UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO

COMPUESTOS DERIVADOS DEL

ÁCIDO SHIKIMICO

Profesor Gabriel Jaime Arango Acosta Dr. Sc. Pharm. Facultad de Química Farmacéutica

Medellín, mayo de 2010

1

CONTENIDO PAG. INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO 2

GENERALIDADES 2 Metabolitos primarios, Metabolitos intermediarios, Metabolitos secundarios 3

REACCIONES ENZIMATICAS 3 Mecanismos enzimáticos 4

BIOSÍNTESIS 7 Método biosintético 8

Isótopos estables e Isótopos radioactivos 10 FOTOSÍNTESIS 13

Fijación del carbono 13 Ciclo de Calvin (Plantas C3) 14 Plantas C4, 15 Metabolismo Ácido de las Crasulaceas, CAM 16

COMPUESTOS DERIVADOS DEL ACIDO SHIKIMICO 16

Biosíntesis del Acido Shikimico 17 Biosíntesis de fenilalanina y tirosina 18 Biogénesis de los ácidos cinámicos 19

Fenilpropanoides 19 Compuestos C6C2C6 estilbenos 23 Plantas que contienen compuestos fenil propanos 24

COMPUESTOS (C6C3)2 (LIGNANOS) 24 Lignanos propiamente dichos, 25 Neolignanos, Lignoides, Lignanos diversos, 26 Lignanos conjugados 27 Biogénesis de lignanos 27 Extracción de lignanos 29 Características espectrales de los lignanos 29 Interés biológico de los lignanos 30 Algunas plantas que contienen lignanos 30

ESTRUCTURAS POLIMÉRICAS 30 Ligninas 30 Taninos, 31

Principales plantas que contienen taninos 32 CUMARINAS 34

Biosíntesis de cumarinas 34 Cumarinas simples 35 Cumarinas complejas Furanocumarinas, 36 Piranocumarinas, 37 Cumarinas diversas 38 Técnicas de extracción de cumarinas 39 Métodos espectroscópicos para determinar cumarinas 39 Principales plantas que contienen cumarinas 41

BIBLIOGRAFIA 42

2

INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO GENERALIDADES Farmacognosia: El término Farmacognosia fue utilizado por primera vez por el alemán Aenotheus Seydler, quien lo uso en su tesis doctoral en 1815, en, Analecta Pharmacognostica. Del Griego Pharmakon: droga y Gignosca: adquirir conocimiento de algo; por lo tanto la Farmacognosia es el estudio de las materias primas de origen biológico: vegetal, microbiano (hongos, bacterias) y animal. Estudia tanto substancias con propiedades terapéuticas como substancias tóxicas, excipientes u otras substancias de interés farmacéutico, en general, es la ciencia que estudia los aspectos botánicos, químicos, biológicos y económicos de las drogas, destinadas a la preparación de medicamentos, de aquí que muchos autores designan a la farmacognosia como “Materia médica” o “Materia Farmacéutica”[1]. La Farmacognosia es la más antigua de las ciencias médicas, el hombre primitivo tuvo que aprender a distinguir los productos que le servían de alimento y los curativos de los tóxicos. La Farmacognosia tiene como metas: • El conocimiento de las plantas utilizadas en terapéutica con miras a la obtención de

drogas en cantidades y calidades convenientes. • La prospección de nuevas plantas con fines terapéuticos, aquí colaboran:

• La etnofarmacognosia (Conocimiento popular de la farmacognosia) • La química hemisintética (Síntesis de sustancias a partir de otras conocidas) • La quimiotaxonomía (Relación entre las tipos sustancias químicas

encontrados en un ser vivo y su clasificación taxonómica)

El término biosíntesis es sinónimo de anabolismo y se refiere a la formación de moléculas complejas a partir de moléculas sencillas, esto implica la formación de enlaces carbono-carbono y de otros tipos, a través de reacciones catalizadas por enzimas. En el esquema siguiente vemos como en condiciones extremas de temperatura y presión, se muestra la posible formación de macromoléculas complejas a partir de simples moléculas inorgánicas. Los seres vivos a partir de H2O, CO2 (por medio de la fotosíntesis) y una fuente inorgánica de nitrógeno, efectúan el proceso completo, produciendo moléculas orgánicas y luego macromoléculas, las cuales se ensamblan en estructuras superiores (organelos) que conforman la célula. La composición química de todas las células es similar, contienen agua (alrededor de 70%), y en partes mas o menos iguales, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos. En general podemos decir que los productos naturales se han dividido en tres grupos debido a los diferentes factores que caracterizan a cada uno de ellos. • Metabolitos primarios Son macromoléculas fundamentales para los seres vivos, de

distribución general, que sirven para la producción de metabolitos secundarios, son incorporados directamente del medio o sintetizados a través de reacciones bioquímicas intracelulares.

3

SINTESIS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES[2, 3]

la célulay sus

organelos

la célula

membranas cromosomas ribosomas pared celularestructurassupramoleculares

macromoléculas proteinas lípidos proteinas

DNAproteinas RNA celulosa

moléculasorgánicas aminoácidos nucleótidos monosacáridos

ác. grasos

moléculasinorgánicas CO2 H2O NH3

• Metabolitos intermediarios Son moléculas pequeñas que corresponden a un metabolismo central, producidos directamente de ciclos metabólicos primarios.

• Metabolitos secundarios Es el producto de un metabolismo específico, originados a partir de un metabolismo intermediario, de distribución restringida, con una función metabólica específica, se encuentran almacenados en el interior de las vacuolas.

TIPOS DE METABOLISMO

PRIMARIO INTERMEDIARIO SECUNDARIO Carbohidratos

Monosacáridos Glucosa, fructosa

Glicósidos, Azúcares modificados, Ac. Urónicos heparina

Proteínas Aminoácidos Alcaloides, taninos, fenil propanos, cumarinas Lípidos Ácidos grasos Policétidos, terpenos, esteroles, triterpenos Ácidos nucleicos Bases Tetrapirroles, alcaloides imperfectos

REACCIONES ENZIMATICAS La formación de metabolitos primarios, intermediarios y secundarios resumida en el cuadro general del metabolismo secundario, ocurre a través de reacciones enzimáticas, las enzimas que actúan como catalizadores de superficie generalmente tienen naturaleza protéica lo que las hace muy difícil de aislar y purificar, debido a esto su clasificación se hace de acuerdo a su acción[3]: Clase Nombre

(Grupo) Actividad catalítica

1 Oxidorreductasas Cambio de estado de oxidación, ej. -CHOH a -C=O 2 Transferasas Transferencia de un grupo, ej. Transferencia de metilos C1

3 Hidrolasas Hidrolizar, ej. de ésteres o péptidos 4 Liasas Reacciones de ruptura de enlaces, ej. liasa de carbono-nitrógeno 5 Isomerasas Isomerizaciones, ej. epimerización cis-trans 6 Ligasas Reacciones de formación de enlaces, ej. enlaces C-C

Cuadro 1: Clases de enzimas y su actividad catalítica

Las enzimas generalmente tienen un grupo protéico (cadenas de aminoácidos) y un grupo prostético no aminoacídico, el cual, de acuerdo a su naturaleza, se clasifica en:

4

Cromoproteínas Co, Mg, Fe Glicoproteínas azúcares Lipoproteínas ácidos grasos Fosfoproteínas ácido fosfórico Métaloproteínas Cu, Zn Este grupo prostético se puede separar por diálisis y se le conoce como coenzima. Mecanismos enzimáticos[1, 4] Reacciones de alkilación: Son reacciones de Sustitución nucleofílica o de adición electrofílica y producen alargamiento de cadena Sustitución nucleofílica Vía S-adenosil metionina (SAM) Formación de SAM

CH3

S

COOH

NH2

ATP

L-Met

CH3

S+

COOHNH2

O

OHOH

N

N N

N

NH2

S-adenosilmetionina

METILANTES

N

N N

N

O CH2-S-CH2CH2CHCO2H

HOOH

NH2

NH2

CH3

+

-CH3

N

N N

N

O CH2-S-CH2CH2CHCO2H

HOOH

NH2

NH2

..

S-Adenosilmetionina S-Adenosilhomocisteina

C-alkilación usando SAM

-S+ CH2CH2:

C C

CH2

S

:+ CH2

CC H2 C

H

C

CH3

5

..OH

CH3S

+ COOH

NH2

AdO

O

H-

CH3S

+COOH

NH2

Ad

a b

a: Las posiciones ortho y para son activadas por grupos OH. b: Los grupos carbonilo aumentan la acidez

y permiten la formación del anión enolato

O y N alkilación usando SAM

CH3S

+ COOH

NH2

AdS COOH

NH2

Ad

R OH.. R O

+ CH3

HS-adenosilhomocisteina

Adición electrofílica Condensación aldólica y Claisen: Reacciones donde se forman enlaces carbono-carbono, se necesita un buen grupo saliente.

R CH

H

O

X

Nu:-

-NuHR CH

- O

X

O-

R CH CH

Xanión enolato

estabilizado por resonancia

Mecanismo general

R CH

H

O

X

R CH- O

X

R CHO

X

R CH2 C

O-

X

H-

R CH2

OH

X

RO

X

producto tipo aldol

R CH2

O

CHR

O

X

producto tipo Claisen

El producto de formación depende de la naturaleza del grupo saliente X. La coenzima A es el equivalente biológico a la condensación de Claisen.

SCoA

O O

-CH2 CO

SCoA ACoS SCoA

O OH OH

HO SCoA

O OH OHH2O

6

Reacciones de condensación Vía fosfo enol pirúvico

C O CH2 C

OP

CO2H C

OH

CH2 C

O

COOH

Vía Isopentenil pirofosfato (IPP) o dimetil alil pirofosfato (DMAPP)

C O OPP

H :EnzC

OHOPP

O

CH

O

X

O P

O

O

O P

O

O

OP

-

--

X

O O

OPP+

Reacciones de Carboxilación y descarboxilación

HN NH

S

O

(CH2)4CO2H

CO2ATP

N NH

S

O

(CH2)4CO2H

CO

HO

biotina

N NH

S

O

(CH2)4CO2H

CO

HO

C

OH

C N NH

S(CH2)4CO2H

OH

C

O

C CO2H+

-O2CCH2CSCoAO

HN NH

S

O

(CH2)4-C-NH-Enz

O

Biotina

N NH

S

O

(CH2)4-C-NH-Enz

O

-O2C

HCO3-/ATP

H3C-C-SCoA

O

Acetil CoA

Malonil CoA

CARBOXILASA

Eliminación: La eliminación depende de las características del grupo saliente

7

B

HNu-

+ NuH +B-

En sistemas biológicos el grupo saliente más común es el fosfato.

C

H

CR2

O P OH

R1

R2

O

O-

Nu-

CR1

R2

CR2

R2+ NuH + PO3

=

Epoxidación

+ H2OH2

C C

H H

O

.

C C

H H

O

O

O2C

H

C

H Oxoredución: R-CH3 R-CH2OH R-CHO R-COOH

NICOTIN AMIDA DINUCLEOTIDO FOSFATO

+NADP

+

N

N

NN

NH2

OHHO

O

O- O-

OO

O

OHOH

CH2O P O P OCH2O

CNH2

N

-H

NADPHN

N

NN

NH2

OHHO

O

O- O-

OO

O

OHOH

CH2O P O P OCH2O

CNH2

HH

N

MODO DE ACTUAR

X

RH-

H+ NADPH+H+ NADP+

H

R

X

BIOSÍNTESIS[2- 5]

Todos los compuestos orgánicos están constituidos por carbono e hidrógeno a menudo contienen oxígeno y nitrógeno y menos frecuentemente azufre, fósforo y halógenos. La formación de los productos naturales en plantas superiores, algas y algunas bacterias fotosintéticas; tiene como origen la fotosíntesis, la energía solar es utilizada por células que contienen clorofila la cual se encuentra en los cloroplastos. Los productos inmediatos de la absorción de energía lumínica son ATP y el reductor NADPH, compuestos que más tarde se utilizan en el proceso de fijación del carbono con la

8

formación de enlaces carbono-carbono y la reducción del CO2 para formar los carbohidratos (CH2O)n.

FOTOSÍNTESISCO2 + H2O

Glucólisis Ciclo

de

las pentosasÁcido

Fosfoenol

pirúvico

CH3COCOOHAc. pirúvico

COOH

OH

OH

OH

CARBOHIDRATOS

CH3CO.SCoAAcetilCoA

Ciclo

de

Krebs

Aminoácidos

aromáticos y

alifáticos

MalonilCoA

Acido Shikímico

Acido cinámico

ALCALOIDES

POLIACETATOS

TANINOS

CUMARINAS

LIGNANOS

FLAVONOIDES

ANTRAQUINONAS

TETRACICLINAS

AC. GRASOS

OH O OH

CH3CH3

Ac. mevalonico

CH3

CH3

CH2OPP

isopentenilpirofosfatodimetilalilpirofosfato

Terpenoides

Carotenoides

Alcaloides esteroidales

Eritrosa 4P

Cuadro general del metabolismo segundario Prácticamente toda la vida en la tierra depende de la fotosíntesis pues todos los organismos que no son fotosintéticos necesitan consumir moléculas orgánicas previamente formadas para vivir, además, la fotosíntesis es la única fuente natural de oxígeno en el planeta Los animales y otros organismos como las bacterias de la putrefacción, obtienen su energía degradando moléculas orgánicas que han sido formadas por otros seres vivos, por lo que podemos afirmar que todos los organismos dependen de la energía solar. Método biosintético[1, 2, 3, 4]

Consiste en el estudio de las técnicas y procesos de formación de sustancias en los organismos vivos. Para entender bien el método biosintético, es necesario conocer la definición de algunos términos:

Biosíntesis: Formación de una sustancia en o por un organismo vivo (comprobado experimentalmente). Biogénesis: Son las hipótesis de la formación de una sustancia en un organismo. Estas hipótesis deben estar de acuerdo a las reglas y leyes de la bioquímica y la química orgánica.

Las consideraciones biogenéticas pueden facilitar en mucho la determinación de la estructura de un producto desconocido, pero también puede conducirnos a conclusiones

9

erróneas. Es por esto, que las teorías deberían solo servir para confirmar o rechazar una estructura propuesta de una sustancia o producto natural. Los estudios biosintéticos pueden dividirse en dos grupos - Estudio de secuencias biosintéticas o Análisis secuencial - Estudio de mecanismos biosintéticos Primero se realiza el análisis secuencial y luego se determina su mecanismo.

Análisis secuencial Pretende establecer los pasos individuales de una secuencia biogenetíca El análisis secuencial, se basa en la aparición de productos relacionados entre si en diferentes etapas de la formación de compuestos, sin embargo, hay que tener en cuenta: • El mismo precursor puede metabolizarse de varias maneras diferentes

A B

P

C D

v1v2

v3

v4

• La diversidad de tejidos del órgano productor de los metabolitos: animales, vegetales superiores y microorganismos; originan sistemas enzimáticos diversos que operan de forma diferente. Si las velocidades de reacción son muy diferentes, se pueden perder la pista de algunas de las sustancias de interés.

v1 >>> v2 El producto B va a ser mas abundante pues la velocidad v1 es mucho mayor que v2, debido a esto, se puede pensar erróneamente que el producto es B y no P. La detección se basa en buscar "moléculas claves" que originen los diferentes metabolitos en condiciones biológicamente posibles (pH∼7, medio acuoso, presión normal y temperatura ambiente). Cuando se emprende un estudio biosintético hay que tener en cuenta que las conclusiones obtenidas pueden ser erróneas si no se detecta bien la "molécula clave"; en Conium maculatum el máximo contenido de γ-coniceina es alcanzado una semana antes que la coniina, debido a que la velocidad de formación es muy grande toda la coniina pasa rápidamente a γ-coniceina; cuando se llega a una determinada cantidad de γ-coniceina, se inhibe la formación de esta y aumenta la de la coniina, siendo esta precursor de la otra.

N CH3

HN CH3

Coniína γ Coniceína

Esta detección se dificulta igualmente cuando un intermediario es fácilmente ínter convertible con otro metabolito que esta fuera del camino directo:

A B C

D

10

D no es un intermediario en el camino que conduce de A a C, sin embargo si se suministra D marcado se obtendrá C marcado, demostrar que D no pertenece al camino directo implica demostrar que las siguientes expresiones no son ciertas:

A B D C

CD

B

A

CD BA

Un método de demostrar esto, es aislar y purificar las enzimas de cada una de los procesos. El problema puede complicarse si la interconversión entre B y D no es un proceso enzimático, como por ejemplo un hidroxiácido y la lactona. En estos casos, es imprescindible efectuar un estudio cinético cuidadoso de las reacciones enzimáticas. Un ejemplo real es la biosíntesis de ciertas lactonas esteroidales como la hellebrigenina[1]

O

O

HO

O

H

HO

O

O

OH

OH

HO

OHH3C

OHHOO

Ac. mevalónico

progesterona

hellebrigenina

pregnelonona

α3

Esta biosíntesis de la hellebrigenina se pudo demostrar fácilmente pues la interconversión de pregnelonona a progesterona es lenta comparada con los otros pasos y al utilizar pregnelonona marcada en el protón 3α, se demostró que un porcentaje de la marcación era retenido en el producto final, indicando que la progesterona no era un intermediario, si así lo fuera, la marca se hubiera perdido totalmente, pues al formarse la progesterona, se pierde ese protón. Isótopos estables e Isótopos radioactivos Se denominan isótopos a los átomos del mismo elemento que contienen el mismo número de protones pero diferente número de neutrones, y que por lo tanto tienen diferentes números de masa. Los tres isótopos del hidrógeno 1H, 2H (deuterio) y 3H (tritio), contienen cero, uno y dos neutrones. No obstante, algunos isótopos con demasiados neutrones son inestables y tienden a degradarse para formar un isótopo más estable, se convierte en otro elemento; esos isótopos se denominan radioisótopos, ya que emiten radiaciones de alta energía al desintegrarse. La cantidad de 14

6C en la atmósfera terrestre se mantiene constante en el tiempo y pasa a formar parte del ciclo de la alimentación, según

11

14CO2 (gas) plantas, fotosíntesis <=> 14C (carbohidratos, alimentos especies vivas)

Como resultado del equilibrio anterior, todos los seres vivos contienen la misma fracción de C-14 e igual a la que existe en la atmósfera. Al momento de la muerte del organismo de la especie considerada, ya no regenerá este equilibrio y solo se produce la desactivación radiactiva del C-14 que existía en el momento de extinguirse su vida. Esto nos permite calcular las edades de materiales de la corteza terrestre, basándose en la existencia de 14C radioisótopo, el cual se va desintegrando por bombardeo de neutrones provenientes de la estratosfera, produciendo así átomos de N como se muestra en la ecuación siguiente:

t½ = 5730 años

Así pues, al medir la cantidad de radiactividad en una muestra de origen orgánico con un contador de partículas Geiger se puede calcula la cantidad de 14C que aún queda en el material. Así puede ser datado el momento de la muerte del organismo correspondiente. Se ha logrado determinar con bastante exactitud que la radiación de C-14 en la atmósfera corresponde a la medición de 13,6 desintegraciones β por cada minuto, para 1 gramo de Carbono presente. Esto es así porque, en tanto existe vida, la proporción 14

6C / 12

6C , permanece constante de modo que solo consideramos el C total para las mediciones normalizadas. Así, Intensidad de radiación 14C en equilibrio = 13.6 desintegraciones β minuto/gramo C El método de datación por radiocarbono es la técnica más fiable para conocer la edad de muestras orgánicas de menos de 60.000 años. Está basado en la ley de decaimiento exponencial de los isótopos radiactivos. El tiempo de datación de la especie, se calcula fácilmente considerando que 13,6 es la radiación inicial a t = 0 y que es proporcional al contenido de 14

6C al momento de muerte del organismo y si llamamos I la intensidad de la radiación actual de una muestra de ese organismo en la era actual, la edad desde su muerte está dada por

t = (1,90·104 años) log(13.6/I) ELEMENTOS RADIOACTIVOS UTILIZADOS EN INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS

Isótopo Tiempo de vida

media Energía de radiación

Beta Gama Observaciones toxicidad

3H 12-43 años 0.186 nula 3H. 3He + e- baja 14C 5730 años 0.156 nula 14C 14N + e- media

24Na 14.9 horas 1.39 1.38 Subgrupo inferior 42K 12.4 horas 3.5 1.5 Subgrupo inferior 35S 87.4 días 0.167 -- Subgrupo inferior 32P 14.3 días 1.709 nula Subgrupo inferior 131I 8.04 días 0.247-0.806 0.08 Subgrupo inferior media

ELEMENTOS NO RADIACTIVOS

Elemento Abundancia natural % Espin Detección

2H 0.015 1 Masas, IR, 13C 1.0 ½ Masas, RMN

12

15N 0.36 ½ Masas, RMN Formación del Alcaloide Shimanina a partir del Ácido O-Succinilbenzoido en la Orquidea Dendrobium pierardii[6]

Shimanina

Ac. o-succinil benzoicoB.Schiff

N-MetNH32H

+O

NCH3

OCOOH

NCH3

O

COOH

NHCH3CHO

COOH

O

COOH

COOH

O

4

13

3

5

27

9 1110

8 6

12

*

O

N

O

CH3

O

N

O

CH3

TMS4

13

3

5

2

79

10

118

612

100 0200

200 0100

12 6

8 11

109

7

2

5

3

13

4

TMS

Este ejemplo, nos muestra la posibilidad de estudiar el método biosintético de una sustancia por resonancia magnética nuclear de 13C, el primer espectro de la shimanina, nos muestra claramente todas las señales de 13C; si partimos de ácido o-succinil benzoico marcado en el carbono carboxílico de la cadena, se nos formará la shimanina con marcación (5-13C) como se muestra en la figura, por lo tanto, veremos en el espectro 13C RMN (inferior) un aumento (comparado con las otras señales) en la intensidad de la señal de ese carbono. Efectividad del precursor[1] En plantas superiores se aceptan incorporaciones del 0.1% como efectivas En microorganismos aproximadamente del 5%. El Grado de Incorporación GI esta dado por la siguiente ecuación:

GI = (A2 M2 / A1 M1) x 100 M1 y M2 : [ ] Molares. A1 y A2: Actividades específicas molares del precursor y del producto (Medidas por el método de centelleo) Cuando en la formación de una sustancia existen compuestos simétricos, se formarán isómeros marcados, como es el caso de la nicotina, la cual mostrará marcación en diferentes átomos disminuyendo así el grado de incorporación

13

NH2 NH2

OOH

NH2NH2 HNH2

ONH2 H

O

N+

CH3

N+

CH3

OOH

N

NCH3

* *

* *

*

**

*

nicotina

Como detectar posibles precursores

Hay que determinar el lugar y la etapa de formación Ej. La Brugmancia sanguinea sintetiza la escopolamina en la etapa de prefloración y no en la de fructificación, además, los ésteres, se forman en las raíces y son transportados a las partes aéreas donde pueden ser hidrolizados.

Cuando se presume la naturaleza del precursor, este se puede introducir artificialmente en el medio biológico y seguir su destino. Para seguir el destino existen dos métodos

1. Marcado isotópicamente - Isótopos radioactivos - Isótopos estables 2. Método biológico, usando mutantes o inhibidores enzimáticos específicos.

Suministro El suministro del metabolito depende del estado físico del sustrato

Si es un gas (18O2, o CO2 marcado con 14C o 13C) se hace crecer el material en atmósfera del gas. Si es líquido o sólido se aplica en solución (estas deben ser solubles en medio fisiológico) y se pueden aplicar por: Riego (cultivos hidropónicos) Por adsorción en tallos cortados Por inyección de la solución en el sitio biosintético Por infiltración a presión reducida

FOTOSÍNTESIS[3-5]

El proceso fotosintético tiene lugar únicamente en las células que contienen clorofila y solo en ciertos organelos como los comatóforos (pequeños corpúsculos coloreados que se encuentran en el interior de las células, como los cloroplastos y cromoplastos). Según la fuente de Energía que utilizan, las células se clasifican en: • Fototróficas: Obtienen la energía directamente de la luz: células vegetales • Quimiotróficas: Obtienen la energía de la oxidación de los alimentos: células

animales y células vegetales en oscuridad Fijaciòn del carbono[3-5]

La fijación del carbono es la incorporación fotosintética del CO2 atmosférico a compuestos orgánicos, mientras que la carboxilación es la adición de una unidad de CO2 a un compuesto orgánico. Ciclo de Calvin (Plantas C3) El conocimiento sobre la fijación del carbono, se debe en gran parte a Melvin Calvin en 1946, incubó una micro alga verde Chlorella pyrenoidosa en presencia de luz y le burbujeó 14CO2, la incubación se llevaba a cabo en diferentes periodos de tiempo desde 3 segundos a sesenta segundos, suspendiendo la incubación con vapores de alcohol; se

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extraían los compuestos radioactivos y se cromatografiaban en papel, revelándose luego con una placa fotográfica que marcaba las sustancias radioactivas. A los tres segundos solo dio una sola mancha correspondiente a 3-fosfoglicerato, pero a los treinta segundos dio varias manchas según el sigiente cuadro.

SECUENCIA GLOBAL:

C5 + C C6H2O

2 X C3

CO2SISTEMA

CARBOXIDISMUTASA2 MOLÉCULAS

AC. 3 FOSFOGLICÉRICO3 FOSFO

GLICERALDEHIDO

RIBOSA 5 PRIBULOSA 5 P

XILOSA 5 P

SEDUHEPTULOSA 7 P

SEDUHEPTULOSA 1, 7 DI P

RIBULOSA 1, 5 DI PDIHIDRO

ACETONA P

FRUCTOSA 1, 6 DI P

FRUCTOSA 6 P

ERITOSA 4 P

Ciclo del carbono en la fotosíntesis plantas C3 (ciclo de Calvin)

En 30 segundos

Triosas Dihidroacetona P Gliceraldehido 3P Ac. 3-P glicerato

Tetrosas:

Eritrosa 4P

Pentosas:

Ribosa 5P Ribulosa 5P Xilosa 5P Ribulosa 1,5 di P

Hexosas:

Fructosa 6P Glucosa 6P Fructosa 1,6 di P

Heptulosas: Seduheptulosa 7P Seduheptulosa 1,7 di P

Toda la fijación fotosintética del carbono tiene lugar a través de la carboxilación de la ribulosa-1,5difosfato (C5), dando un compuesto C6, (esta reacción es catalizada por la enzima Ribulosa-1,5-difosfato carboxilaza conocida como rubisco), luego se hidroliza para producir dos moléculas de fosfoglicerato (C3). En las llamadas plantas C3, la anatomía de las hojas presenta las células del mesófilo distribuidas al azar en todo el tejido de la hoja y son los sitios primarios de fijación del CO2. fig. 1.

15

Fig. 1 Anatomía de las hojas C3 (a) y C4 (b)[3]

Plantas C4

[3, 5] Algunas plantas que crecen en regiones semi-áridas con elevada intensidad lumínica, poseen un sistema adicional de fijación de carbono; aunque es menos eficaz en la utilización de energia, si lo es para la utilización de CO2, reduciendo la fotorespiración y pérdida de agua, estas plantas son conocidas como plantas C4 donde el fosfoenol piruvato es el aceptor inicial del CO2; produciendo un compuesto C4, el oxaloacetato; luego estas reacciones se invierten en otra parte de la planta para dar CO2 que se recombina con de la ribulosa-1,5 difosfato. Las células de las plantas C4, a diferencia de las plantas C3, poseen una anatomía característica; las células del mesófilo, se encuentras organizadas en torno a las células de la vaina del haz, siendo estas, mas prominentes que sus equivalentes en las hojas C3; esta estructura se conoce como “anatomía de Kranz” o guirnalda. fig. 1. En ambos casos intervienen células del mesófilo con cloroplastos en la fijación del CO2. Sin embargo, en las hojas C4 la fijación de CO2 por el rubisco, tiene lugar en las células de la vaina del haz, mientras que en las células del mesófilo C4, se especializan en la incorporación inicial del CO2 en el ácido dicarboxílico oxaloacetato, el cual pasa al cloroplasto para reducirse a malato por medio de NADP-malato deshidrogenasa. El transporte de malato entre la célula del mesófilo y la célula de la vaina del haz, origina a la vez el transporte de CO2 entre ambas células. Fig. 2.

Fig. 2: Via C4 de fijación de CO2

[3]

Metabolismo Acido de las Crasulaceas CAM[3, 4, 5]

16

Otro grupo de plantas se conocen como plantas CAM el término significa la sigla en inglés de Metabolismo Ácido de las Crasulaceas, se denomina asi por que fue inicialmente en la familia de las Crasulaceas donde se observó un incremento de ácido málico en horas de oscuridad. Otras grandes familias como Liliaceas, Cactaceas y Euphorbiaceas poseen especies con una bioquímica similar. Al igual que en las plantas C4, se trata de una adaptación del ciclo fotosintético en vegetales en situación de sequia, pues también capturan CO2 para producir inicialmente oxaloacetato, pero lo hacen de manera distinta que las plantas C4, pues el mecanismo es temporal (fase oscura y fase lumínica) como se muestra en la figura 3.

Fig. 3 Metabolismo Ácido de las Crasulaceae (CAM)[3]

En la oscuridad el CO2 es fijado al fosfoenolpiruvato produciendo el oxaloacetato, este se oxida para dar malato, el cual se fija en la vacuola. En la luz el malato pasa la membrana entrar en los cloroplastos y descarboxilarse para ser fijado por las enzimas del ciclo de Calvin o reducirse a oxaloacetato. En general los tipos de fijación del dióxido de carbono CO2 son: Tipo de fijación Aceptor de CO2 Producto de fijación Ejemplos de plantas

C3 Ribulosa 1,5 di P Fosfoglicerato Espinaca, trigo, tabaco C4 Fosfoenolpiruvato Oxaloacetato Maíz, caña de azúcar, sorgo

CAM Fosfoenolpiruvato Oxaloacetato Piña, papaya, cactus

COMPUESTOS DERIVADOS DEL ACIDO SHIKIMICO

El ácido shikímico se aisló inicialmente en 1885 de la planta asiática "SHIKIMI-NO-KI" Illicium sp. (Fam. Illiciaceae) y es reconocido como el compuesto punto de partida para un vasto número de sustancias naturales. Su existencia como un discreto constituyente vegetal, ha sido observado en años recientes, pero no hay duda de que es el metabolito universal de las plantas superiores y de muchas clases de organismos no mamíferos.

17

OH

OH

OH

O

OH

H

H

H

OH

OH

OH

OOH

Podemos afirmar que el ácido shikímico es el precursor de la mayoría de constituyentes vegetales que contienen anillos aromáticos; dando un patrón de oxigenación en el anillo aromático claro, que permite reconocer los compuestos derivados de este; así, en compuestos aromáticos derivados del ácido shikímico, las posiciones oxigenadas son de tipo catecol (orto) o pirogalol (diorto), y en el caso de los fenoles monooxigenados son generalmente p-hidroxi-compuestos. En compuestos derivados de la ruta del Acetato-Malonato los grupos oxigenados están en disposición meta entre sí, o sea que los polifenoles son derivados tipo resorcinol. Del ácido shikímico se obtiene por hemisíntesis el oseltamivir, un medicamento antiviral selectivo contra el virus de la influenza. Lo produce la casa Roche bajo la marca Tamiflu®. El oseltamivir es una prodroga, que se transforma en un compuesto activo en el organismo disminuyendo los síntomas de pacientes con la gripe adquirida recientemente y reduce la incidencia de los síntomas propios de una gripe confirmada, como las infecciones bacterianas: bronquitis, sinusitis y neumonía. Después de su administración oral el oseltamivir inhibe la replicación del virus A y B de la gripe, y la patogenicidad in vivo en modelos animales de infección de gripe con exposiciones a antivirales es similar a la alcanzada en humanos con 75 mg dos veces al día. La actividad antiviral de oseltamivir se ha confirmado en los estudios de provocación experimental en voluntarios sanos.

BIOSÍNESIS DEL ÁCIDO SHIKÍMICO[4, 7, 8] La formación del ácido shikímico ocurre a partir de precursores de 3 y 4 átomos de carbono como son el ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y la eritrosa 4-fosfato (E4P) por una condensación de tipo aldólica, produciendo un compuesto C7 a través de una serie de etapas que se resumen en la Figura 4.

18

Acido shikímico

+2H

OH

OH

COOH

HO

-Pi -Pi

-H2O

OH

OH

O

COOH

-2H

COOHHO

OH

OH

O

COOHHO

OH

OH

HO

OOP

COOH

OH

OH

HOE4P

PEP

HO

H

OP H

O

OH

HO

O CH2

COOH

P

Figura 4. Biosíntesis del ácido shikímico a partir de fosfo enol pirúvico y eritrosa 4- fosfato.

Biosíntesis de fenilalanina y tirosina (Aminoácidos aromáticos). Los aminoácidos fenilalanina y tirosina, se sintetizan por reacciones posteriores del ácido shikímico con PEP, seguida de las transformaciones que se muestran en el esquema de la figura 6, vía del ácido corísmico como intermediario del ácido prefénico para luego formar el fenilpirúvico. En microorganismos y plantas, estos aminoácidos, se forman separadamente a partir del ácido prefénico, ver Fig. 5. Los ácidos prefénico, fenilpirúvico y el p-hidroxifenilpirúvico son los precursores de fenilalanina y tirosina, estos aminoácidos son los constituyentes universales de proteínas y es punto de partida de la secuencia biosintética que lleva a los llamados compuestos C6C3

COOH

OH

OHHO

ATP

COOH

OH

OHPO

CH2

COOHPO

..

H+

COOH

OH

PO OOP

COOH

HH

H-HOP

COOH

PO

OH

O COOH

CH2

-HOP

COOH

CH3

O

CH2

COOH

Ac. corísmico

Ac. shikímico

O

COOH

OH

O

OH

Ac. prefénico

NH2

COOH

R

R=H: fenil alaninaR=OH: tirosina

-CO2tranaminación

OH

Figura 5. Biosíntesis de fenilalanina y tirosina

En el caso de los animales, se produce la hidroxilación directa de la fenil alanina a tirosina y luego a dihidroxifenil alanina (L-DOPA), precursor de las catecolaminas como el neurotrasmisor noradrenalina y la hormona adrenalina, como se muestra en la figura 6.

19

COOH

NH2

COOH

NH2

OH

COOH

NH2

OH

OHO2 O2

L-Phe L-Tyr L-DOPA

Catecolaminas

N

O

OH

COOH

NH

OH

OH

COOH

COOH

NH2

O

O

[O]

DOPAquinonaDOPAcromo

Melanina

Figura 6: Formación de la melanina[4]

Biogénesis de los ácidos cinámicos La ruta principal para la producción de los ácidos cinámico a partir de fenilalanina o tirosina, se reveló cuando se encontró que los tejidos vegetales contienen sistemas enzimáticos capaces de catalizar la remoción de amoníaco de estos aminoácidos:

COOH

NH2R

COOH

R

R = H, FenilalaninaR = OH, Tirosina

R = H, Acido cinámicoR = OH, Acido p-cumárico

(PAL ó TAL)

-NH3

En los mecanismos PAL (fenilalanina-amonioliasa) o el TAL (tirosina-amonioliasa) las enzimas actúan sobre los grupos salientes en posición trans, como una eliminación de tipo Hoffmann Fig. 7.

COO-

H3N+

HSHR

Figura 7: Eliminación de tipo Hoffmann.

Las evidencias experimentales muestran al parecer que la enzima (PAL) se encuentra ampliamente distribuida en los vegetales, mientras que la (TAL) se encuentra principalmente en ciertas gramíneas. Estas enzimas son esteroespecíficas ya que son capaces de desaminar los L-aminoácidos pero no los D-aminoácidos. Los ácidos cinámicos producidos por acción de los aminoliasas, constituyen el punto de partida para una cantidad enorme de procesos metabólicos secundarios. Fenilpropanoides C6C3, C6C2 Y C6C1. Compuestos C6C3 (Ácidos cinámicos) La importancia fundamental de la secuencia de reacciones ácido shikímico → ácido prefénico → fenilalanina (o tirosina) → ácidos cinámicos, y la amplia distribución natural de los ácidos cinámicos y sus productos de biodegradación, lleva a la conclusión de que muchos compuestos naturales que contienen cadenas laterales de 3 átomos de carbono ligados a núcleos fenólicos, son productos de reducciones biológicas de los ácidos cinámicos; la naturaleza ofrece muchos ejemplos de casi todos los niveles de oxidación de la cadena lateral de estos compuestos. Figura 8.

20

Una característica estructural general, en este tipo de sustancias es la presencia frecuente de funciones oxigenadas en posiciones 4, 3 y 4, 4 y 5 y 3, 4 y 5, que son las mismas posiciones oxigenadas presentes en el ácido Shikímico.

R

OR

OR

RO

1

3

45

COOH

NH2

COOH

NH2HO

COOH

NH2

HO

HO*

COOH COOH

HO

COOHHO

HO

-NH3-NH3 -NH3

ácido cinámico p-cumárico(Gramineae)

cafeico

COOHCH3O

HOOCH3

COOHO

O

[O]

[O]

[O]

COOHCH3O

HO

C1

C1

COOHCH3O

HOOH -2H

ferúlico

sinápico(Angioespermas)

metilencafeico

* Ocurre en microorganismos y en animales NO ocurre en plantas

Figura 8. Formación de fenil propanos a partir de fenil alanina y tirosina Es interesante anotar que en ciertos casos los isómeros alil y propenil se encuentran juntos en algunas plantas. Por ejemplo, el safrol y el isosafrol se encuentran en Cananga odorata (Fam. Annonaceae), y la miristicina junto con la isomiristicina en Myristica fragrans (Fam. Myristicaceae).

alil fenol

propenil fenol

CH2

HO

CH3

HO-X-H

CH2X

HO

CH2X

HO

Es muy probable que ambos isómeros sean biosintetizados de manera independiente, es decir que es improbable un proceso de isomerización del uno para generar el otro. Los siguientes son los núcleos principales de los fenil propanos, se puede observar que las sustituciones oxigenadas del anillo son en para o en meta de la cadena

21

trimetilgalilsiringil3,4-metilendioxilveratrilguayacilcatequil4-hidroxifenil

R

OCH3

OCH3CH3O

R

OH

OCH3CH3O

R

O

O

R

OCH3

OCH3

R

OH

OCH3

R

OH

OH

R

OH

CH2

OH

H3CO

CH2

O

O

CH2

O

O OCH3

CH2

OCH3

COOH

OH

OH

Eugenol Safrol- Miristicina Anetol Ac. clorogénico

Entre los derivados de los ácidos cinámicos, se encuentra el cloranfenicol (cloromicetina), agente bacteriostático de amplio espectro, inicialmente aislado de cultivos de Streptomyces venezuelae, se sintetiza a partir de la tirosina por medio de una aminación produciendo la p-aminofenilalanina (L-PAPA), que luego de una serie de reacciones produce el cloranfenicol. Actualmente es sintetizado en forma de ésteres (succinato y palmitato); activo frente a bacterias gram-positivas y gram-negativas, incluyendo anaerobios, clamidias y ricketsias. Exhibe actividad bactericida frente a Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis. Por sus efectos secundarios, actualmente no se considera antibiótico de primera elección. Su biogénesis se muestra en la figura siguiente:

COOH

OH

NH2

COOH

NH2

NH2

COOH

NH2

NHCOCHCl2OH

CH2OH

NO2

NHCOCHCl2OH

hidroxilaciónN-acilación

Tirosina p-aminofenilalanina cloranfenicol L-PAPA Compuestos C6C2 Una clase de compuestos C6C2 que provienen de compuestos C6C3 por un proceso de descarboxilación, estos compuestos son derivados tipo estireno, fenil etanoide y acetofenona,

CH2 CH3 CH3

O

Estireno fenil etanolide acetofenona Compuestos C6C1 A partir de los ácidos cinámicos las plantas pueden generar compuestos aromáticos C6C1, formando inicialmente el éster de la coenzima A del ácido cinámico, el cual puede sufrir degradación de la cadena lateral, mediante un proceso enzimático similar a la β oxidación de los ácidos grasos. El esquema de este proceso es e1 descrito en la Figura 9.

22

COSCoAO

R

COOH

R

COSCoA

R

COSCoAOH

H

R

OH

O

R

SCoA

O

R

CoASH H2O

[O]Ac. Shikímico

HSCoACH3SCoAHSCoA H2O

[O]

Figura 9. Biogénesis de compuestos C6C1

E1 derivado del ácido benzoico así originado, puede descarboxilarse para generar compuestos C6, o sufrir una o varias etapas de reducción para generar derivados tipo benzaldehído, alcohol bencílico y compuestos derivados del tolueno.

COOH

R

CHO

R

CH2OH

R

CH3

R

2H 2H 2H

Derivadosbenzaldehído

Derivados tipoalcohol bencílico

Derivadostipo tolueno

CompuestosC6 (bencenoides)

-CO2

Compuestos C6 Son pocos los compuestos C6, que han sido aislados en la naturaleza, los más comunes son la arbutina (el β-D-glucopiranósido de la hidroquinona) y su éter metílico. La arbutina es derivada de la ruta del ácido shikímico→fenilalanina; esto se comprobó por experimentos en los cuales se administró fenilalanina, ácido cinámico, tirosina y ácido shikímico marcados con 14C, a hojas de Pera, Pyrus communis (familia Rosaceae), demostrando que la arbutina era originada a partir de estos precursores ya que efectivamente se aisló arbutina radiactiva. Estos resultados y la posterior demostración experimental de la formación de arbutina a partir de fenilalanina marcada en Grenvillea robusta (Fam. Proteaceae) confirmaron este hallazgo. Esta biogénesis se esquematiza en la Figura 10.

O

OH

R

Acidoshikímico

RCO2

Si R=OH

HOHO

OH [O]Glicosilación

HO

OGlucosil

Arbutina Figura 10. Biogénesis de arbutina

Ejemplos de compuestos C6C1 y C6.

23

COOH

HO

COOH

HO

OCH3

COOH

OCH3

CH3O

HO

COOH

OH

COOH

HO

OH

COOH

HO

OH

HO COOH

OHHOHO

HO

OH

Acidop-hidroxibenzoico

Acidovanílico

Acidosiríngico

Acidosalicílico

Acidoprotocatechuico

Acidogálico Antiarol

Acidogentísico

CHO

OH

OCH3

OCH3

OHCHO

O

O

Vainillina Alcohol anísico piperonal

COMPUESTOS C6C2C6 (ESTILBENOS) [4, 5, 11]

Los eltilbenos son compuestos naturales de frecuente aparición en diferentes familias de plantas como Cyperaceae, Dipterocarpaceae, Gnetaceae y Vitaceae, pueden encontrarse libres o como glicósidos. Pertenecen al grupo de los polifenóles no flavonóidicos, su esqueleto estructural comprende dos anillos bencénicos unidos por un puente etileno (C6-C2-C6) donde el resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilbenceno), con gran actividad antioxidante; es de anotar que el resveratrol proviene de dos vías metabólicas diferentes, vía acetato (el primer anillo) y vía ácido shikímico el segundo anillo.

OH

OH

OH

OHOCH3

H3CO

H3CO

H3CO

Resveratrol Combrestastatina A-4

El resveratrol de Vitus vinifera (Vitaceae) y otros estilbenos como la combrestastatina A-4, del sauce africano Rhus lancea (Anacardiaceae) mediante inhibiciones enzimáticas, se ha demostrado que actúan como compuestos quimiopreventivos del cancer, capaces de prevenir, inhibir o reversar procesos de carcinogénesis. La biosíntesis de los estilbenos se produce por el alargamiento de cadena de un cinamil CoA (via shikímico) con tres unidades de malonil CoA (via acetaro).

OH

O

CoAS3xmalonilCoA

SCoAO

O

O O

OH

-CO2

cond. aldolicaOH

OH

OH

4-hidroxicinamil

-CoA resveratrol

Biogénesis de estilbenos[4]

24

Plantas que contienen compuestos fenil propanos[5, 11, 12] Las hojas secas de Gayuba, Arctostaphylos uva-ursi, Fam. Ericaceae. La gayuba es un pequeño arbusto perenne de montaña, localizado en centro y norte de Europa y en Norteamérica. El extracto acuoso de las hojas secas de Gayuba, es tradicionalmente utilizado para el tratamiento de infecciones en las vías urinarias (Farmacopea Francesa 10a edición). La gayuba es diurética y astringente, durante la excreción ejerce una acción antiséptica sobre las vías urinarias, en forma tópica se usa para quitar manchas de la piel. La droga contiene flavonoides, ácido ursúlico (triterpeno pentacíclico), 10% de taninos gálicos y entre 5 y 10% de arbutosido y metil arbutosido. Vainilla, Vainilla planifolia, Fam. Orchidaceae. La vainilla esta constituida por los frutos inmaduros, curados y desarrollados de la orquidea Vainilla planifolia, cultivada en de Méjico y algunas islas oceánicas. La vainilla verde contiene heterósidos principalmente glucovanillina y alcohol glucovanillico. Durante el curado, estos compuestos sufren oxidación e hidrólisis, los principales constituyentes son vainillina, anisaldehido y piperonal. Fruto de anís, Pinpinella anisum, Fam. Unbelliferae/Apiaceae. Esta es una planta herbácea originaria de Egipto y del Medio Oriente y cultivada en casi todas las regiones del planeta. La droga comprende los frutos maduros y secos, son de color gris verdoso y olor aromático agradable, empleados en forma natural como infusiones es carminativo, estomacal, antiespasmódico expectorante, germicida y aromatizante. Los frutos contienen entre 2 a 3% de aceite esencial, este es incoloro cuyo principal componente es el anetol (hasta un 90%), estragol, anisaldehído. Uva roja, Vitus vinifera, Fam. Vitaceae Los frutos de esta planta, la uva oscura de pulpa roja es comestible y materia prima para la fabricación de vino y otras bebidas alcohólicas. La coloración es debido a una importante concentración de compuestos de tipo antocianinas, concentración que varia en función del tiempo de maduración. Sus principales compuestos activos se encuentran en las semillas y en la “piel” de la uva. Entre éstos se destacan los flavonoides, polifenoles (entre ellos el resveratrol), antocianinas, proantocianidinas,

COMPUESTOS (C6C3)2 (LIGNANOS)[1, 4, 6- 8, 10] Los lignanos son una clase de compuestos derivados de fenilpropanos ampliamente distribuidos en la naturaleza, formados por dimerización oxidativa de unidades C6C3. Dentro de esta clase de compuestos, se pueden distinguir varios grupos: Los lignanos propiamente dichos: son dímeros oxigenados de fenilpropanos sencillos con puente β-β' en la cadena lateral.

β β'

25

De estos dímeros se han aislado mas de 500 compuestos en aproximadamente 60 familias, del orden Magnoliales y Piperales, se han encontrado principalmente en Myristicaceae, Magnoliaceae, Piperaceae y Aristolacaceae. En raíces y rizomas de especies de Podophyllum Berberidaceae, y de otras especies, se extraen las tetralinas como podofilotoxina[9], un anticancerígeno; en raíces de Artemisia absinthium (Asteraceae), se han extraído furofuranos de tipo sesamina, usado como sinergista de piretros, el ácido nor-dihidroguairético y sus derivados, presentan una importante actividad antioxidante.

O

O

O

O

CH3O

OCH3

OCH3

OH

O

O

O

O

OO

podofilotoxinasesamina

Los lignanos propiamente dichos, dependiendo de las cadenas laterales, se pueden dividir en cinco grupos de estructuras fundamentales: Diaril butanos cuando las cadenas laterales no son sustituidas como el caso del ácido guairético.

Ácido guaiarético Butirolactonas, una de las cadenas es un ácido carboxílico y la otra un alcohol que al deshidratarse forman una lactona, pueden ser saturadas o insaturadas.

OH3CO

HO

O

O

O

O

OH

OCH3

O

O

O

5-metoxi-isoyateina chaerofilina

Furanos y Furanoides

O

O

O O

O

O

CH3CH3

OH

H3CO

OCH3

OH

Galbacina furoguayacina

Furofuranos o Difuranos

H3CO

OH

CH3

CH3

OH

OCH3

α

β

β

α ''

26

O

O

O

O

OCH3

OCH3

OCH3

Aschantina

Ariltetrahidronaftalenos (Tetralinas)

CH3

CH3O

O

OH Atenuol

Neolignanos: son compuestos cuyas uniones son diferente a β-β'

O

OCH3

OCH3

OCH3

OH

H3COCH2

OOH

OH COOH

OH

OH Äcido rosmarínico Eusiderina

O

CH2

CH2

OCH3

CH3

O

CH2

O

O

CH3

CH3O

OCH3

CH3

O-metil magnolol kadsurenona Lignoides o los Oligómeros de lignanos, con este término se designa al resultado de la condensación de tres a cinco unidades de fenilpropanos. Lignanos diversos

CH3

CH3

O

O

O

O

O

OCH3

CH3

CH3

CH3 Schisandrina B

Lignanos conjugados Dentro de esta clase de sustancias existen los lignanos conjugados con otros compuestos fenólicos como los flavolignanos: condensación entre un lignano y un flavonoide, constituyentes de Sylibum marianum (Asteraceae) o cardo mariano.

27

O

O

O

OH

O

OHOH

OOH

OH CH3

= R

Silibina

O

OHR

OH

O

OH

CH3

O

O

OH

R

O

OH

CH3

Silicristina Silidianina Constituyentes de Silimarina

BIOGÉNESIS DE LIGNANOS La biogénesis de los lignanos se basa en el acoplamiento oxidativo de fenoles, este acoplamiento por dimerización de los precursores C6C3 puede explicarse de forma bi-electrónica o por radicales libres. El acoplamiento bi-electrónico se explica según el esquema siguiente[8]: Luego del acoplamiento oxidativo de fenoles, actuan NADPH +H+ y aromatizar los anillos, según el esquema de la formación del ácido guaiarético por radicales libres (ver adelante).

R

OH

R

-OH

+

O-

R

O-

R R

O

R

O

Ac. guayarético

E1 acoplamiento mediante radicales libres, mostrado en el esquema siguiente, permite determinar las posiciones activas del anillo las cuales son en para y en meta a la cadena lateral[4]:

XR'

HO

R

X= CH3, CH2OH, COOHR,R'=H, OH, OCH3

-H.

XR'

O

R

. .. .

X

O

R

R' X

O

R

R' X

O

R

R'

I II III IV

28

En la estructura IV, el radical libre se encuentra en la posición β de la cadena; por lo tanto, cuando se unen dos estructuras del tipo IV se forma un lignano, cuando se unen dos estructuras diferentes a IV-IV se forma un neolignano.

XX

O O

R'

R''R''

R'

CH3H3C

O O

OCH3H3CO

H

H+

O

H3CO

OH

OCH3NADPH+H+

H+

H3CO OCH3

HO OH

Ac. guayarético Formación del ácido guaiarético

O

OCH3

O

H3COIV + IV

O

H3COOCH3

OH

O

H

-OHH+

H+

OCH3

OHHO

H3COO

galgravina

Biogénesis de la galgravina

O

HOOH

O

H3CO OCH3

O

OH

..

O

HOOH

OH

O

OCH3H3CO

O

O

HO

O

OCH3H3CO

O

O

-H2O

O

OH

OH

OH

O

O

O

OCH3CH3

H+

OH-

O

OH

O

O

OO CH3CH3

O

O

CH3

O

O

OH

OH

O

OH

O

O

CH3CH3

O

O

O

O

O

O CH3

CH3

CH3

OH-H2C

OH

2SAM

Podofilotoxina

-OH

Biosíntesis de la podofilotoxina.

EXTRACCIÓN DE LIGNANOS Los lignanos se pueden aislar por extracciones con metanol seguidas por particiones con solventes de diferentes polaridades. Los lignanos que poseen grupos fenólicos, se pueden separar por precipitación; a las soluciones alcohólicas se les adiciona KOH acuoso concentrado, estos se precipitan como sales de potasio o con acetato de plomo, precipitan como sales de plomo, en este último caso, los fenoles se liberan por la adición de H2S a la suspención alcohólica. Una vez obtenido el extracto, se monitorea por cromatografía en capa fina (ccf) y las manchas se observan en UV a 254 nm o con vapores de yodo.

29

CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LIGNANOS Una característica importante de los lignanos, es que todos producen rotación específica de la luz polarizada, o sea tienen un valor de α]D. Los espectros UV carecen de detalles particulares exceptuando aquellas conjugaciones con los anillos aromáticos, generalmente tienen dos máximos de absorción de similar intensidad uno entre 230 – 240 nm y el otro entre 280 y 290nm.Las insaturaciones conjugadas con los anillos aromáticos originas desplazamientos de las señales. El espectro de masa muestra los diferentes fragmentos para la asarinina un bifuránico y para el dimetoxi galgravina un tetrahidrofurano.

O

O

O

O

O

O

O+

CH2

Ar CH2-CH2CH

OH

ArAr-CH=CHCH2

m/e= m/e= m/e= m/e=354 203 179 161

O

CH3CH3

H3CO

OCH 3OCH 3

OCH 3

OCH 3

OCH 3

CH3

CH3

H3CO

OCH 3

O

H

Señales de 1H RMN de lignanos tipo tetrahidrofuránico y arilnaftalinlactona[13]

O

CH3 CH3

O

OH O

O

O

CH3CH3

CH3

CH3

3.91

5.60 6.937.0

7.04 5.10

1.08 1.05

1.781.78

4.436.55

6.553.83

3.83

3.83

O

O

O

O

O

OH

O

HH

HH

5.93 5.94

7.32

7.69 8.36

6.60

6.77-6.94m

6.03

6.06

INTERÉS BIOLÓGICO DE LOS LIGNANOS[11] Gran número de lignanos y neolignanos poseen diferentes usos terapéuticos, en especial como inhibidores enzimáticos y antihipertensivos como los derivados del pinoresinol, potencializadores de la acción de piretros, como el aceite de sésamo, hepatoprotector como la schisandrina B aislado de los frutos de Schisandra chinensis Fam. Magnoliaceae, etc. pero solo los derivados hemisintéticos de la podofilotoxina, con propiedades citostáticas y antimitóticas, y los flavolignanos del cardo mariano, con propiedades antioxidantes y hepatoprotectoras, se encuentran con formulaciones farmacéuticas y son explotadas terapéuticamente.

30

ALGUNAS PLANTAS QUE CONTIENEN LIGNANOS[5, 9-11]

Podofilo, resina de podofilo, Podophyllum peltatum, Fam Berberidaceae La droga esta constituido por las raíces y el rizoma desecado, es una planta herbácea, perenne, común en lugares húmedos del oriente de Canadá y Estados Unidos. Los principios activos del podofilo entre 8 y 12%, son podofilotoxina y α y β peltatina, los cuales se obtienen precipitando el extracto alcohólico de resina en agua. La resina de podofilo es citotóxica y se usa localmente en el tratamiento de verrugas. Hyptis verticillata, Fam. Lamiaceae [9, 10, 13]. Las partes aéreas de este arbusto de 1 a 2 metros de altura, son usadas por los indígenas centroamericanos, como antibacteriano y antiinflamatorio, antihelmíntico y antifúngico. Contienen triterpenos, esteroides y los lignanos podofilotoxina, β peltatina y ácido rosmarínico. Cardo mariano, Silybum marianum, Fam. Asteraceae[4, 11, 12]

Hierba bianual que alcanza hasta los 2 m de altura, con hojas alternas, grandes, y el margen muy espinoso, limbo verde oscuro, brillante, con manchas blancas irregulares.

Las semillas de Cardo Mariano, desde épocas antiguas, han sido utilizadas en el tratamiento de los trastornos hepáticos. La semilla está compuesta por: principios amargos, aceite esencial, resina, tiramina, hitamina y flavonas. El componente más importante y que justifica su acción es la silimarina que es un componente ligno-flavonoide muy amargo y con marcada acción hepato-desintoxicante y regenerador hepático, por lo que resulta particularmente útil en el tratamiento de trastornos hepáticos, tanto lesionales como funcionales, tóxicos (tetracloruro de carbono, tioacetamida, paracetamol, etc.), infecciones virales (hepatitis tipo A, B, etc.).

ESTRUCTURAS POLIMÉRICAS A partir de derivados del ácido shikímico, se forman tres tipos de polímeros ver Fig 11: Las ligninas, los taninos y los derivados de la tirosina, pasando por dopa amina y que genera la melanina responsable de la pigmentación de la piel. Ligninas son polímeros de unidades C6-C3 con peso molecular alto ∼8000 correspondiente a ≈40 unidades y constituye entre un 22 a un 34% de la madera, contienen tres tipos de residuos aromáticos el Guaiacil o coniferil, el siringil o sinapil y el p-cumaril. Se detecta la lignina con el test de floroglusinol en HCl dando un color rojo o también con el test de Maüle, que se puede determinar la clase de material vegetal, se trata el material con KmnO4 seguido de HCl y luego amoniaco, dando un color púrpura para las Gynnospermas y un color marrón para las Angiospermas dependiendo de cual sea el residuo. Los polímeros de las Gymnospermas contienen solo residuos de alcohol coniferilico, las Angioespermas dicotiledoneas contienen los residuos coniferil alcohol y sinapil alcohol, mientras que las Angioespermas monocotiledoneas contienen los tres residuos coniferil alcohol, sinapil alcohol y p-cumaril alcohol[4].

31

GymnospermasOCH3

OH

Angiosperma(Dicotiledoneas)

Angiosperma(Monocotiledoneas)

OCH3

OH

OCH3

OH

OCH3

OHCH3O

OCH3

OHCH3O

OH

p-hidroxifenil p-cumaril

siringilsinapil

guaiasilconiferil

Taninos[1, 5, 11, 14] son sustancias de origen vegetal y de estructura polifenólica, peso molecular entre 500 y 3000; son amorfas, de sabor astringente, solubles en agua, en alcohol y en acetona en forma de soluciones coloidales, pero su solubilidad depende del grado de polimerización, son insolubles en solventes apolares;, por su capacidad de precipitar proteínas, se usan para curtir la piel.

Se encuentran repartidos en la mayoría de las especies vegetales, especialmente en familias como: Coniferae, Ericaceae, Labiadas, Leguminosae, Myrtaceae, Poligonaceae, Rosaceae Rubiaceae, Fagaceae, fabaceae, etc.

Desde el punto de vista farmacológico, presentan acciones derivadas de su capacidad de formar complejos y precipitar metales, alcaloides y proteínas:

• Astringentes y antidiarreicos, se unen y precipitan las proteínas presentes en las secreciones.

• Antimicrobianos y antifúngicos.

• Antídotos para el envenenamiento con alcaloides y metales pesados. Su toxicidad en general es baja y deriva de la posible intolerancia gástrica y estreñimiento que pueden causar.

Se localizan en vacuolas, combinados con alcaloides y proteínas y desempeñan una función defensiva frente a insectos: agallas, maduración de los frutos. Se pueden encontrar en todos los órganos de la planta: Corteza: roble (Quersus colombiana), castaño (Sterculia apetala), eucalipto (Eucalyptus globulus), granada (Punica granatum), canela (Cinnamomum zeilanicum), quina (Cinchona sp.) Madera: mangle (Rhysophora mangle), acacia (Delonix regia). Hoja: hamamelis (Hamamelis virginiana), té (Thea sinensis), guayaba (Psidium guajava), almendro (Terminalia catappa). Flores: rosa roja (Rosa canina). Granos o semillas: café (Coffea sp.), kola (Cola nitida). Tejidos patológicos y órganos viejos: agallas de alepo (corteza de roble resultado de la descomposición debido a la ovoposición de las avispas.

32

Taninos hidrolizables: galotaninos y elagitaninos, que pueden ser hidrolizados por ácidos o enzimas, son formados por varias moléculas de ácidos fenólicos derivados del shikímico unidos por enlaces éster a un núcleo central de glucosa. Taninos condensados o proantocianinas o también llamados catecol taninos, son moléculas más resistentes a la ruptura y cuyas unidades son derivados flavonóidicos, estos taninos se estudiaran mas adelante. En este capítulo solo hablaremos de los taninos hidrolizables. Galotaninos Los galotaninos son aquellos en los cuales son unidades comprenden ya sea el ácido gálico o el ácido digálico. Algunos ejemplos ruibarbo, clavero, pétalos de rosa roja, hojas de gayuba, agallas de China, hamamelis, castaño y arce Elágitaninos son aquellos cuyas unidades contienen el ácido elágico o el ácido hexahidro difénico. Algunos ejemplos Eucalipto, castaño, corteza de roble.

COOH

OHOH

HO COOH

HO

HO

OC

HO

HO

HOO

C

O

OH

OHO

C

O

HO

HOO

HOOC OH

OH

COOH

HO

HO

HO

OH

ácido gálico ácido digálico ácido elágico ácido hexahidroxidifénico

Estos taninos pueden ser hidrolizados por enzimas cono la tanasa, secretada por Aspergillus sp. y Penicillum sp., hidrolizando la glucosa y liberando los ácidos que los conforman. Las soluciones acuosas de los taninos precipitan con sales de metales pesados Cu, Fe, Hg, Pb, Zn. Con sales férricas los taninos hidrolizables producen una coloración azul oscura y los taninos condensados una coloración verdosa. PRINCIPALES PLANTAS QUE CONTIENEN TANINOS[5, 11, 15, 16]

Agallas de Roble (alepo) Quercus infectoria, Fam. Fagaceae Son excrecencias o verrugas formadas sobre las ramas jóvenes del roble, como resultado de la ovodeposición de la avispa de agalla (Adleria gallaetinctoriae), al desarrollarse la larva, induce a la proliferación celular de los tejidos del huésped, formándose una masa globosa, dura y densa de coloración variable, donde se acumulan ésteres galotánicos de glucosa en gran proporción (50-70%). Hamamelis Hamamelis virginiana, Fam. Hamamelidaceae. Es un arbusto de 2 a 5 m de altura, ampliamente distribuido al norte de América, la droga esta constituida por las hojas secas, utilizadas por sus propiedades astringentes y vasocontrictoras. Las hojas de hamamelis contienen ~10% de galitaninos y elagitaninos, proantocianinas y principios amargos.

33

galotaninos

n

O

CH2OH

OH

OR

O

OR

CO

HO

OH

O C

OOH

OH

OC

O

HO

HO

HO

HO

MeO

HOH2C

OMeO

HOH2C

CH2OH

MeOHO

HOH2C

MeO

O

R

RN

CO2H

O

O

H

H

O

O

CO2HN

H

O

O

CO2HN

taninos

ligninamelanina

coniferolHO

MeO CH2OH

NCO2H

O

O

H

ác.gálico

ác.caféicotirosina

CO2H

HO

HO

OH

OH

HO

CO2H

NH2

CO2H

HO

Fig. 11: Diferentes estructuras poliméricas derivadas de fenilpropanos.

Almendro tropical Terminalia catappa, Familia Combretaceae Árbol exótico ampliamente distribuida en zonas tropicales y subtropicales es considerado como la mayor fuente de taninos del trópico, de altura considerable de hasta 25 metros y cañón recto, cuyas ramas o brazos casi horizontales, saliendo de un mismo punto en todas direcciones, asemeja un quitasol sin curvatura; por cuya agradable y peregrina apariencia se destina para alamedas y jardines; la madera es blanca, cáscara lisa, roja por dentro; hojas grandes, nerviosas, ovoides, algo angostadas por sus extremos y rematando en punta, verdes o moraduzcas, verdes amarillosas por debajo y ásperas; flores pequeñas, inodoras, de un verde blancuzco y en espigas; el fruto se asemeja a la almendra común. Las hojas han sido empleadas en la medicina tradicional en Taiwan, La India, Filipinas, Malasia e Indonesia, para el tratamiento de la dermatitis y la hepatitis[16]. Los compuestos presentes en las hojas de la Terminalia catappa son fundamentalmente taninos hidrolizables como: punicalagina, punicalina Fig. 12, ácido chebulágico y geranina.

O

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

O

OOH

OH

OH

OH

OH

O

O

O

O

OHO

OH

O

O

O O

OH

OH

OH OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH

OH

CH3

OH

OH

OH

O

OH

O

O

Fig. 12. Estructuras químicas de punicalina y punicalagina.

34

CUMARINAS[4, 5,9, 10, 17, 18] Las cumarinas su nombre viene de “Coumarou” nombre común de la haba tonca (Dipteryx odorata Willd., Coumarouna odorata Aubl. Fam. Leguminosae/Fabaceae), son metabolitos típicos de plantas superiores y algunos pocos microorganismos, su núcleo es benzo 2 pirona o benzo α pirona. En general son lactonas insaturadas y comprenden otra clase de compuestos C6C3, prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente oxigenado en posición 7, ya sea hidroxilado como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Se han aislado unas 1000 cumarinas naturales en unas 150 especies distribuidas en aproximadamente 30 familias, principalmente en Umbeliferae/Apiaceae, Rutaceae, Leguminosae/Fabaceae, Papilionaceae, Rubiaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Solanaceae, Gramineae, etc. En forma libre o como glicósidos. La propiedad física mas importante de estos compuestos es la fluorescencia generada con la luz ultravioleta (365 nm), propiedad ampliamente usada para su detección. Estos compuestos presentan un amplio rango de actividad biológica, podemos citar: la acción anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica de la novobiocina, la hepatoxicidad y carcinogenicidad de ciertas aflatoxinas, la acción estrogénica del cumestrol, la acción fotosensibilizadora de ciertas furanocumarinas, etc., se destaca además, el uso de cumarinas como saborizantes y en perfumería[17, 18]. Las cumarinas se clasifican en:

Cumarinas simples Cumarinas complejas

Estas a su vez, se clasifican en Furanocumarinas y Piranocumarinas, las cuales, dependiendo de la posición del anillo furano o pirano, se subclasifican en lineales y angulares.

Cumarinas diversas Biosíntesis de cumarinas La biogénesis de las cumarinas simples presentes en Gramíneas y algunas plantas superiores, se derivan biogenéticamente del ácido shikímico, vía ácido cinámico, la especificidad del proceso consiste en la hidroxilación del carbono 2, produciendo un rompimiento (β-oxidación) de la cadena lateral, como ocurre en plantas del género Salix, o una isomerización de la cadena y posterior lactonización, generando la umbeliferona, se explica según el esquema siguiente[4, 11],

OH

COOH

OH

COOH

OH

COOH

OH OGlu

COOH

OGluOH O OOH

COOH

OGluOH

[O] Glu

ß-oxidación -Glu

COOH

OHOH

-Glu

Ácido salicílico umbeliferona En general la formación de cumarinas en plantas superiores, ocurre en forma radicalaria, por acción de enzimas del tipo peroxidasa, como se muestra en la figura 13.

35

PEROXIDASA

OH

O

OH

OH

O

OH

O

O

OH

O

O

OH

OH OOH

OH

OH OOH

OH

OH OO

OH OH

H H

O OOH

OH

O OOH

OH

H2O2

H2O

BIOSINTESIS DE COUMARINAS

Figura 13 Biosíntesis de las cumarinas

Las cumarinas simples pueden tener sustituciones oxigenadas en las posiciones 6, 7 y 8 del núcleo bencénico, como se muestra en la siguiente tabla.

O O1

2

3

456

7

8

R6 R7 R8 NOMBRE ORIGEN PRINCIPAL H H H Cumarina Haba tonca Leguminosae / Fabaceae, H OH H Umbeliferona Solanaceae, Thymeliaceae H OCH3 H Herniarina Compuesta Lavandula sp, Ruta graveolens

OH OH H Esculetina Castaño de indias Rosaceae H OH OCH3 Hidrangetina Hydrangea macrophylla (Hortensia)

OCH3 OH H Escopoletina Tabaco, Bella dona Solanaceae OCH3 OH OH Fraxetina Apocinaceae (Echites ursuta), Oleaceae

Cumarinas complejas Además de las cumarinas simples citadas anteriormente, también se originan a partir del ácido shikímico las llamadas cumarinas piránicas y furánicas, estas a la vez se dividen en lineales y angulares dependiendo de la posición donde se condensa el isopentenil pirofosfato para luego ciclarse y formar el heterociclo. Furanocumarinas. En 1934 se aisló el primero de estos compuestos, el bergapteno (psoroleno metoxilado en posición 5) de Citrus bergamia y posteriormente la xantotoxina (8 metoxi psoroleno); en 1940 se identificaron estos compuestos como los

36

responsables de producir fotodermatitis, estos compuestos son altamente fluorescentes bajo luz UV y aun en la región visible.

OO O

O

O

O

O

O

CH3

CH3

OH

OO O

CH3

CH3

OH

Sposoleno Angelicina

Marmesina Columbianetina

Furanocumarinas

Los Psoralenos o furanocumarinas lineales[4, 8, 17], son ampliamente distribuidas en plantas y son particularmente abundantes en Umbeliferae (Apiaceae) y Rutaceae, los ejemplos mas comunes son psoraleno, bergapteno (visnagina), xantotoxina (metoxaleno) e isopimpinelina (kelina). Las plantas que contienen sporalenos, son usadas interna o externamente en “PUVAterapeutico” (tratamiento fotoquimioterapeutico donde se utiliza el Psoraleno con la luz ultravioleta A –cercana al visible-) en el tratamiento de la de psoriasis, vitiligo, y otras afecciones de la piel o para producir bronceado.

O O O

R1

R2 Psoraleno: R1=R2=H Bergapteno: R1=OCH3, R2=H Xantotoxol: R1=H, R2=OH Xantotoxina: R1=H, R2=OCH3 Isopimpinelina: R1=R2=OCH3

El metoxaleno[4, 9, 11] o xantotoxina, un constituyente de los frutos de Ammi majus Umbeliferae (Apiaceae), (apio cimarrón) es usado para facilitar la repigmentación de la piel, en casos de vitiligo y psoriasis, administrado via oral y luego exposición a la luz UV, minimiza el riesgo de quemaduras extremas y cáncer de piel, el metoxaleno reacciona con las bases pirimídicas del DNA inhibiendo la replicación y reduciendo la rata de división celular.

NHCH3

O

O N

R

O

O

O

OCH3

O

O

O

ON

NH

O

R

O

CH3

CH3

O

O

O

O

NNH

N

NH

O

O

O

O

R

R

CH3

CH3

CH3

hv hv

Timina de DNA xantotoxina aducto DNA-psoroleno diaducto DNA-psoroleno La actividad fotosensibilizante de estos compuestos, se explica fundamentalmente por la reactividad en su estado excitado triplete (T1) (ver esquema), que se genera por efecto de la luz UV, ocasionando posibles reacciones de tipo radicalario, pueden ser reacciones

37

enlazantes con proteínas o macromoléculas (DNA o RNA) y proteínas, o reacciones de transferencia de energía al oxigeno molecular[19]. Desactivación de los estados excitados

QFotorreacciones

Fotorreacciones

F

T1

S0

CS

QFlhν

S1

Fl: Fluorescencia, F: Fosforescencia, Q: Calor, CS: Cruzamiento entre sistemas, S0: Estado singlete, S1: Estado excitado, T1: Estado triplete

Las piranocumarinas tienen el núcleo pirano unido en posiciones 6-7: tipo xantiletina y 7-8: tipo sesilina.

OOCH3

CH3

O OO

CH3

CH3

O

Xantiletina Sesilina La biogénesis de estas cumarinas relativamente complejas, puede proceder por una ciclización de una cumarina simple previamente prenilada[11], e1 esquema general para la biogénesis de este tipo de cumarinas es el mostrado en la figura 14:

O OO

O OHO

-H.

.

CH2OPP.-H

CH2.

O OO O OHO

OHO- marmesina

NADP+O O O

psoroleno

O

Figura 14: Biogénesis del psoroleno

Cumarinas diversas El dicumarol se forma por fermentación bacteriana de tréboles y pasto, se aisló de hojas descompuestas de Melilotus albus Leguminosae/Fabaceae. El dicumarol (bishidroxicumarina) antogoniza con la protombina y otras proteínas necesarias para la

38

coagulación de la sangre, presentando un problema para el ganado al consumirlo, también es utilizado comercialmente en venenos para ratas.

OO

OHCH2

OH

OO Dicumarol

Análogos sintéticos del dicumarol son utilizados vía oral como anticoagulantes para el tratamiento de la trombosis, como es el caso de las sales de warfarina y acenocumarol (nicumalona).

O

O

CH3

O

OH

NO2

O

O

CH3

O

OH

warfarina acenocumarol (nicumalona)

Una aproximación a la biogénesis del dicumarol[4] es hidroxilando la posición 4 de la cumarina, luego capta una molécula de formaldehído y condensarse con otra molécula de cumarina hidroxilada en 4 ypor último, enolizar el grupo ceto formando el dicumarol, como se muestra en la figura 14:

O O

-OHHCH

O O

OH

CH2

OH

-H2O

O O

OHCH2

OO

OH

O

OH

O O

O

OO

OH

O OO

OH

dicumarol

O

Figura 14: Biogénesis del dicumarol

Derivados de 3 fenil cumarinas del tipo cumestrol y el antibiótico novobiosina, son ejemplos de cumarinas diversas.

O

O

O

OH

HOO

OH

O

NH2O

O

O

N

O

O

O

CH3

CH3

OH H

OH

CH3CH3

CH3

CH3 Cumestrol Novobiosina

Las aflatoxinas son un grupo de sustancias relacionadas estructuralmente con las cumarinas; son micotoxinas producidas por Aspergillus flavum y A. versicolor y que han sido la causa de mortalidad animal por ingestión de alimentos enmohecidos, provocando lesiones hepáticas

39

OO

O

O O

OCH3 aflatoxina B

Técnicas de extracción de cumarinas La extracción de las cumarinas puede realizarse tanto sobre material seco como fresco, con solventes de polaridades diferentes, dependiendo de los tipos de estructura, algunas son ligeramente solubles en solventes apolares y a menudo pueden cristalizar directamente en ellos por enfriamiento o concentración del solvente. Métodos espectroscópicos para determinar cumarinas[17, 18] UV: Hay que diferenciar las cumarinas de las cromonas simples, estas presentan fuertes absorciones entre 240-250 nm (log ε: 3.8), mientras que las cumarinas simples absorben a 274 y 311 nm (log ε: 4.03 y 3.72) debido a los anillos bencénico y α pirona respectivamente y presentan variaciones según sus sustituyentes (ver fig 15). La mayoría de las cumarinas presentan sustituciones oxigenadas en C-7 (solo 35 de las 800 conocidas no la tienen), esta sustitución causa un efecto batocrómico en la banda de la banda de la α pirona, la posición de nuevas bandas depende de la posibilidad de conjugación del grupo hidroxilo con otros agentes cromóforos. Para el caso de las Furanocumarinas; las lineales tipo Psoroleno presentan bandas de absorción a 205-225 (log ε: 4.0), 240-255 (log ε: 4.06-4.45), 260-270 (log ε: 4.18-4.26) y 298-316nm (log ε: 3.85-4.13).

Figura 15: bandas de absorción de cumarinas simples[17]

IR: C=O 1715 - 1745 cm-1 Grupo α pirona (lactona conjugada) Psorolenos 1720 cm-1 Furano: C-O furánico : 1088-1109 y 1253-1274 cm-1

Dehidropirano 1735-1750 cm-1

40

RMN: Se muestran algunos ejemplos con las señales representativas en RMN de 1H y de 13C.

O O

7.5-8.36.1-6.4

J=9.5 Hz

O O160.4

116.4143.6

118

128124

131116

153

OO

OH

OOH

CH3

CH3

HH

6.88d

7.40dJ:8Hz 7.63d

6.24dJ:10Hz

5.32d J.9hZ4.55d J:9Hz

1.76s

4.64d J:15Hz

4.60d

3.99sO O

O

CH3

CH3

O

146.4

106.6

148.3

125.7 113.2

116.2

144.2114.2

160.2143.5

131.2

69.8119.7

139.2

17.8

25.5

Murrangatina imperatorina SM: Se muestran algunos ejemplos típicos de fragmentación como la cumarina, la 7-metoxicumarina, la capencina o metoxipreniletina y la colombianetina[17, 18]

O O O

-CO -CO C7H8 C7H7-H

m/z: 146 M-28 118 (100)90 89

O OH3CO OH3CO O+

O

-CO -CH3

m/e 176 m/e 148 m/e 133(100%) (82%) (83%). .

+ +

O

MeO

OOH

OHO O

OH

OH

MeOCH3

CH3

CH2 -C5H8

+

+ +. .

m/e 69 (90%) m/e 276 (1.4%) m/e 208 (100%)

41

O O

CH3CH3

HOH

O OO+ O

CH3

CH3

O O O

CH3

CH3

.+

.

+OO

+ O

CH3.

OH2-.CH3-

m/e: 246 m/e: 228m/e: 213m/e: 228

-CH 3COCH 3

O O OO O O O

O+

CH3

H-- -CO -CO

m/e: 187 m/e: 159 m/e: 132m/e: 188 (100%)

O

.

PRINCIPALES PLANTAS QUE CONTIENEN CUMARINAS[5, 11, 20, 21] Haba tonca, Dipteryx odorata Willd., Fam. Leguminosae/Fabaceae) Árbol originario de Sur América y cultivada actualmente en Venezuela, Guayana y Brasil, la droga esta constituida por las semillas desecadas que contienen entre 1 y 3% de cumarina, 25% de grasa y gran cantidad de almidón; utilizadas en perfumería y como aromatizante del tabaco y del whisky. Meliloto, Melilotus officinalis (L) Pallas, Fam. Fabaceae. El meliloto constituye una especie forrajera de hojas trifoliales y flores amarillas, ampliamente distribuida, su nombre deriva del griego méli miel, por ser una de las plantas silvestres mas visitada por colibríes y abejas, también se le conoce como trébol oloroso, debido a que luego de ser recolectada, por su desecación desarrolla un olor agradable. La droga contiene como principios mayoritarios flavonoides, saponinas triterpénicas pentacíclicas y ácidos fenólicos, todas las especien en especial las de flores amarillas contienen el o-hidroxi cinámico (melitosido), el cual se hidroliza dando lugar a la lactinización y a la cumarina. Por una inadecuada conservación de la planta, se origina a partir de esta, el dicumarol (ver figura 14), sustancia anticoagulante que han producido procesos hemorrágicos en el ganado. Frutos de apio, Apium graveolens Umbeliferae (Apiaceae). Lea droga esta constituida por frutos maduros y desecados los cuales contienen entre 2-3% de esencia constituida por terpenos con pequeñas cantidades de anhídrido y lactonas del ácido sedanólico y fenoles. Cumarinas, furanocumarinas, colina, tirosina, glutamina, asparagina, apiona, oleonesina. Los frutos son utilizados como digestivos, carminativos, diuréticos, tranquilizantes y anticonvulsivantes. Apio cimarrón, Ammi majus Umbeliferae (Apiaceae) Planta distribuida en Mesoamérica y el norte de Suramérica los granos del apio cimarrón, contienen furanocumarinas principalmente bergapteno, isopimpinelina y xantotoxina BIBLIOGRAFIA

42

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