C DIVISION DEClENCtAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

1 . COObINADOR DE SISTEMAS ESCOLARES

licenciatura en Ingeniería Bioquímica Industrial concluyó su Servicio Social, mismo que fue realizado en el Proyecto “Caracterización en cultivo superficial y sólido de dos cepas de hongos en presencia de 3,4-dicloroanilina” bajo la asesoría del Dr. Sergio Huerta Ochoa ye1 Dr. Rafael Alfredo Chávez. , -

$:*&;*::p. .e L ‘- ,/’

e ’extiende- 1a.presente para los fines que al interesado convengan, a veinticuatro de Julio ~ , .I de mil nqve‘cientos noventa y siete.

/

Av. Miclioadn y La Purfsima, Col. Vicentina, D.F. C.P. 09340,Tel: (5) 724-46-79, Fax (5) 612-80-83 ’ - -2:- I

>

9123501 1

UNl\.'ERSID.AD Al.TÓSO\l.\ 31ETROPOI 1:NID.AD lZTAP.ALAP.4

D I V I S I ~ X DE CIESCIAS B I O L ~ C I C A S Y DE

..IT

LA

TRI3IESTRE LECTIVO 97 -P€UALAVER4

20 HORAS A LA SE?vIA&A

C.UUCTERIWCI~)N EN CWLTIVO SUPERFICIAL Y SÓLEDO DE DOS CEPAS DE HOSCOS EN PRESENCLA DE 3,.IDICLOROA3!lLLUA

DR SERCIO HUERTA OCHO.\ k' DR. RAFAEL ELFREDO CH-iVEZ FUVERA

PROFR. TITULAR A PROFR. TITI!LAR B

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGLA

DEPARTAMLYTO DE LYG. DE PROCESOS E HIDRAULICA

PLANTA PILOTO DE FERMENTACIONES DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOG~A

FECHA DE lSlC10 9 DE OCTUBRE DE 1995 FECHA DE TERMIXACI~N 9 DE ABRlL DE 1996

CLAVE IBI - 040 - 95 - .- ."

FORMA P.IRTE DEL PROYECTO INTERDIVISIOSAL ESTLDIO DEL COMPORTAMIENTO DE REACTORES BI0Lb)GICOf)S PARA

1 FEILtiENTAClONES EN SUSTRATO S Ó L m Y LíQUIDO

RlVERA

/ "

/"

LlZBETH CANTI;' REYES &

I

México, D.F. a 4 de julio de 1997

Dr. José Luis hedondo Figueroa Director de la División de C.B.S. P r e s e n t e

Por medio de la presente comunico a usted que la alumna Lizbeth Cantú Reyes de la Licenciatura de Ingenieria Bioquímica Industrial con matrícula 9123501 1 terminó de manera satisfactoria el Servicio Social titulado “Caracterimión en cultivo superficial y sólido de dos cepas de hongos en presencia de 3,4 dcloroanilina”. Se ha revisado el -informe final que se le anexa y le manifiesto que el contenido del mismo es satisfactorio.

Sin más por el momento y agradeciendo de antemano la atención prestada a la presente, le envío un cordial saludo.

A t e n t a m e n t e “Casa Abierta al Tiempo”

Dr. Sergio Huerta Ochoa Profesor Titular Depto. Biotecnología, CBS

”

UNDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y La Purísima. Col. Vientina. 09310 México. D.F. Tel.: 7214999 FAX: (5) 7214712

México, D.F. a 4 de julio de 1997

Dr. José Luis Arredondo Figueroa Director de la División de C.B.S. P r e s e n t e

Por medio de la presente comunico a usted que la alumna Llzbeth Cantú Reyes de la Licenciatura de Ingeniería Bioquímica Lndustrial con matrícula 91 23501 1 terminó de manera satisfactoria el Servicio Social titulado “Caracterizacion en cultivo superficial y d i d o de dos c e p a de hongos en presencia de 3,4 dc lormi l ind’ . Se ha revisado el d o m e final que se le anexa y le manifiesto que el contenido del mismo es satisfactorio.

Sin más por el momento y agradeciendo de antemano la atención prestada a la presente, le envío un cordial saludo.

A t e n t a m e n t e “Casa Abierta al Tiempo”

Profesor Titular

UNIDAD ETAPALAPA AV. MichNcán y La Purísima. Col. Vicentina 09340 México. D.F. Tel.: 7244999 FAX: (5) 7244712

Ref: Carta de justificación

México, D. F. a 4 de julio de 1997

A quien corresponda:

Por medio de la presente manifestamos lo siguiente: Inicialmente este trabajo tenía por título “Biodegradación de 3,4 Didoroanilina por hongos en cultivo sólido”, sin embargo, al revisar detenidamente su estructura y la importancia del tema, se determinó que se requerían de experimentos previos para llevar a cabo una cinética de degradación. Por lo tanto, se replantearon los objetivos y por consiguiente el título del trabajo. Para concluir este proyecto de manera satisfactoria se requirió de un tiempo mayor a lo establecido inicialmente en la propuesta inicial.

Para cualquier aclaración nos ponemos a sus órdenes a la extensión 4999

A t e n t a m e n t e “Casa abierta al tiempo”

Dr. # ergio Huerta Ochoa i

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISIóN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

CARACTERIZACI~N EN CULTIVO SUPERFICIAL Y SÓLTDO DE DOS CEPAS DE HONGOS EN PRESENCIA DE 3,4-DICLOROANILINA

REPORTE DE SERVICIO SOCIAL QUE PRESENTA

LIZBETH CANTÚ REYES

PARA OBTENER EL TITULO DE L\ceL)CLATc)eA E d

INGENIERO BIOQUblICO INDUSTRIAL

ASESORES

DR. SERGIO HUERTA OCHOA I DR. RAFAEL ALFRED0 CHÁVEZ RIVERA

MÉXICO D.F. JUNIO DE 1997

AGRADECIMIENTOS

Agradesco al Dr. Sergio Huerta su apoyo y dirección para realizar éste trabajo.

Al Dr. Rafael Chávez por sus comentarios y recomendaciones.

De manera muy especial al Dr. Ernesto Favela Torres por su contribución para consumar éste trabajo.

A mis amigos Angélica Jiménez y Alejandro Medina por su apoyo y ayuda incondicional durante todo éste trabajo.

Contenido

Portada

Agradecimientos

Indice 1

Resúmen 3

l . - Introducción 2.- Objetivos 3 .- Materiales y Métodos

3.1 Microorganismos 3.2 Preparación de la Muestra y Medios de Cultivo

3.2.1 Medios de cultivo 3.2.2 Preparación de la muestra

3.3 Aislamiento de cepas 3.4 Caracterizacibn macroscópica 3.5 Identificación de cepas

3.6 Método de adaptación de las cepas para la degradación de 3.5. I Técnica de microcultivo para la identificación de cepas

3,4- Dicloroanilina

4 5 6 6 7 7 7 8 8 9 9 10

3.7 Técnica de procesamiento de mágenes 11 3.8 Metodología para realizar la fermentación en medio sólido de 3,4- 12

Dicloroanilina en columnas de vidno usando como soporte bagazo de caiía. 3.8.1 Preparación del inóculo 12 3.8.2 Tratamiento del bagazo de caña 13 3.8.3 Preparación de las columnas 14

3.9 Técnicas Analíticas 15 3.9.1 pH 15 3.9.2 Humedad ” 15 3.9.3 Técnica para cuantificar cloro 16 3.9.4 Determinación de 3,4-DCA por HPLC 16

1

4. - Resultados 4.1 Aislamiento de l a s cepas 4.2 Caracterización e identificación.de las cepas aisladas 4.3 Velocidad de crecimiento radial 4.4 Tiempo de esporulación 4.5 Procesamiento de imágenes 4.6 Fermentación en medio sólido

4.6.1 pH ..

4.6.2 Humedad 4.6.3 Cuantifícación de cloro 4.6.4 Cuantificación de 3,4-DCA por HPLC 4.6.5 Velocidad de consumo de 3,4-DCA 4.6.6 Porciento de consumo de 3,4-DCA en relación teórica.

5 .- Conclusiones 6. - Propuestas 7.- Bibliografia

17 18 18 19 20 21 22 22 23 24 24 25 27 28 28 29

c

2

La biodegradación de compuestos xenobióticos empleando microorganismos adaptados a nivel

laboratorio se presenta como una alternativa al problema ambiental. Los objetivos del trabajo

fueron: aislar, adaptar y caracterizar dos cepas de hongos en presencia de 3,4-dicloroanilina (3,4-

DCA), la cual se utiliza como intermediario en la producción de herbicidas y pimentos azo. Las

cepas se aislaron de un cultivo mixto comercial liofilizado y se adaptaron a concentraciones de

34DCA de 25, 50, 75 y 100 mg/l en cultivo superficial. Los estudios de caracterización de las

cepas aisladas- se realizaron a las mismas concentraciones que en la adaptación. La

caracterización macroscópica se realizó utilizando microcultivos y procesamiento de imigenes

sobre placas de agar. La degradación de 34DCA en cultivo sólido se realizó en pequeñas

columnas de vidno empleando como soporte bagazo de caña a diferentes concentraciones de

3,4DCA. Las cepas aisladas pertenecen al género Aspergilfus sp. y Rhizopus sp. Se observó en

ambas cepas que la tasa de crecimiento radial disminuye al aumentar la conceración de 3,4DCA,

obteniéndose una reducción de alrededor del 40% al pasar de O a 25 mg/l

Se obtuvo un comportamiento similar en la tasa de crecimiento estimada. Finalmente se logró

una total degradación de 3,4DCA en cultivo sólido después de 4 días de incubación a 30°C. Se

concluyó que l a s cepas sufren cambios en su crecimiento y morfología en presencia de 3,4DCA.

3

LINTRODUCCI~N Muchos compuestos recalcitrantes pasan alterando la composición biológxa de las plantas de

tratamiento de aguas residuales. La adición de cepas microbianas que degraden un compuesto en

particular es un principio para resolver este problema.

La 3,4Dicloroanilina es un compuesto aminoaromático halogenado, es usado como

intermediario en la síntesis de herbicidas y compuestos azo. Éste compuesto tiene la

característica de tener baja solubilidad en agua y esto provoca que se adhiera fuertemente a la

tierra, origmando un problema de contaminación ambiental, también tiene efectos tóxicos en la

población que se encuentra en contacto con éI ya que provoca carcinoma de vejiga y alteraciones

del sistema nervioso central.

La 3,4-Dicloroanilina tiene una producción a nivel mundial de 42000 - 47000 tordaño. El 60% es

producido en la Comunidad Económica Europea y el 40% restante lo produce Estados Unidos,

siendo el 95% de la producción total empleado para la manufactura de herbicidas. La 3,4-

Dicloroanilina es un compuesto que persiste en el medio ambiente. En éste trabajo se trata de

provar dos cepas de hongos previamente caracterizadas que degraden la 3,4-Qcloroanilina

siguiendo el proceso de fermentación sólida.

Uno de los trabajos realizados en la degradación de compuestos recalcitrantes íüe realizado sobre

la biodegradación de 3,4-Dicloroanilina empleando un bioreactor de lecho fluidizado en estado

sólido utilizando una biopelícula con células inmovilizadas. Éste trabajo demostró que en el

reactor de lecho fluidizado y bajo las condciones del experimento la tasa de degradación de 3,4-

DCA fué de 0.09 g (34-DCA)/ g (biomasa) h . No hay reportes en los que se emplee la

fermentación en estado sólido para degradar 3,4-DCA.

Algunas veces es necesario conocer la tasa de crecimiento (p) de algunos organismos usados para

la industria de las fermentaciones. Una alternativa para evaluar p es usando la técnica de

procesamiento de imágenes, éSta técnica permite cuantificar la morfología de hongos

filamentosos asi como su tasa de crecimiento empleando placas de agar en términos de la

siguiente ecuación p = Ln2(Vr/Le) propuesta por Viniegra GQnzález y colaboradores en 1992.

Así p está en función de la velocidad de crecimiento radial y de la longitud media de la hifa.

4

2.- OBJETIVOS

Aislar dos cepas de hongos que degraden 3,4-DCA a partir de un liofiizado, así

como su caracterización macroscópica y microscópica. Estimando la tasa de

crecimiento aparente de cada cepa por la técnica de procesamiento de imágenes y

evaluando la degradación de 3,4-DCA en medio sólido.

5

3 .-MATERLAL Y MÉTODOS

En los íltimos años se ha incrementado la biodegradación de los compuestos xenobióticos, los

cuales requeren de la presencia de una comunidad microbiana que se integre de diferentes

microorganismos. Para éste trabajo se obtuvo un cultivo industrial proporcionado p o r INTERBIO

LTD (UK) denominado HAB (halogenated aromatic bacteria). La HAB está compuesta p o r cinco

Pseudomonas sp., una Klebsiella sp., cuatro Rhodococci sp. y dos cepas de hongos, todos

estabilizados sobre una base de cereal (Goulding et a1.,1988). La viabilidad de éstos

microorganismos ha mostrado que degradan compuestos aromáticos halogenados (Goulding et

a1.,1988; InterBio Ltd.,1990).

3.1 MICROORGANISMOS

A partir de una muestra del cultivo mixto liofilizado, se aislaron las dos diferentes cepas de

hongos, utilizando como medio de cultivo estándar Papa Dextrosa Agar a una temperatura de

3OoC. El aislamiento de las cepas se realizó por el método de resiembra en placa seguido de su

caracterización macroscópica en cajas petri y tubos Ralph. En la parte correspondiente a la

identificación taxonómica se llevó acabo la técnica de microcultivo. Se realizó la adaptación de

las cepas a diferentes concentraciones de 3,4-DCA, las cuales fueron de 25 mg/l, 50 mg/l, 75

mg/l y 100 mg/l observando así sus características macroscópicas y microscópicas en cada caso.

Se determinó la tasa de crecimiento aparente estimada así como los cambios morfológicos que

presenta cada cepa empleando la técnica de procesamiento de imágenes para cada etapa de

adaptación de cada una de las cepas. Se evaluó la degradación de 3,4-DCA en medio sólido

utilizando pequeñas columnas empacadas empleando como soporte bagazo de caña y

concentraciones de 25 mg/l, 50 mg/l y 100 mg/l de 3,4-DCA como única fuente de carbono.

6

3.2 PREPARACIóN DE LA MUESTRA Y MEDIOS DE CULTIVO

3.2.1 MEDIOS DE CULTIVO. Papa Dextrosa Agar (PDA, preparar según las condiciones de la marca comercial).

Medio Mineral Para La Biodegradación de 3,4-Dicloroanilina (ver Tabla 1).

Tabla 1. Composición del Medo Mineral (MM) empleado en la degradación de 3,4-DCA

COMPUESTO CONCENTRACION (m@)

Na2HP04 O. 5 MgSO47H20 0.48 (Nt4)2so4 0.35

0.3

FeS04 7H20 0.03 CoCI, 6H20 0.01

ZnS04 0.007 Na2M04 2H20 0.003 MnC12 6H20 0.002 NiCI2 6H20 0.002

0.002 CUClZO 0.001

Ca(NO3 12 0.04

3.2.2. PREPARACIóN DE LA MUESTRA

Para llevar a cabo el aislamiento de las cepas se hace un pretratamiento a la muestra (liofilizado)

antes de ser inoculada en el medio de cultivo (PDA), todo en condiciones asépticas.

1.- Se prepara una solución fisiológca estéril al 0.9 % (NaCI), para hacer un lavado de la

muestra a fin de desprender las esporas o micelio que en ellas se encuentre.

2.- Del liofilizado se tomó una cantidad de muestra de aproximadamente 2g que fué suspendida

en la solución fisiológica estéril, de esta suspensión se tomó un inóculo y se sembró por estría

simple en placas de PDA por duplicado, incubandolas a 30 C durante 8 días.

3.-Se prepara una sene de tubos que contengan 9 m1 de agua destilada previamente esterilizada.

4.-Se toma un tubo con 9 m1 de agua destilad5 estéril y una placa de 8 días de incubación. De la

placa se tomó la mayor cantidad de inóculo con una asa bacteriológica, diluyendo el inóculo en

el agua, obteniendo una suspensión muy concentrada.

7

5.-De esta suspensión se toma un m1 y se adiciona a uno de los tubos previamente preparados, se

agita y se obtiene una dilución 1 O-', de esta manera se hacen las diluciones hasta 1 O4

6.-Se toman las tres últimas diluciones ( IO4, 10-5,104) para hacer la inoculación uniforme de O. 1

m1 en el medio PDA. Posteriormente se incubaron a 30 "C durante 120 h.

3.3.AISLAMIENTO DE LAS CEPAS

Concluido el tiempo de incubación (120 h), de cada colonia, se realizaron consecutivamente

resiembras por piquete y p o r estia simple hasta obtener finalmente cepas puras de hongos

fiiamentosos en el mismo medio de cultivo y a la misma temperatura.

3.4. CARACTERIZACI~N MACROSC~PICA

Identificación y caracterización macroscópica.

Para llevar a cabo la identificación se hicieron estudios en medio estandar (PDA) que es

recomendado para el crecimiento de hongos filamentosos, de acuerdo a la siguiente metodología.

1 .- Trabajar a partir de una cepa pura previammente aislada.

2.- Preparar medios : a) medio de cultivo estánciar (PDA), según las instrucciones de la marca

comercial, ajustar el medio a pH de 5.0. b) medios de cultivo que se emplean en la adaptación de

las cepas para degradar 3,4-DCA , preparar como se indica en la tabla 2.

Tabla 2. Medios de cultivo empleadoos para la caracterización macroscópica.

MEDIO m PDA AGAR 3.4-DCA

DE ( 1 ) (s/l) BACTERIOL~GICO ( m@)

CULTIVO f m PRIMER ESTADO 1 25 15 0.0

SEGUNDO 1 12.5 15 25

ESTADO

TERCER ESTADO 1 7.5 15 50

CUARTO ESTADO 1 2.5 15 75

Q W O 1 0.0 15 I O8

ESTADO

3.- Vaciar a cajas pem y dejar solidificar los medios de cultivo.

4.- Preparar tubos de Ralph estériles de aproximadamente 30cm de longtud, cubiertos en los

extremos con tapones de algodón.

5.- Adicionar a estos tubos 30 m1 de los diferentes medios previamente preparados y dejar

solidificar-

6.- Resembrar las diferentes cepas p o r piquete en el centro de la placa e incubar.

7.- Observar las diferentes características que se presentan en las placas, cada 12 h los primeros

cuatro días y posteriormente cada 24 h obteniendo datos sobre las siguientes características:

Textura del Talo, Color del talo y Crecimiento radial.

8.- Sembrar p o r piquete l a s diferentes cepas en un extremo del tubo de Ralph e incubar.

9.- Hacer lecturas de estos tubos cada 24 h y medir el crecimiento radial con una regla a partir del

punto de inoculación hasta donde halla llegado el crecimiento en el momento de la lectura.

3.5. IDENTIFICACI~N DE CEPAS

3.5.1 TÉCNICA DE MICROCULTTVO PARA LA IDENTIFICACIóN DE LAS CEPAS

La identificación de cepas se llevó acabo por medio de la técnica de microcultivo, cultivadas en

medio estándar (PDA) en condiciones estériles de acuerdo a la siguiente metodología

(Aquiahuatl, 1992):

1 .- En una caja petri colocar un triángulo de vidrio con la ayuda de pinzas.

2.- Sobre el triángulo colocar un portaobjetos

3.- Sobre el portaobjetos, colocar un bloquecito de PDA, previamente preparado, de 1xlxO.3 cm

4.- De cada cepa, sembrar por piquete las cuatro caras iguales del bloque de PDA.

5.- Una vez inoculado, colocar un cubreobjetos sobre éste.

6.- Adicionar 10 m1 de glicerol al 10% a la base de la caja petr i , teniendo cuidado de no tocar el

portaobjetos.

7.- Tapar la caja e incubar a la temperatura y tiempo necesario para su crecimiento.

8.- Concluido el tiempo de crecimiento, se quita el cubreobjetos con unas pinzas y se lleva a

tinción con azul de lactofenol de la siguiente forma: Se coloca una gota de azul de lactofenol -.L

9

sobre un portaobjetos limpio y se pone con cuidado el cubreobjetos que se retiró del

microcultivo, se limpia el exceso de colorante con papel absorbente con cuidado.

9.- Se desecha el bloquecito de PDA y el portaobjetos usado se lleva también a tinción : Con unas

pinzas se quita el bloque de PDA con cuidado, se pone una gota de azul de lactofenol sobre el

micelio y encima de esta se pone un cubreobjetos limpio evitando la formación de burbujas y

quitar el exceso de colorante.

2 2 2 4 1 6 3.6. MÉTODO DE ADAPTACIóN DE LAS CEPAS PARA DEGRADAR 3,4-DCA

PRIMER ESTADO: se toma un inóculo con el asa bacteriológica, de una de las cepas crecida en

PDA y se siembra por estría simple en placas de otro medio de cultivo hecho de : Medio mineral

(MM, antes mencionado Tabla l), 25 gil de PDA y 15 gil de agar bacteriológico. Se incuban a

30°C y se realizan observaciones macroscópicas asi también se determina el crecimiento radial

en tubos Ralph.

SEGUNDO ESTADO: Se toma un inóculo con el asa bacteriológica de la cepa crecida en el

primer estado y se siembra p o r estría simple en placas que contengan el siguiente medio de

cultivo:12.5 g/l de PDA, 25 mgil de 3,4-DCA en medo mineral y 15 g/l de agar bacteriológico.

Se incuba a 30°C y se realizan observaciones macroscópicas asi también se determina el

crecimiento radial en tubos Ralph.

TERCER ESTADO: Se toma un inóculo con el asa bacteriológica de la cepa crecida en el

segundo estado y se siembra p o r estría simple en placas que contengan el siguiente medio de

cultivo :7.5 8/1 de PDA, 50 mg/l de 3,4-DCA en medio mineral y 15 gA de agar bacteriológico. Se

incuba a 30°C y se realizan observaciones macroscópicas asi también se determina el

crecimiento radial en tubos Ralph.

CUARTO ESTADO : Se toma un inóculo con el asa bacteriológica de la cepa crecida en el tercer

estado y se siembra p o r estia simple en placas que contengan el siguiente medio de cultivo :2.5

g/’l de PDA, 75 mg/l_de 3,4-DCA en medio mineral y 15 g/1 de agar bacteriológico. Se incuba a

30°C y se realizan observaciones macroscópicas asi también se determina el crecimiento radial

en tubos Ralph.

10

QUINTO ESTADO: Se toma un inóculo con el asa bacteriológca de la cepa crecida en el cuarto

estado y se siembra por estria simple en placas que contengan el siguiente medio de cultivo : 100

mg/l de 3,4-DCA en medio mineral y 15 g/l de agar bacteriológico. Se incuba a 30°C y se

realizan observaciones macroscópicas asi también se determina el crecimiento radial en tubos

Ralph.

NOTA: todos los medios de cultivo empleados en la adaptación se esterilizan por 15 minutos a

15 lb/in2 . Una vez estériles, en la campana de flujo laminar se adiciona la cantidad

correspondiente de1 tóxico.

3.7. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE IMÁGENES.

Placas de agar: se emplean placas de agar de 10 cm de diámetro y 0.5 cm de espesor; el medio

de cultivo tiene la misma composición que se utilizó en los dferentes estados de adaptación,

éstas placas son inoculadas con O. 1 m1 de diluciones, de tal manera que se tengan de 9 a 15

esporas por placa (por duplicado, para cada cepa) .

MEDICIONES

Tasa de Crecimiento Aparente en Cultivo Sólido ( p ' ): De cada cepa se determinó el

crecimiento radial (Kr) en tubos Ralph en los diferentes estados de adaptación, por regresión

lineal. Éste parámetro esta dado en micrashora. Las hlfas son meddas pot un microscopio a 20x

provisto con una cámara de video conectada al sistema de procesamiento de imágenes. Éste

consiste de una targeta digitalizadora Matrox y un software (Francés) llamado imagen 2000,

corre en una computadora HP vectra QS/20, AT. Las imágenes se guardan en el disco duro. La

longtud de la hifa (Le) se mide por medio del mouse a través de un monitor VGH, previamente

calibrado con una cámara que cuenta glóbulos rojos (Cámara de Neubauer). Se realizan 18

mediciones, tomando 9 lufas de colonias diferentes. La longitud de la hifa (Le) esta en micras. La

tasa de crecimiento aparente estimada se determina p o r la ecuación p' = Ln2(Kr/Le)

Una vez calibrada la pantalla con la cámara de Neubauer y ehfocada la imagen se realizan l a s siguientes mediciones : longitud de la h f a (Le), segmentos entre ramificaciones, diámetro de la

hifa y número de puntas de cada hifa, realizando estas determinaciones de 9 hifas de diferentes

colonias por duplicado realizando los siguientes pasos : se identifica la espora que da origen a las

..

diferentes ramificaciones de la hifa, se toma el origen como punto de partida y se mide hasta la

punta de la hifa principal, de esta manera determinamos el valor de la longitud de la hifa (Le ).

Para determinar el valor de la longitud entre ramificaciones, se sigue el contorno del segmento de

hifa que hay entre ramificaciónes con el mouse y se regstra el valor, de la misma forma se

calcula el valor de el diámetro de la hifa y por observación al microscópio se cuenta el número

de puntas que presenta cada hifa.

3.2.8. ME TO DO LOG^ PARA REALIZAR LA FERMENTACI~N EN MEDIO SÓLIDO

DE 3,4-DCA EN COLUMNAS DE VIDRIO USANDO COMO SOPORTE BAGAZO DE CAÑA.

Para realizar la fermentacih en medio sólido se prepararan. 3 columnas testigo cada una con una

concentración diferente de 3,4-DCA, las cuales son 25, 50 y 75 mg/l, sin inóculo. Se prepara una

columna testigo en ausencia de 3,4-DCA y se inoculará. Por últirno se preparan columnas que

contengan 25, 50 y 100 mg/I de 3,4-DCA, con inóculo, por duplicado, para cada cepa. Se

r e a l i d n análisis de cada columna al inicio y al final de la fermentación. Las determinaciones

que se realiza a cada una de las columnas es determinar: humedad, pH, concentración de ión

cloro, y determinar la concentración de 3,4-DCA por HPLC.

3.8.1. PREPARACIóN DEL INÓCULO

Preparar 1200 m1 de medio de cultivo con las siguentes concentraciones de los diferentes

ingredientes : 7.5 g/1 de PDA, 50 g/1 de 3.4-DCA en medio mineral y 15 gA de agar

bacteriológico. Esterilizar el PDA con el agar bacteriológico, 15 min, 15 lb/in2 ; y en la campana

de flujo laminar adxionar la 3,4-DCA.

1 .- Preparar una solución de twen 80 al 1 % estéril (dividirlo en dos matraces).

2.- Preparar 6 matraces Erlenmeyer de 500 ml, adicionar a cada uno 200 m1 de medio de cultivo.

3.- Sembrar cada una de las cepas por triplicado en los matraces; tomando el inóculo de una cepa

1

del tercer periodo de adaptación. Incubar los matraces a 30 o C p o r 60 h. 4

12

4.- Después del periodo de incubación y el dia de arranque de la fermentación se realiza lo

siguiente: a cada matraz se le adicionan 20 m1 de la solución de Twen 80 y un agitador

magnético. Colocar cada uno sobre una parrilla y hacer girar el agitador hasta que desprenda la

mayor cantidad de esporas del agar. Vaciar la suspensión de esporas a un matraz y contar las

esporas para determinar la cantidad de ink.ula que se requiere para tener 2x10 esp/gms. 7

3.8.2- TRATGMTENTO DEL RAGAZO DE CAÑA

MEDIO DE CULTIVO.

Preparar medio mineral adicionando 50 dl de glucosa y ajustar el pH a 5 con una solución de

ácid0 clorhídrico al 20% o con una solución de hidróxido de sodio 1 N, esterilizar 15 min 15

Win’.

Se esteriliza el bagazo de caña 15 min 15 lb/in’ . La esterilización se realiza empleando el 50%

de medio de cultivo y la cantidad de bagazo seco que se requiere para cada columna, como se

muestra en la tabla 3. El medio de cultivo restante se adiciona a tubos de ensayo con rosca para

esterilizarse y sobre éste preparar la solución C.

I

4 4.5 5 4.5 6 9 7 9 8 9 9 9 10 9

PREPARACI~N DE SOLUCIONES

SOLUCIóN A : Preparar una solución de 3,4-DCA, etanol y agua de la siguiente forma: pesar

52.5 mg de 3,4-DCA, disolverla en 2.5 m1 de etanol y aforar con agua destilada hasta 10 ml,

adicionando el agua muy lentamente. Tener cuidado de que el compuesto no precipite, si esto

sucede hay que volver a preparar la solución.

-

&

SOLUCIóN B : Preparar una solución de mida de sodio de O. 1575 mg/ml.

13

SOLUCI~N c. Esta solución se prepara como se muestra en la tabla 4 y se realiza en los tubos de ensaye que

contienen el MM restante estdril, utilizando material est&í1 y en la campana de flujo laminar.

Tabla 4. Preparación de la solución C. MEDIO MINERAL SOLUCION A SOLUCION B ESPORAS AGUA

(mu ( m u ( m DESTILADA

ESTÉRIL (ml)

4.4 1 0.05 1.0 0.43

4.41 o. 1 1 .o O. 18

4.4 1 0.2 1 .o 4.41 1.0

4.41 o. I 1.58

8.82 o. 1 2.0

8.82 o. 1 0.2 1.47

8.82 0.2 2.0

8.82 0.2 0.2 1.46

8.82 0.4 2.0

8.82 0.4 0.2 1.44

3.8.3. PREPARACIóN DE LAS COLUMNAS

Preparar 17 columnas de 2.3 cm de diámetro y 12 cm de altura, a cada una colocar un tapón de

algodón en el fondo, encima de éste poner una rueda de papel fiItro y tapar la columna con un

tapon de hule, etiquetar correctamente cada columna. Esterilizar durante 15 min a 15 Ib/in2 .

LLENADO DE LAS COLUMNAS

1.-A cada matraz que contiene el bagazo estéril se adciona la solución C respectivamente,

hornogenizando perfectamente el bagazo después de adicionar la solución, con una espátula de

fierro estéril. I

2.-Se toma una muestra de bagazo (6g) que corresponda a cada columna. Guardar en una bolsa

de plastic0 cada una de las muestras, rehgerarlas para posteriormente hacer los análisis

correspondientes.

14

3.-En una balanza granataria colocar una columna pesarla y llenarla con el contenido del matraz

que le corresponda, hasta aproximadamente 9 cm de altura.

4.-Una vez que se adicionó el material a cada columna, se coloca una rueda de papel filto estéril

y encima de ésta un tapón de algodón estéril.

5.-A cada columna se le coloca un tapón de hule en la superficie y en el extremo inferior se le

adapta un humidificador.

6.-Todas las columnas se mantienen en una pecera con agua a una temperatura de 30' C durante 4

días.

7.- Al finalizar la fermentación se realizarán l a s pruebas iniciales y finales de la misma, siendo

éstas: cuantificación de pH, humedad, cloro, concentración de 3,4-dca por hplc.

3.9. TÉCNICAS ANALÍTICAS

3.9.1. pH

a) calibrar el potenciómetro (Conductronic pH 20), primero a pH 7 y después a pH 4 ,

enjuagando y secando el electrodo en cada paso, utilizar agua destilada. y determinar el pH de la

muestra.

pH del Medio sólido

Para determinar pH se toma lg de materia sólida y se adicionan 1 O m1 de agua y se agita por 1

min. y se mide el pH.

3.9.2. HUMEDAD

a) Se emplean charolas de alumio y se ponen a peso constante, es decir, se secan a 100 O C en

una estufa y se pesan cada 3 horas hasta llegar a un peso constante, usando una balanza analítica.

b) se toma 1 g de materia húmeda y se deposita en una de las caharolas de aluminio; ésta se

mantiene en la mufla por 2 horas a 100 o C, esto se realiza para cada una de las columnas,

Después de este tiempo se sacan las charolas y se pesan, posteriormente se determina el % de

humedad de cada una de las columnas.

3.9.3. TÉCNICA PARA CUANTIFICAR CLORO

A) Preparar una solución A de tiocianato de mercurio (Hg(SCN)* de la siguiente manera: disolver

O. 1 g de Hg( SCN)* en 1 O0 m1 de un solvente preparado con 90 m1 de dioxano y 10 mi de etanol.

B) Preparar una solución B de la siguiente manera: disolver 8 g de sulfato de amonio férrico en

100 m1 de ácido nítrico 6 N y filtrar.

C) Preparar una solución estandar de cloruro de sodio (NaC1) de 100 mg/l y preparar una curva

como se muestra en la tabla 5.

TABLA 5. CURVA ESTÁNDAR DE NaCl PARA CUANTIFICAR IÓN CLORO

Tubo Conc. Agua Sln. de NaCl

(mgil) ml ml

O O 2.5 O

1 20 2.0 o. 5

2 40 1.5 1.0

3 60 1 .o 1.5

4 SO 0.5 2.0

5 1 O0 O 2.5

A cada tubo adicionar lml de la solución B y 3ml de la solución A, el tubo se tapa y se agta,

despues de 10 min se lee la absorbancia de cada tubo a 460 m.

Para determinar la concetración de cloro en muestras problema se toman 2.5 m1 de ésta y se le

adiciona las soluciones A y B en las proporciones ya mencionadas y se lee la absorbancia a 450

m.

3.9.4 DETERMINACIóN DE 3,4-DCA POR HPLC

La 3,4-DCA fué determinada por cromatografia de líquidos de alta resolución. Un HPLC- THERM0 equipado0 con un detector serial U V , una columna C18 de 25 cm de longtud y un

software LCTPALK versión 2.03 DHPLC. Se manejó una longitud de onda de 240 m, a una

presión de 2450 psi y se inyectó 1 microlitro de cada muestra. La relación entre el área del pico y

la concentración de la muestra se obtuvo por medio de una curva estándar de calibracibn, siendo

el tiempo de retención de la muestra de 2.8 min. &

16

4. RESULTADOS

1

17

4.1 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS

Los resultados del aislamiento de las dos cepas de hongos a partir del cultivo mixto liofilizado

son 20 cajas petri en total para cada cepa y su duplicado, empleando como medio de cultivo PDA

e incubando a 30 "C.

4.2 CARACTERIZACI~N E IDENTIFICACI~N DE LAS CEPAS AISLADAS

CEPA A B

MEDIO DE CULTIVO PDA PDA

TEMPERATURA e C j 30 30 I

TEXTURA DEL TALO ALGODONOSA POLVOSA

COLOR DEL TALO BLANCO BLANCO

OBSERVACIONES FORMA UNA SOLA COLONIA FORMA VARIAS COLONIAS I

I ESPORAS DE COLOR NEGRO ESPORAS DE COLOR VERDE

De los resultados de la observación en cajas petri y tubos Ralph de las dos diferentes cepas, y su

identificación taxonómica por medio de la técnica de microcultivo. Se obtuvieron dos cepas de

hongos filamentosos que pertenecen a dos géneros dstintos que son Rhizopus sp. que

corresponde a la cepa A y Aspergillus sp. que corresponde a la cepa B.

Rhizopus sp. Aspergillus sp.

4.3 VELOCJDAD DE CRECIMIENTO RADIAL

GRTCAS Rhizopus sp.

450

400 1 350

E I E 300 1 v A

[&+-e "A

o 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1011 12131415161718

250

200

150

1 O 0

50

O

-

o 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1011 12131415161718

TIarnpo de inaubaoi6n (dh8)

Frg. 1 Crecimiento radial a diferentes concentraciones de 3,4-DCA. A s p e r g i l l u s sp.

300 r 3.4 dicloro anilina - O m g / l - 26 mg/l 5 0 m g / I - 7 5 I

- v € 1 E 200

1 50

1 O0

50

O

T

o 2 4 6 a 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 20 22

Tiempo da i n c u b a c i 6 n (dlaa)

Fig. 2 Crecimiento radial a diferentes concentraciones de 3,4-DCA

19

De los experimentos graficados en las fig. 1 y 2 (ver datos en el Anexo 1) se determinó una

velocidad de crecimiento radial denominada como Kr, éste parámetro tiende a disminuir a

medida que se incrementa la concentración de 3,4-DCA como se observa en la tabla 6.

Tabla 6. Velocidades de crecimiento radial determinadas en diferentes concentraciones de

3,4-DCA. Rhizopus sp. Aspeqillus Sp.

CONC. DE 3,4DCA Kr CREClMlENTO Kr CRECIMIENTO

o w l ) (mm/día) % (mm/día) %

O 21.281 8 1 O0 7.8 1 O0 25 14.163 66.54 4.4 56.41 50 4.6964 22.06 2.6967 34.57 75 3.0035 14.11 1.3893 17.81

4.4 TIEMPO DE ESPORULACI~N

Como se observa en la tabla 7 anterior el tiempo de esporulación se retarda para cada cepa a

medida que se aumenta la concetración de 3,4-DCA.

Tabla 7. Tiempo de esporulación a diferentes concentraciones de 3,4-DCA.

MEDIO DE CULTIVO m o p u s sp. Aspergillus sp.

PDA 18 22

0% 3,4-DCA + MM 24 24

25% 3,4-DCA + MM 36 45

50% 3,4-DCA + h4M 45 53

75% 3,4-DCA + MM 70 90

100% 3,4-DCA + MM 96 120

20

.

Como se puede observar en la tabla 8A y 8B las dos cepas presentan cambios morfológicos y

fisiológicos a las diferentes concentraciones de 3,4-DCA. En esta parte no se tomó a un tiempo

fijo todas las mediciones ya que el crecimiento de las cepas no es apreciable a un tiempo

determinado, es decir, si tomamos l a s medxiones para un tiempo de 48 h , el crecimiento aún no

se presenta para l a s concentraciones de 75 y 100 mg/l de 3,4-DCA.

4.5 PROCESAMIENTO DE IMÁGENES 2 2 2 4 1 6 Tabla 8A y 8B . Datos experimentales obtenidos del procesamiento de imágenes en los que se

cuantifican cambios morfológicos de Rhizopus sp. y Aspergillus sp.

Tabla 8A

MEDIO DE DILUCIóN cuLnvo

Conc. de 3.4-DCA (m)

O 1 .WE44

O 1 . W E 4 4

25 1 .00€-05

25 1 .WE45

50 1.WE-04

50 1.00E-04

50 1 .WE*

50 1 .al€*

75 1 .m" 75 1 .M)€"

75 1 . O E M

100 1.00E-03

1 w 1 .WE43

100 l. W E 4 3

100 1. WE-03

TIEMPO

28

30

38

3%

M

22

40

42

26.5

28.5

30.5

60

62

63

65

RtilzoPus sp.

Temp. A m M e

DlAMETRO

(M-) n=9

5.5176

6.16

3.5904

4.1 272

4.488

4.2152

5.2976

6.292

4.2592

4.268

4.268

3.6872

4.2504

1.9865

2.2365

( 2 0 C)

LONGITUD

(m) n=

M32m 2741 2528

215.68%

3 0 9 . 8 0 4

898.1 192

2337.5704

289.88608

31 1.56928

84.8672

22690.8

240.8978

429.82456

491 .%'I4

78.192

146.583

SEGMENTOS No. DE

(micras) n=9

115.6496

117.48

40.7792

54.31 36

27.5704

33 44

19.62048

43.8504

490776

46.6928

40.2512

21.7712

25.7576

24.8285

29.w

PUNTAS

(rnaras) n=5

11

20

3

6

36

38

2

5

2

2

2

4

4

4

4

OBJETIVO Tasa de

m M X

MX

MX

20x

MX

M X

MX MX

20x

MX

20x

2OX

1 ox 1 ox

Crec. Earn.

P '

0.30560800 2

0.22661 745 8

1.91 874070 9

1.33445007 2

0.15263888 8

0.05864547 1

0.47290272 1

0.43999176

1.03305122 6

0.00386377 6

0.384241% 8

0.02310333 3

0.02235806 5

O.OzMw17 5

0.021 3261 5 4

21

Tabla 8B

MEDIO DE DlLUClON CULTIVO

C m . de 3.4-DCA

(m)

O

O

O

O

O

25

25

50

50

50

75

75

75

100

100

1 .WE44

1 .00E-04

1.00E-04

1 .WE44

1.00E-04

1 .00€-05

1.00E-05

1 .WE45

1 .WE45

1 .m-05

1 .ooE-o4

1 .WE44

1 .00E-04

1.00E-03

1 .OOE-W

TIEMPO

(horas)

45

45

47

49

49

36

38

39.5

41.5

43.5

55

70

72

94.5

97

ASPERGILLUS Sp

Temp. Am-

DIÁUETRO

(rnicras)

n=9

1.7325

3.388

3.5376

1 .m 4.092

3.8984

4.7256

4.444

4.9368

5.3856

2.552

4.0216

4.4792

1.91 7

2.1015

LONGITUD

(me-)

n=5

162.4734

261.5888

285.9208

301.6125

478.4384

167.1824

272.9056

280.931 2

3 4 4 . 8 8 0 8

387.948

104.5

41 8.264

486.1084

98.4195

190.3815

SEGMENTOS No. DE PUNTAS

(mitras)

n=9

7 1.7045

22.8888

24.2721 6

19.449

38.0336

7.7264

21 252

25.3528

5 9 . 0 5 6 8

70.3648

22.5561

40.4008

42.28288

14.904

16.695

(mlcr=)

n=5

13

13

14

14

14

5

7

6

12

18

5

9

12

8

8

1 ox 20X

MX

1 ox

M X

2OX

M X

MX

2OX

MX

20X

MX

MX

1 ox

1 ox

C m . Estim.

P '

1.40134939

0.87038130 1

0.79631 142 6

o. 75488250 7

0.47588571 5

0.76823876 2

0.47082427 4

0.2801991 1 3

0.22824312 9

0.20290521 7

0.38807336 8

0.0969571 o 6

0.08719223 6

0.01466878 3

0.01 429072 2

4.6 FERMENTACI~N EN &DIO SÓLTDO

4.6.1 pH

Como se observa en las tablas 9, 10 y 1 1. En el testigo no. 2 no se determinó el pH inicial ya que

la muestra no fué suficiente para la determinación. Respecto a los demás testigos no hay

variaciones grandes en su pH. Por lo que se puede asegurar que no hubo contaminación de las

columnas.

Tabla 9. Comportamiento de pH de los testigos.

Testigo Conc. de 3,4- pH¡ PHf DCA

O - W l ) 1 25 5.05 5.2 2 - 50 5.3 3 1 O0 5.1 4.76

22

El comportamiento del pH que presenta RlzCopus sp. y Aspergillus sp. ( ver Tablas 10 y 11) es

muy favorable ya que éste descenso es característico de una actividad metabólica de los hongos.

Con respecto a el pH inicial correspondiente a 25 mg/l de 3,4-DCA p o r Rhizopus sp. se tiene un

pH bajo, probablemente hubo actividad del hongo durante la refrigeración de la muestra.

Tabla 1O.Comportamiento de pH por Rhizopus sp. CONC. DE 3.4-DCA pH i pH f

(mg4

25 3.83 3.64 50 5.71 3.66 1 O0 5.15 3.5

Tabla 1 1 .Comportamiento de pH por A s p e r g " sp. CONC. DE 3,4-DCA pH i pH f

(mg4

25 5.07 3.4 50 5.04 3.32 1 O0 5.26 3.45

4.6.2 HUMEDAD

Como se observa en la Tabla 12 en el caso deí testigo No. 2 no se tuvo muestra inicial suficiente

para realizar su análisis. La humedad que se requería tener en la fermentación era del 70 % para

un mejor acondicionamiento de el proceso y los hongos, pero ésta vanó aunque no de manera

que afectara en forma significativa.

Tabla 12.DE?TERMINACIdN DEL % DE HUMEDAD

MUESTRA HUMEDAD INICIAL HUMEDAD FINAL

("A> (%>

TESTIGO 1 70 71

TESTIGO 2 77

TESTIGO 3

Rhizoprrs sp. I

Rhizopus 3.p. 2

Rhizopus sp. 3

Aspergilh p. I

Aspergillus sp. 2

Aspergrllus sp. 3

68

66

69

65

64

61

66 A

81

67

70

71

75

82

73

23

4.6.3 CUANTTFICACIÓN DE CLORO

Como se observa en las Tablas 13, 14 y 15 en el caso de los testigos y de Aspergillus sp se

cuantifica mayor concentración de ion cloro a medida que se incrementa la concentración de 3,4-

DCA, en el caso de Rhizopus sp se presenta lo contrario.

Tabla 13. Detenninación de cloro para los testigos

Testigo CONC. DE 3,4- CONC. De cloro DCA (mg/l)

1 25 71.7382292 2 50 66.4080545 3 1 O0 85.5966834

Tabla 14. Determinación de cloro por Rhizopus sp. CONC. DE 3,4-DCA CONC. DE CLORO

( m@) (mg/l)

25 80.5 50 77 1 O0 78

Tabla 15. Determinación de cloro por Aspergi22u.s S- .

25 65 50 .73 1 O0 83

4.6.4 CUANTICFICACIÓN DE 3,4-DCA POR HPLC

Los resultados obtenidos (ver Tabla 16) se calcularon en base a una curva estándar y a un ajuste

de los mismos con los resultados de humedad, como se puede observar en algunos casos éstos

varían y no corresponden a lo esperado, ésto se debió a que la cantidad de 3,4-DCA no se

hornogeneizó perfectamente con el soporte, esto es una de las desventajas de la fermentación en

medio sólido; por éSta razón los resultados que a continuación se muestran se hicieron en

relación a la cantidad de 3,4-DCA teórico.

24

Tabla 16. Datos experimentales de la cuantificación de 3,4-DCA por WLC.

MUESTRA CONCENTRACION CONCENTRACION CONCENTRACION

MlCIAL DE 3,4- FMALDE 3,4-DCA DE 3,4-DCA

DCA (m@) TEÓRICO

(m& (mgfl) TESTIGOS

1 3 1 .O8 24.32 25.33

2 23.889 51.36

3 38.33 141.33 103.305

1

17

2

2’

3

3’

20.85

19.62

27.59

19.42

44.7

33.74

29.41

59.16

0.0

17.62

0.0

0.0

Aspergillus sp.

1 20.85 22.15

1’ 19.62 22.58

2 27.59 0.0

2’ 19.42 28.17

3 44.7 0.0

3’ 33.74 o. o

26.09

52.01 1

103.305

26.399

52.63

104.602

4.6.5 VELOCIDAD DE CONSUMO DE 3,4-DCA

La velocidad de consumo de 3,4-DCA se determinó relacionando la diferencia de

concentraciones, inicial experimental y final teorico, entre el tiempo de la fermentación. Como

puede observarse en la fig. 3 y 4, la velocidad de consumo aumenta a medida que se incrementa

la concentración de 3,4-DCA éste comportamiento se debe a que no se llegó a un punto de

saturación de la 3,4-DCA con respecto a cada cepa.

25

VELOCIDAD DE CONSUMO DE 3,4-DCA Rhizopus sp.

1 . 2 7

1

0 . 8

0.6

0 . 4

0.2 O

O 25 5 0 1 O0

C O N C . D E 3 , 4 - D C A (mg/l)

Fig. 3 Velocidad de consumo de 3,4-DCA por Rhzzopus sp.

VELOCIDAD DE CONSUMO DE 3 , U C A Aspesgillus sp.

L

1

; 0.8

. 0.6 E

v 0.4 e >

02

O

m

Fig.4 Velocidad de consumo de 3,4-DCA p o r Aspergillus sp.

26

4.6.6 PORCIENTO DE CONSUMO DE 3,4-DCA (ver anexo 3)

En los resultados muestran que se muestran en la Tabla 16 se observa que las dos cepas de

hongos degradan al 100% la concentración mas alta que se empleo en la fermentación siendo

éSta de 1 O0 mg/l de 3,4-DCA.

Tabla 17. Porciento de consumo de 3,4-DCA en relación teórica

I I % DE CONSUMO DE 3,4-DCA EN RELaClÓN TEORICA

i 50 I

I 1 O 0

! Rhizopus sp. 1 71.42 j 83.15 1 1 Aspergillus sp. 15 73 I

1 O0 1 O0

27

CONCLUSIONES

De los datos experimentales obtenidos se demostró que las cepas de hongos las cepas de hongos

aisladas se adaptaron hasta 100 mgA de 3,4dca como única fuente de carbono y energía.

Se observó que la técnica de procesamiento de imágenes es una herramienta muy útil para

cuantificar los cambios morfológicos y fisiológicos de hongos filmentosos, principalmente en

este tipo de estudios donde compuestos xenobióticos alteran la fisiología de los

microorganismos.

El empleo de la fermentación en medo sólido permitió que las cepas degradaran la

concentración mas alta utilizada ya que éste proceso hace que la füente de carbono no esté en

contacto con los microorganismos sino que ellos lleguen a la fuente de carbono .

PROPUESTAS

Emplear la fermentación en medio sólido utilizando concentraciones de 3,4dca en un rango de

100 - 400 mg/l , ésto es para determinar el punto de saturación en el que las cepas ya no

degradarían al compuesto. Asi como otro tipo de soporte que permita una mejor homogeneidad

ya que 10s resultados experimentales muestran distintas concentraciones iniciales y fíiales en las

muestras (testigos) que teóricamente deberían mantenerse.

Determinar cual es la máxima concentración que degrada cada una de las cepas, esto es muy

importante saberlo ya que las plantas de tratamiento de aguas tienen el problema de como

degradar compuestos xenobióticos y si estos microorganisrnos degradan una concentración

sigmfkativa, serían una alternativa para la solución de &e problema.

Cuantificar las variaciones morfológicas de cada una de ras cepas manteniendo una cantidad

constante de la fuente de carbono alterna (PDA) y variando la concentración de 3,4-DCA, con el

fin de confirmar que los cambios morfológcos son provocados por la 3,4-DCA.

28

BKBLIOGRAFÍA

ANDREW GUY LIVINGSTON. BODEGRADATION OF 3,4-DICLOROANILINA IN A FLUIDJZED

BED BIOREACTOR AND A STEADY-STATE BIOFILM KINETIC MODEL BIOTECHNOLOGY

AND BIOENGINEERING, VOL. 38, 199 1.

-. ARORA K.D. , ELANDER P.R. , MUKEIUI G.K., HANDBOOK OF APPLIED MYCOLOGY

FUNGAL BIOTECHNOLOGY VOL. 4.,1990.

CHÁVEZ R.A.R. A BIOFLM REACTOR FOR DEGRADATION OF CHLOFXNATED

HYDROCARBONS; DEPARMENT OF CHEMICAL ENGINEERING UNIVERSITY OF

CAMBRIDGE, JUNE 1994.

FLORES R.E. Y GARCÍA. B.V. AISLAMIENTO DE CEPAS DE HONGOS FILAMENTOSOS A

PARTIR DE LA COPRA, MÉXICO D.F. 1995.

KEITH G.T. FULLY AUTOMATIC MEASUREMENT OF MYCELIAL MORPHOLOGY BY IMAGE

ANALYSIS BIOTECHNOLOGY PROG. 1992 PP 8,353 -359.

P.C GONZÁLEZ -BLANCO, C.P. LARRALDE-CORONA, G. VINIEGRA-GONZÁLEZ. IMAGE

PROCESSING TECHNIQUE FOR MEASURING SPECIFIC GROWTH RATES OF Gibberella

Jijihroi. BIOTHECNOLOGY TECHNIQUES VOL. 7 No. 1, JANUARY 1993. PP 57-62.

PW. COX, CR. THOMAS. CLASSIFICATION AND MEASUREMENT OF FUNGAL PELLETS BY

AUTOMATED IMAGE ANALYSIS BIOTECHNOLOGY AND BIOENGDEElUNG, VOL. 39. PP 945

- 952 . 1992 JHON WILEY AND SONS,INC.

SEGUNDO SIMPOSIO INTERNACIONALSOBRE REMOCIÓN DE CONTAMINANTES DE

FACULTAD DE QU~MICA.

AGUAS Y SUELOS, 17 DE NOVIEMBRE DE 1995, UNAM, INSTITUTO DE INGENERÍA Y

XI CONGRESO NACIONAL DE INGENTERÍA BIOQUhlICA, UNIDAD CULTURAL JAIME

TORRES BODET, UNIDAD PROFESIONAL PTE. ADOLFO LÓPEZ MATEOS. 1 1-15 DE

NOVIEMBRE DJ 1996, MÉXICO D.F.

29

ANEXOS 1. CRECIMIENTO R A D I A L

Rhizopus sp

ESTADO TIEMPO

(a)

PRIMERO O

1

2

4

5

6

7

8

9

10

11

SEGUNDO O

2

4

6

8

10

12

14

16

18

TERCERO O

2

4

6

8

10

12

CRECIMIENTO

RADIAL

( d i a s )

A O

10

30

52

71

95

114

136

158

180

20 1

223

O

25

54

84

107

137

166

194

22 1

297

O

15

28

45

51

56

CRECIMIENTO

RADIAL

(dias)

B

O

12

32

53

74

95

116

136

156

182

202

22 1

O

25

53

88

110

138

167

198

228

3 02

O

18

37

46

54

64

63 73

PROMEDIO

0

11

31

52.5

72.5

95

115

136

157

181

201.5

222

0

25

53.5

86

108.5

137.5

166.5

196

224.5

299.5

0

16.5

32.5

45.5

52.5

60

68

30

CUARTO

14

16

18

O

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

Aspergflus sp

PRIMERO O

1

2

4

5

6

7

8

9

10

I 1

SEGWDO O

2

4

6

8

69

80

94

O

10

17

23

28

32

37

44

50

63

66

66

72

90

O

6

14

38

47

56

63

71

79

86

93

102

O

4

13

22

29

-

83

95

114

O

9

17

31

37

45

48

50

57

68

76

79

80

82

O

7

12

26

35

42

51

59

67

74

81

88

O

5

17

25

33

76

87.5

104

0

9.5

17

27

32.5

38.5

42.5

47

53.5

65.5

71

72.5

, 76

86

0

6.5

13

32

41

49

57

65

73

80

87

95

0

4.5

15

23.5

31

31

10

12

14

16

18

20

22

TERCERO O

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

O

4

8

12

16

20

24

38

48

53

62

87

116

124

O

O

7

13

16

18

22

28

32

38

48

52

58

65

76

O

3

10

19

23

28

33

43

53

60

70

92

122

132

O

O

5

9

11

13

17

20

26

32

39

42

48

58

63

O

5

8

15

20

25

30

40.5

50.5

56.5

66

89.5

119

128

0

0

6

11

13.5

15.5

19.5

24

29

35

43.5

47.5

53

61.5

69.5

0

4

9

17

21.5

26.5

31.5

32