfungi 12 CH 52,88 CD *

TR-VIC 08 Sulphur 6 CH 39,34 D *

TR-VIC 06 Cyrtopodium1D 21,34 D *

TR-VIC 03 gua destilada 12 CH 9,20 D *

Quadro 9: Teores mdios de Rutina, (g/mL) em folhas de Dimorphandra

molliscorrespondentes aos tratamentos TRF-MOC 01 a TRF-MOC 12.

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TRATAMENTOS MDIAS

TRF MOC 09 876,31A

TRF MOC 01 874,81A

TRF MOC 08 716,60A

TRF MOC 05 665,29A

TRF MOC 02 660,11A

TRF MOC 06 653,32A

TRF MOC 11 618,63A

TRF MOC 04 490,78A

TRF MOC 03 458,46A

TRF MOC 10 457,83A

TRF MOC 07 318,87A

TRF MOC 12 257,29A

As mdias seguidas de uma mesma letra no variam estatisticamente pelo

teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Quadro 10: Teores mdios de Rutina (g/mL) em frutos de Dimorphandra

mollis d t t t t TFR MOC 01 TFR MOC 12

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molliscorrespondentes aos tratamentos TFR-MOC 01 a TFR-MOC 12 .

TRATAMENTOS MDIAS

TFR MOC 08 56052,03A

TFR MOC 12 55753,46A

TFR MOC 07 49701,83A

TFR MOC 04 48634,74A

TFR MOC 02 47729,89A

TFR MOC 01 47064,55A

TFR MOC 05 43355,13A

TFR MOC 09 38222,32A

TFR MOC 10 34388,21ATFR MOC 03 33756,02A

TFR MOC 11 33170,04A

TFR MOC 06 25720,36A

As mdias seguidas de uma mesma letra no variam estatisticamente

pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.


espess ra de 0 250 mm) fase m el MEOH/ ACEOT (25 75) e re elador AlCl3

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espessura de 0,250 mm), fase mvel MEOH/ ACEOT (25:75) e revelador AlCl3

foram positivos em PPt-PO (Rf = 0,56 e 0,69).

4.1.7. Extrao e Processamento de rutina em extrato metanlico

O clculo de rendimento foi feito tendo como base a massa inicial de p

de frutos de D. mollis(150 g) obtendo teores mdios de 38,38% (tm = 38,38%)

e no doseamento de flavonides de 32,51%.

Anlises cromatogrficas por camada delgada (CCD) tendo como

padres Rutina (Rf = 0,54) e Quercetina (Rf = 0,68), com fase estacionria


espessura de 0,250 mm), fase mvel MEOH/ ACEOT (25:75) e revelador AlCl3

foram positivos em PPt-PO (Rf = 0,53 e 0,65).

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4. 2. DISCUSSO

4. 2.1 Triagem fitoqumica nos tratamentos TF-MOC, TFR-MOC, TRS-MOC,

TR-VIC, TR-PO e em TR-VIC 01 a TR-VIC 16

A triagem fitoqumica a metodologia mais utilizada na obteno de

informaes da constituio qumica de plantas permitindo inferir quais as

possveis substncias que esto presentes na amostra e origem biossinttica.

O conhecimento dos constituintes qumicos de diversas partes da planta

favorece o seu uso sustentvel e contribui na sua preservao.

A cromatografia em camada delgada (CCD) utilizada com freqncia

na anlise vegetal, em virtude da simplicidade, rapidez, sensibilidade e pelo

rigor dos resultados, sendo utilizados na identificao e na padronizao dos

frmacos pelas farmacopias. So fixadas condies tais como adsorventes,

espessura das placas umidade eluentes que determinam a velocidade de

taninos em sua casca (FERREIRAet al, 2001; CHAVES et al, 2001; SILVA,S et al,

2003; FARIA et al 2005; PEDRIALI et al 2005)

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2003; FARIAet al, 2005; PEDRIALIet al, 2005).

O uso de preparados homeopticos interfere no metabolismo secundrio

de D. mollisinferindo em alterao dos nveis de compostos fenlicos (quadro

4). interessante salientar que as escolhas dos preparados homeopticos

decorrem de pressuposies e resultados de ANDRADEet al (2001); ARMONDet

al(2004); CASTROet al(2003), BONATo et al(2005); SUKUL et al(2006,2002);

DATTA (2006);HAMMAN et al(2003);BETTI et al(2003a, 2003b).

A utilizao de gua destilada como testemunha, seus preparados

dinamizados em 6 CH e 12 CH, bem como de Etanol 70% em 6 CH e 12 CH

teve como inteno evitar contestaes a respeito da possvel ao da gua e

do lcool etlico dinamizados como fatores de ao ou inibio de taxa de

compostos secundrios.

O uso dos medicamentos homeopticos Phosphorus 12 CH, Kali

phosphoricum12 CH e Carbo vegetabilis12 CH, nas condies dessa anlise,

favoreceu aumento da sntese de flavonide (rutina 3-rutinosdeo quercetina),

o que pode ser interessante em cultivos de subsistncia em agricultura familiar

e na recuperao de sistemas agroflorestais visando o manejo sustentado e

conseqente extrao de rutina Outro aspecto interessante a ser considerado

isolada de flavonides (rutina e quercetina). Especificamente quando se utilizou

o preparado homeoptico gua destilada 12 CH relacionou-se ao processo de

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o preparado homeoptico gua destilada 12 CH relacionou se ao processo dediluies e dinamizaes sucessivas em Homeopatia que visam diminuir a

massa molecular (matria) e aumentar o estado energtico vibracional das

molculas, resgatando a informao.

O efeito do solvente (gua) pode ser entendido em funo da teoria do

estado energtico de transio, onde o aumento da constante de velocidade

devido a um fator entlpico (diluies e dinamizaes) pode resultar no

aumento da entalpia do estado inicial e decrscimo no estado de transio e

liberao energtica vibracional (SILVA &JONESJR, 2001).

A segunda lei da Termodinmica determina que quanto maior a

desordem do sistema, maior entropia". A entropia associada ao grau de

desordem, mede a parte da energia que no pode ser transformada em

trabalho, funo de estado cujo valor cresce durante o processo natural em

algum sistema fechado, como acontece quando dinamizada e succusionada

a preparao homeoptica.

As relaes preparado homeoptico/ plantas/ entropia/ entalpia podem

ser relacionadas Teoria dos Sistemas (BERTALANFFY, 1968): A vida um

estado energtico onde o caos (entropia) mantm interao dinmica e

secundrios; mostrando que a entropia (desordem da informao) em pequena

escala tambm ajuda no melhoramento/ aprimoramento dos sistemas

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escala tambm ajuda no melhoramento/ aprimoramento dos sistemas.Neste sentido, pode-se explicar a ao da gua destilada 12 CH,

segundo PORTO et al (1998) que analisam as alteraes das propriedades

biolgicas e fsico-qumicas da gua induzidas por campos eletromagnticos e

relatam que a ausncia de soluto (partculas) e mudanas no comportamento

da gua podem ser devido distribuio de clustersde diversos tamanhos e

formas na gua lquida, destacando que a explicao mais plausvel a esse tipo

de comportamento seja a reorganizao das molculas de gua durante o

processo de magnetizao. Esclarece que o movimento de um on, partindo de

um estado estacionrio, devido a um campo eltrico aplicado, pode ser obtido

relacionando-se a FEM (fora eletro-motriz), soma dos retardamentos

causados pelo atrito; pela assimetria e eletroforese, que so intensificados

medida que a concentrao eletroltica aumenta, o que causa aumento das

foras de retardamento e diminuio da condutividade; logo quanto mais

diluda a soluo, maior a energia vibracional, maior o campo energtico e

menor a concentrao eletroltica, como ocorreu em gua destilada 12 CH (1x

10-12dinamizada e diluda).

Ainda HARARI & LIN (1989) trabalhando com gua magnetizada

TR-VIC 01 a TR-VIC 16, exceto em TR-VIC 03 (gua destilada 12 CH); TR-VIC

06 (Cyrtopodium 1D); TR-VIC 12 (Carbo vegetabilis 12 CH) e TR-VIC 13 (Pequi

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( y p ); ( g ) ( q6 CH Caryocar brasiliensis frutis) pode ser relacionada necessidade de

defesa da espcie frente aos tratamentos homeopticos caracterizando

patogenesia. Entende-se por patogenesia nesta situao, o aparecimento de

compostos novos, no necessariamente presentes na espcie, quando

analisada isoladamente como ocorreu aps anlise dos frutos (TFR-MOC), das

folhas (TF-MOC) e do p (TR-PO). Segundo BONATO (2004) patogenesia o

padro de desequilbrio energtico ocasionado pelo medicamento homeoptico

em plantas sadias.

MONTEIRO et al (2005) lembram que D. mollis possui propriedades

tanantes, e por tais, denominada popularmente como falso barbatimo

(Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville) sendo muitas vezes,

erroneamente coletada como tal, contudo SANTOS et al (2002) ao analisar

taninos em D. mollis, relatam a presena de catequina, epicatequina

(monmeros) e de polmeros condensados em cascas, no detectando em

folhas, que continham apenas glicosdeos flavnicos.

No h relatos de cardiotnicos em plantas adultas ou em frutos de D.

mollis como ocorreu nos tratamentos TF-MOC; TFR-MOC e TR-PO que

cardacos que tm dose letal (DL50 = 0,18 mg/kg), com ao imediata

(FOERSTER et al, 1

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