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Estudio termodinámico del 5,11,17,23-‐tetrakissulfonatometileno-‐2,8,14,20-‐
tetra(2-‐(metiltio)etil)resorcinareno y su interacción con Albumina de Suero
Bovina.
ANDREA ORDOÑEZ PARRA
Trabajo de grado para optar por el título de Química
Director:
Edgar Francisco Vargas Escamilla Dr.Sc.
DEPARTAMENTO DE QUIMICA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
BOGOTA D.C.
2016
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN
2. ANTECEDENTES
2.1. Síntesis y caracterización de 5,11,17,23 tetrakissulfonatometileno-‐
2,8,14,20-‐tetra(2-‐(methiltio)ethil)resorcin[4]areno .
2.2. Interacción de resorcinarenos con albumina de suero bovino (BSA)
2.3. Estudio tensiométrico de un resorcinareno sulfonado con un
huésped no iónogenico.
3. MARCO TEÓRICO 3.1 Tensión superficial
3.1.1. Método del plato Wihelmy
3.1.2. Isotermas de Gibbs
3.2. Calorimetría ITC
3.2.1 Funcionamiento del calorímetro ITC de TA instruments
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS
4.1 . Preparación de soluciones
4.2 Tensión superficial
4.2.1. Metodología
4.2.2. Determinación de estabilidad del RSA y BSA
4.2.3 Determinación de la concentración de agregación o acomplejamiento
4.2.4. Calculo de la concentración de agregación o de acomplejamiento
4.3. Calorimetría isotérmica
4.3.1. Metodología
5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
5.1. Concentración de agregación para el c-‐tioetilresorcin[4]areno en
solución acuosa
5.2. Comportamiento de soluciones de c-‐tioetilresorcin[4]areno en el
tiempo.
5.3. Comportamiento de albumina en solución acuosa
5.4. Concentración de agregación para BSA en solución acuosa
3
5.5. Comportamiento de c-‐tioetilresorcin[4]areno en solución acuosa con
concentración constante de albumina
5.6. Concentración de agregación para el sistema Resorcinareno-‐Albumina
en solución acuosa
5.7 Isotermas de Gibbs
7. CONCLUSIONES
8. REFERENCIAS
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1. INTRODUCCION
La química supramolecular comprende el estudio de los enlaces no covalentes , el
reconocimiento molecular y la formación de agregados supramoleculares. El
estudio de la química supramolecular inició con el reconocimiento de fuerzas
intermoleculares por parte de J. Diderik en 1873 y con el modelo llave-‐cerradura
propuesto por Fischer en 1890, para tratar de explicar la interacción enzima-‐
sustrato. El modelo de llave-‐cerradura permitió que se reconociera el concepto de
anfitrión-‐huésped en la química supramolecular. En 1987 los químicos Donald
Cram, Jean Lehn y Charles Pedersen fueron galardonados con el premio Nobel de
Química por el desarrollo y uso de moléculas que mostraban interacciones
altamente selectivas y específicas, lo que causó un mayor reconocimiento de la
química supramolecular (Huang, 2015).
Después de algunos años de investigación, esta área de la química ha profundizado
en diversas aplicaciones, entre las que se incluyen: sensores moleculares,
nanoreactores, catalizadores químicos y entrega controlada de medicamentos
(Huang, 2015). Dentro de los temas de investigación en la química
supramolecularse encuentra el estudio de propiedades fisicoquímicas en solución
de las moléculas involucradas, el anfitrión y el huésped. Este último suele ser de
menor tamaño y presenta alta afinidad por la molécula anfitrión (Schneider,2015).
Un tipo especial de moléculas que permiten una organización estructural junto con
una habilidad de hospedar moléculas son los macrociclos, los cuales permiten una
estabilización adicional del sistema anfitrión-‐huésped. Por ejemplo, los
resorcinarenos, un grupo especial de macrociclos, permiten acomodar anfitriones
mediante interacciones catión-‐π, π-‐π, van der Waals, etc. Estas moléculas son
sintetizadas generalmente a partir del resorcinol y un aldehído mediante
condensación ácida (Figura 1) (Weinelt, 1991).
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Figura 1. Estructura química general de un Resorcinareno
Debido a su estructura molecular, las propiedades químicas y físicas de los
resorcin[4]arenos dependen de la naturaleza de sus sustituyentes, ya sea en el
anillo aromático o en el carbono puente que une dos de ellos (Figura 1). Los
resorcin[4]arenos pueden tener diferentes tipos de conformaciones (Figura 2), sin
embargo, en solución los resorcin[4]arenos con cadenas alifáticas en el carbono
puente adoptan generalmente la conformación tipo corona, lo que permite que en
solución y/o con huéspedes existan interacciones de tipo anfitrión-‐huésped más
estables respecto a las demás conformaciones (bote, silla, diamante y silla de
montar)(Sanabria, 2015).
Figura 2. Tipos de conformaciones para los resorcin[4]arenos (Sanabria, 2015).
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Los resorcinarenos con cadenas alifáticas o aromáticas en el carbono puente
tienen por lo general muy baja solubilidad en agua. Sin embargo, la
funcionalización en el carbono puente o en la posición orto de los anillos por un
grupo de carácter iónico, como sulfonatos, proporcionan un aumento importante
en la solubilidad (Figura 3) (Sanabria, 2015).
Figura 3.Estructura general de un c-‐alquilresorcin[4]areno sulfonado
Recientemente en el grupo de Termodinámica de Soluciones se ha sintetizado un
resorcinareno con una cadena de tio-‐eter como sustituyente R (Figura 3) y un
grupo sulfonato en posición orto respecto a los dos hidroxilos (Figura 4). Estas
modificaciones permitieron generar, junto con los grupos hidroxilo, interacciones
hidrofílicas ion-‐dipolo y puentes de hidrógeno, mientras que los anillos aromáticos
permiten la formación de una cavidad rica en electrones 𝜋 (Sanabria,2015).
Figura 4. Estructura del c-‐tioetilresorcin[4]areno
Na+
Na+
Na+
Na+OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
SO O
O-
SO
O O-
S OO
O-
S
O
OO-
SCH3
S
CH3
S
CH3
SCH3
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Algunos resorcin[4]arenos presentan ventajas, tales como: fácil modificación
química y bajo costo de producción (Bost,1997). Para las potenciales aplicaciones,
es importante estudiar las interacciones de los resorcinarenos con iones,
moléculas pequeñas, metabolitos y proteínas circulatorias, los cuales pueden ser
encontrados en altas concentraciones en fluidos fisiológicos como la sangre. Una
de estas moléculas es la albumina del suero, proteína que se encuentra a
concentraciones significativamente altas, de alrededor de 46 g/L, en la sangre
humana. Esta proteína es necesaria para la regulación de la presión osmótica en la
sangre y la distribución de los líquidos corporales entre compartimentos intra y
extravasculares (Peters, 1996).
En este trabajo se utilizará Albumina de suero bovina (BSA) la cual es una proteína
homologa de la albumina humana, para estudiar su interacción con un
resorcin[4]areno soluble en agua. La BSA cuenta con una carga eléctrica negativa,
un pH de 8 y un punto isoeléctrico en agua a 298.15K de 4.7 (Curry et al, 1999 ) y
se compone de 585 aminoácidos en una cadena polipeptídica única con un peso
molecular de 66 kDa. Así mismo, posee una estructura globular compuesta por tres
dominios homólogos (I-‐III) y seis dominios (A y B) envueltos por puentes disulfuro
y cuenta con 17 puentes disulfuro y un grupo SH libre (Curry et al, 1999). El
análisis de estructura cristalina de la BSA indica que la unión de ligandos se
presenta en dos sitios (Sitio I y sitio II) los cuales contienen características
selectivas independientes. Estos dominios se encuentran en las cavidades
hidrofóbicas en los subdominios IIA y IIIA tal como se evidencia en la Figura 5
Respecto al sitio I, la afinidad de unión se origina por interacciones hidrofóbicas,
mientras que en el sitio II consisten en enlaces de hidrógeno e interacciones
electrostáticas (Calderon,2003). Es importante resaltar que según Peters et al
(1996) existe un gran interés por esta proteína debido a su habilidad de sujetar
superficies hidrofílicas.
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Figura 5. Estructura de la BSA e ilustracion de sus sitios activos (Calderon,2003).
Debido a la importancia de los resorcin[4]arenos y las características de la BSA, en
este trabajo se estudió el efecto de la BSA sobre las propiedades de agregación del
5,11,17,23-‐tetrakissulfonatometileno-‐2,8,14,20-‐tetra(2
(metiltio)etil)resorcin[4]areno (c-‐tioetilresorcin[4]areno) mediante medidas de
tensión superficial y calorimetría isotérmica.
2. ANTECEDENTES
Síntesis y caracterización de 5,11,17,23-‐tetrakissulfonatometileno-‐2,8,14,20-‐
tetra(2-‐(methiltio)ethil)resorcin[4]areno .
Sanabria et al. realizaron la síntesis y caracterización de dos resorcin[4]arenos
sulfonados, siendo uno de ellos el compuesto de interés en este trabajo. Ambos
resorcinarenos sulfonados fueron sintetizados en dos etapas: ciclación y
funcionalización. En la ciclación se obtienen los resorcin[4]arenos base y en la
funcionalización se agregan grupos metilsulfonatos en la posición orto de los
anillos aromáticos. Para el caso del c-‐tioetilresorcin[4]areno, se realizó primero la
condensación de resorcinol con 3-‐metiltiopropanaldehido en una mezcla etanol-‐
agua, luego, se realizó la reacción directa del resorcin[4]areno con formaldehido y
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sulfito de sodio (FIGURA 7,b). La caracterización de los compuestos se realizó
mediante FT-‐IR, 1H-‐NMR, 13C-‐NMR y espectrometría de masas, así como también
se realizaron análisis termogravimétricos para determinar el número de moléculas
de hidratación. Los estudios de difracción de rayos-‐X mostraron que el c-‐
tioetilresorcin[4]areno prefiere una conformación en forma de corona y que su
configuración es rccc en estado sólido (Sanabria,2015).
Figura 6. Síntesis de 5,11,17,23-‐tetrakissulfonatometileno-‐2,8,14,20-‐tetra(2-‐
(methiltio)ethil)resorcinarenoa partir del resorcinol y el aldehido sulfonado (Sanabria,2015).
Interacción de resorcinarenos con albumina de suero bovino (BSA)
En el estudio de potenciales transportadores de fármacos en sangre es importante
observar la interacción de las moléculas transportadoras con moléculas presentes
en la sangre. Teniendo en cuenta que la BSA, es homóloga con la albumina de
suero humana se ha tomado esta como proteína modelo para estudiar el
comportamiento del c-‐tioetilresorcin[4]areno con esta proteína y con el objetivo
de poder usar este macrociclo como potencial transportador. Se ha estudiado la
interacción de algunos calixarenos con BSA, siendo los calixarenos una de las
potenciales moléculas para ser utilizadas como transportadores de fármacos en
sangre por su propiedad de comportarse como un anfitrión frente a una molécula
huésped. Gualbert et al., por ejemplo, mostraron que para tres p-‐
dodecanoycalix[4]arenos diferentes no se observó concentraciones de agregación
en el sistema resorcin[4]areno, incluso cuando se usaban altas concentraciones de
proteína. La ausencia de concentración de agregación de este sistema es una señal
positiva de su potencial uso como transportador de fármacos (Gualbert, 2003). Así
mismo, Ehrler et al., también estudiaron el tetrakis(N-‐
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metilprolil)tetraundecilcalix[4]resorcinareno (L-‐RA-‐Pro) y su interacción con
albumina de suero bovina, observando que tampoco se presentaba una
concentración de agregación (Ehrler,2007).
Estudio de tensión superficial de resorcinarenos sulfonados con huéspedes
no-‐electrolitos.
Morozova et al. reportaron estudios de tensión superficial de dos
tetrametilsulfonatoresorcin[4]arenos diferentes con dos moléculas derivadas de la
pirimidina, las cuales actuaron como huéspedes. La asociación de los
resorcinarenos con las moléculas huésped causó un cambio respecto a las
propiedades termodinámicas del huésped del anfitrión de manera separada. Todos
los resorcinarenos presentaron concentraciones de agregación con o sin la
presencia de la molécula huésped. Esta interacción causó un aumento de la
actividad superficial por causar una mayor disminución de tensión superficial.
(Morozova, 2006).
3. MARCO TEORICO
3.1 Tensión superficial
3.1.1. Método del plato Wihelmy
El comportamiento en solución de un compuesto puede ser estudiado mediante
diferentes técnicas experimentales, dentro de las cuales se pueden destacar la
determinación de tensión superficial, la cual permite también determinar la
concentración de agregación.
Para la determinación de tensión superficial, se utilizó un tensiómetro DCAT
Dataphysics. El equipo permite la medición de la tensión superficial de una
solución por medio del ángulo de contacto entre la solución y el dispositivo. Para el
caso del plato de Wihelmy, cuando se suspende verticalmente y entra en contacto
con la superficie de la solución (Figura 7), una fuerza F se relaciona
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matemáticamente con la tensión superficial γ y con un ángulo de contacto 𝜃 tal
como se evidencia en la siguiente ecuación (la cual resulta de un balance de fuerzas
en la dirección Z):
Figura 7.Diagrama del método de Wihelmy plate (Kruss, s.f.)
γ =𝐹
𝐿 ∗ 𝑐𝑜𝑠𝜃 (1)
Donde L es la longitud del plato y F la fuerza de tensión.
La solución a la cual se le requiere medir la tensión superficial es agregada en una
celda y en el momento en el que el tensiómetro detecta la superficie del líquido,
establece esa altura como su punto de referencia para la medición. Se realiza la
medición de la tensión superficial hasta que la desviación estándar sea menor que
el criterio definido como desviación máxima.
3.1.2. Isotermas de Gibbs
La relación entre la tensión superficial y el ln(c), siendo c la concentración molar
de una especie, permite calcular las isotermas de adsorción de Gibbs de acuerdo
con la siguiente ecuación:
𝑑γ = −𝑅𝑇 Γdln𝑐 (2)
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Donde Γ se conoce como superfice de exceso de la molécula y se relaciona con la
adsorción de moléculas en la interface. R y T son la constante universal de los
gases y la temperatura absoluta respectivamente.
La grafica de Ln(c) vs γ permite calcular diferentes parámetros. La concentración
de agregación, que en algunos casos se conoce como concentración micelar crítica
CMC, la cual se calcula gráficamente como la intersección de la pendiente trazada
en los puntos más diluidos con la pendiente trazada en los puntos más
concentrados. El valor máximo de adsorción (Γ∞) que se observa como el punto de
mayor pendiente en la gráfica Ln(c) vs γ (ver Ecuación 3 )(Saleh,2012):
−1𝑅𝑇 ∗
𝑑𝛾dln𝑐 !"#
= Γ! (3)
La actividad superficial representa la capacidad de una sustancia para influenciar
la tensión superficial de un líquido. Este parámetro se calcula a partir de la
Ecuación 4 (Morozova et al, 2008).
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 =γ!!" − γ!CMC (4)
Donde CMC representa la concentración de agregación (o concentración micelar
critica de acuerdo a las propiedades en solución), γ0 la tensión superficial del
solvente puro y γ kkm la tensión superficial donde se inicia un comportamiento
lineal en la gráfica γ vs lnc.
3.2. Calorimetría ITC
3.2.1 Funcionamiento del calorímetro ITC de TA instruments
El nanocalorímetro ITC (Isothermal titration calorimetry) de TA instruments
cuenta con una jeringa de titulación, una celda de referencia que contiene el
solvente y una celda de muestra que contiene la solución (Ver Figura 9). El equipo
mide la energía absorbida o liberada por el proceso que se está estudiando. Este
equipo cuenta con un controlador de temperatura, que permitirá que esta vuelva a
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su valor inicial (la temperatura a la cual se desarrolla el experimento) por medio
de un compensador de potencia. La energía medida por el equipo permite obtener
el cambio de entalpía la cual se obtiene graficando el área bajo la curva de cada
pico respecto a la concentración en la celda en cada inyección (Freyer, 2008).
Figura 8. Esquema de un nanocalorímetro ITC(Freyer,2008)
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1. Preparación de soluciones
Para las preparaciones de soluciones se utilizó una balanza Analytical Plus de
ohaus. Se preparó y sónico (durante 20 min para disolver el sólido) una solución
acuosa de c-‐tioetilresorcin[4]areno 0.095M, el cual fue sintetizado en el
laboratorio de Termodinámica de Soluciones. Esta solución fue cubierta en papel
aluminio para su almacenamiento en un desecador con silica gel activada. Por otra
parte, se preparó una solución de 46 g/L de BSA de Merck, la cual fue almacenada
en una nevera a 277.15K para evitar su desnaturalización.
Es importante resaltar que para los experimentos de calorimetría isotérmica, las
soluciones en cada medida (preparadas tal como se mencionó anteriormente)
fueron sonicadas durante 20 minutos para eliminar burbujas presentes en la
solución.
4.2 Tensión superficial
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Las mediciones de tensión superficial se realizaron con el tensiómetro DCAT
Dataphysics a 298.15K, la temperatura fue controlada mediante recirculación de
agua desde un baño termostatado controlado por una unidad LC6 de Julabo con
una incertidumbre de ±0.1K. El equipo cuenta además con un dispositivo de
adición de muestra para realizar mediciones en una titulación. El equipo fue
chequeado con agua tipo I y usando el método del plato de Wilhemy. Las
mediciones de tensión superficial del agua fueron 71.14±0.05 mN/m, valor que
corresponde muy bien con la literatura, 72.00±0.05 mN/m (Vargaftik, 1983) .
4.2.1. Metodología
Antes de realizar una medición en el tensiómetro, se realizó un procedimiento de
limpieza específico. La celda de muestra se limpió con agua y luego con acetona. El
plato de Wihelmy se lavó con agua y luego con acetona y se secó a la llama.
Posteriormente se armó el dispositivo para iniciar las medidas.
4.2.2. Determinación de estabilidad del RSA y BSA
Para el seguimiento en el tiempo de una solución por tensión superficial, se colocó
la solución deseada en la celda de muestra y se dejó en agitación constante durante
30 min para estabilizar la temperatura 298.15K. Pasado este tiempo, se realizaron
medidas de tensión superficial durante 7 horas. El número de medidas realizadas
en este tiempo fue configurado en el Software DCAT Dataphysics.
4.2.3 Determinación de la concentración de agregación o acomplejamiento
Se agregó un volumen conocido a la celda de muestra (agua o solución de BSA o
solución de RSA) y se dejó en agitación constante durante mínimo 30 min. La
jeringa de titulación fue purgada con 10 mL de agua y luego con 5 mL de la
solución que se con al cual se realiza la titulación. Mediante el Software DCAT
Dataphysics, se configuró el numero de medidas y el rango de concentración
utilizada para registrar las medidas de tensión superficial. El experimento
entonces consistió en agregar un volumen de titulante a la celda de muestra y
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posteriormente medir la tensión superficial, de manera que la concentración del
titulante aumentará en la celda de muestra en cada medición.
4.2.4. Cálculo de la concentración de agregación o de acomplejamiento
La gráfica de tensión superficial en función de la concentración de la solución de
interés lo que permitió calcular la concentración de agregación. Esta concentración
se calcula mediante la intersección entre la línea recta de la región linealmente
dependiente y la línea recta de la región linealmente independiente o de Plateau
(donde la tensión superficial se mantiene constante) como se ilustra en la Figura
8.Para el caso del estudio de acomplejamiento se midió la tensión superficial en
función de la relación de concentraciones [RSA]/ [BSA].
Figura 9. Determinación gráfica de la concentración de agregación o acomplejamiento mediante
tensión superficial (Krüss :Determination of CMC, s.f.).
4.3. Calorimetría isotérmica
Las determinaciones calorimétricas se realizaron en el nanocalorímetro ITC de TA
Instruments. Se realizó un blanco con agua para verificar la correcta limpieza, el
correcto funcionamiento del equipo y para tener en cuenta el cambio de entalpía
asociada a la energía liberada por el efecto de la dilución.
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Previo a las mediciones se agregó en la celda de referencia agua y se dejó
estabilizar durante 3 días. El solvente de la celda de referencia no fue cambiada
durante las determinaciones.
4.3.1. Metodología
Antes de iniciar con el experimento, se limpió la jeringa de la celda de muestra y la
jeringa de titulante, cada una se purgó con agua mínimo 40 veces. Además, la celda
de muestra fue limpiada con mínimo 1.5 L de agua.
Para los experimentos de cambio de entalpía de la solución en función del tiempo,
se agregó en la celda de muestra 300 μL de agua y 50 μL de una solución deseada
en la jeringa de titulación. Se dejó el sistema estabilizar 30 min y se realizó una
única inyección. Luego, se midieron los cambios energéticos de la muestra en
función del tiempo .
Para la determinación de una concentración de agregación o acomplejamiento, se
agregó en la celda de muestra 300 μL de agua y 50 μL de una solución deseada en
la jeringa de titulación. Se dejó el sistema estabilizar el sistema mínimo 3 horas y
posteriormente se inició la titulación . Se midió los cambios energéticos durante el
periodo de tiempo en el que se realiza la titulación.
Para analizar los datos obtenidos mediante calorimetría isotérmica detallada se
graficó el cambio entálpico de cada inyección vs la concentración en la celda de
muestra. Esto se realizó utilizando el Software Nano Analyzer de TA instruments el
cual permite integrar el área bajo la curva de cada pico para obtener el cambio de
entalpía de dicha inyección.
5. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS
5.1. Concentración de agregación para el c-‐tioetilresorcin[4]areno en
solución acuosa
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Los resultados de tensión superficial en función de la concentración molar se
muestran en la Figura 10. Para esto, se tomaron 19 mL de agua en la celda de
medida y una vez alcanzado el equilibrio se procedió a añadir cantidades
conocidas de una solución 0.0951M de c-‐tioetilresorcin[4]areno. Antes de cada
adición, se esperó que la solución alcanzara el equilibrio y se determinó la tensión
superficial. El rango de concentración medido fue entre 0.00 a 0.035M.
Figura 10. Titulación con c-‐tioetilresorcin[4]areno en agua . Seguimiento mediante tensión superficial
(SFT).
El comportamiento observado en la Figura 10 es característico de la presencia de
concentraciones de agregación . Esta Figura muestra que la tensión superficial
disminuye hasta alcanzar una tendencia constante. La concentración de agregación
calculada como se describió en la sección 4.2.3. fue de 0.0031 molL-‐1 de c-‐
tioetilresorcin[4]areno. Este tipo de comportamiento indica que para
concentraciones iguales o mayores a la Cagg, el número de monómeros de
resorcin[4]areno se mantiene constante y cualquier aumento de concentración de
la solución causa un aumento de agregados o un cambio en su geometría . Esto
puede representarse mediante la siguiente ecuación:
𝑛 𝑅𝑒𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖𝑛𝑎𝑟𝑒𝑛𝑜 ↔
𝑎𝑔𝑟𝑒𝑔𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑅𝑒𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖𝑛𝑎𝑟𝑒𝑛𝑜 !!! + 𝑅𝑒𝑠𝑜𝑟𝑐𝑖𝑛𝑎𝑟𝑒𝑛𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒! (8)
50
55
60
65
70
75
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
γ (mN/m
)
[Na4RSA]
réplica
18
Donde n es el número total de monómeros de resorcinareno antes de la
concentración de agregación y 𝑦 es el número de monómeros libres después de la
concentración de agregación.
De acuerdo con la estructura del c-‐tioetilresorcin[4]areno, los grupos sulfonatos
hacen que la parte superior del resorcin[4]areno sea una región hidrofílica,
mientras que en la parte inferior del resorcin[4]areno, la terminación tio-‐etil, es de
carácter hidrofóbico. De esta manera, se podría sugerir que los monómeros de
resorcin[4]areno se ubican en la interfase agua/aire orientando las terminaciones
tio hacia el aire y los sulfonatos hacia el agua.
Para el estudio de calorimetría isotérmica, se preparó una solución de c-‐
tioetilresorcin[4]areno 0.0951M para titular 300 μL de agua a 298.15K . El sistema
se dejó estabilizando durante 5 horas. Los resultados de la calorimetría isotérmica
se muestran en las Figuras 11 y 12. En la Figura 11 muestra la relación entre la
entalpía de la titulación respecto al tiempo y en la Figura 12 muestra el cambio
entálpico de cada inyección respecto a la concentración en la celda de medida.
En la Figura 12 se observa un punto de inflexión el cual corresponde a 0.0041M c-‐
tioetilresorcin[4]areno, valor muy cercano a la concentración de agregación
determinada por tensión superficial(Figura 10).
Figura 11.Resultados de la calorimetría ITC de una agregación de c-‐tioetilresorcin[4]areno en solución
acuosa.
19
Figura 12. Cambio de entalpía de cada inyección obtenido de la titulación de c-‐tioetilresorcin[4]areno
en solución acuosa (Figura 18).
Las Figuras 11 y 12 muestran que el proceso de agregación del resorcin[4]areno
en agua es un proceso endotérmico, lo que muestra que el proceso de
desmicelización del resorcinareno en la celda es un proceso que requiere energía
pues se pasa de un estado organizado(agregados) a uno desorganizado
(monómeros). A medida que aumenta la concentración en la celda, la energía de
desmicelización aumenta progresivamente hasta alcanzar la concentración de
agregación. Después de esta concentración, la entalpía disminuye, lo que muestra
la formación de nuevos agregados o la interacción entre estos, por lo que no se
obsrva una estabilización de la energía.
Con el objetivo de ampliar el rango de concentración del resorcin[4]areno
(respecto a la Figura 11) y registrar el cambio de entalpía, así como para evaluar si
el proceso de dilución es endotérmico o exotérmico, se realizó un experimento
adicional. Se preparó una solución de c-‐tioetilresorcin[4]areno de 0.0951M y se
agregó en la celda de muestra para agregar paulatinamente agua. Se registró el
cambio de entalpia a 298.15K para cada inyección de agua. Previo a la titulación, el
sistema fue estabilizado durante 5 horas. Los resultados se muestran en las
Figuras 13 y 14 . Se observa que el proceso de dilución es endotérmico y que a
20
medida que se disminuye la concentración de c-‐tioetilresorcin[4]areno el sistema
tiende a alcanzar el equilibrio.
Figura 13.Resultados de la calorimetría ITC de una dilución de c-‐tioetilresorcin[4]areno en solución
acuosa.
Figura 14.Cambio de entalpía de cada inyección obtenido de la dilución de c-‐tioetilresorcin[4]areno en
solución acuosa (Figura 13).
Según la Figura 14 el proceso de dilución del resorcinareno es un proceso
endotérmico , debido a que la solución de resorcin[4]areno contiene agregados
desde el inicio de la dilución y el sistema no tiende a la desmicelización. Así mismo,
la disminución de la energía en cada inyección muestra que el proceso tiende al
equilibrio.
5.2. Comportamiento de soluciones de c-‐tioetilresorcin[4]areno en función
del tiempo.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0.08 0.082 0.084 0.086 0.088 0.09 0.092 0.094 0.096
Cambio de entalpía (μJ)
[Na4RSA]
dilución
21
De acuerdo con la concentración de agregación calculada en el procedimiento
5.1.1., se tomaron dos concentraciones de c-‐tioetilresorcin[4]areno: una en la
región pre-‐agregación (0.002M) y otra en la región pos-‐agregación (0.007M). A las
soluciones se les determinó la tensión superficial en el tiempo (durante
aproximadamente 7 horas) a 298.15 K. Se realizó una réplica para cada una de las
concentraciones. Los resultados se muestran en la Figura 15. Este procedimiento
se realizó para observar la estabilidad de las soluciones.
Figura 15.Tensión superficial en el tiempo para dos soluciones de c-‐tioetilresorcin[4]areno, 0.002 M
(concentración pre-‐agregación) y 0.007M (concentración pos-‐agregación).
Según la Figura 15, los tiempos de estabilización para ambas concentraciones son
similares (250s) y por lo tanto se podría afirmar que el tiempo de migración de las
moléculas de c-‐tioetilresorcin[4]areno es similar cuando hay presencia o no de
agregados en el seno de la solución. Por otra parte, este resultado respalda que en
cada medición de tensión superficial para los experimentos de la sección 5.1 ya se
ha alcanzado el equilibrio.
47
52
57
62
67
72
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
γ (mN/m
)
tiempo (s)
0.002 M Na4RSA
0.007 M Na4RSA
0.002 M Na4RSA(réplica)
0.007 M Na4RSA (réplica)
22
5.3. Desnaturalización de BSA en solución acuosa
Con el objetivo de evidenciar si a las condiciones experimentales se presenta la
desnaturalización de BSA, se realizaron medidas de tensión superficial en función
del tiempo (durante 7 horas) a 298.15K . Se realizó una réplica de esta medición.
Los resultados se muestran en la Figura 16. Los resultados muestran que la
solución alcanza el equilibrio a 280s y no se observan cambios que indiquen que
hay desnaturalización de la proteína en el tiempo medido. Además, el
comportamiento observado en este experimento es similar al reportado en la
literatura (Figura 17), y demuestra que la BSA no se desdobla fácilmente en el
tiempo (Berthold, 2007).
Figura 16.Tensión superficial en el tiempo para una solución de BSA de 46g/L.
50
51
52
53
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55
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57
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
γ(mN/m
)
tiempo(s)
BSA 46 g/L (réplica)
BSA 46 g/L
23
Figura 17. Tensión superficial de BSA y derivados de BSA. Solución de BSA 3E-‐07 (☐) (Berthold, 2007).
Adicionalmente, con calorimetría isotérmica, se preparó una solución de albumina
de suero bovina con concentración de 46.0 g/L (0.0007M) y se realizó una
inyección de 40 𝜇𝐿 a 300 𝜇𝐿 de agua. Previamente, el sistema fue estabilizado
durante media hora y luego se midió el cambio de entalpía a 298.15K durante 10
horas. Los resultados se muestran en la Figura 18.
Figura 18. Seguimiento en el tiempo de la proteína BSA.
La Figura 18 muestra para la BSA un aumento paulatino de liberación de energía.
Hacia los 24000 s (7 h, incluyendo el tiempo previo de estabilización) se observa
un pico exotérmico el cual podría indicar un cambio conformacional de la proteína
o un tipo de equilibrio de unidades protéicas. Stuting and Krull (1990) mostraron
24
mediante medidas de cromatografía, que la BSA es una proteína que posee
mayoritariamente monómeros y dímeros en solución, pero cuando se encuentra en
forma de agregados puede presentarse en forma de trímeros o especies de mayor
cantidad de subunidades. De esta forma el pico evidenciado en la Figura 18 podría
corresponder a un equilibrio entre oligómeros de BSA. Así mismo, la pequeña
magnitud del cambio de entalpía en la Figura 18 explica por qué no se observa
este cambio mediante tensión superficial.
5.4. Concentración de agregación para BSA en solución acuosa
Una vez confirmado que la proteína es estable en el tiempo de medida
considerado, se realizaron diluciones con albumina de suero bovina en agua para
determinar la concentración de agregación de esta proteína a 298.15K. Se utilizó
la BSA a una concentración de 46 g/L (0.0007 M) y se realizó una réplica de la
dilución. La dilución se realizó en un rango (0-‐22g/L de BSA). Los resultados se
muestran en la Figura 19.
La figura 19 muestra dos puntos de inflexión en 0.0048 g/L y en 0.041 g/L los
cuales fueron determinados mediante el procedimiento descrito en la sección
4.2.4.
25
Figura 19.Tensión superficial vs concentración de BSA en solución acuosa.
El punto de inflexión entre 0.041 g/L (Figura 19) es similar a la concentración de
agregación reportada en la literatura para BSA la cual se encuentra en un rango de
0.042-‐0.045g/L (Bhavani, 2015). Mientras que el punto de inflexión en el rango de
0.0046-‐0.005 g/L es similar a una concentración crítica reportada por He. et al
(0.2 ppm ó 0.002 g/L) quienes encontraron que a esta concentración la BSA
presenta un cambio conformacional. Ellos mostraron que a concentraciones
inferiores a la concentración crítica, las moléculas de la proteína no se encuentran
en exceso en la interface agua/aire para construir una monocapa. Así mismo,
argumentan que el cambio conformacional se debe a los enlaces extra de
hidrogeno formados entre los grupos polares de la BSA y las moléculas de agua (He
et al., 2014).
Teniendo en cuenta que la función de la albumina en sangre es similar a la de BSA,
se pueden realizar algunas condiciones. Cabe resaltar que aunque la
experimentación no fue realizada en sangre, la sangre es aproximadamente 80%
45
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0 5 10 15 20 25
γ (mN/m
)
[BSA](g/L)
réplica
26
agua y estos resultados permiten realizar una aproximación al comportamiento de
esta proteína. La concentración promedio de albumina humana en la sangre es de
46 g/L, al igual que la BSA en la sangre del ganado bovino (Gualbert et al., 2003)
,de manera que estos resultados podrían respaldar el hecho de que la albumina
humana se encuentra en forma de agregados en la sangre. La presencia de
agregados de albumina en la sangre respaldaría su funcionalidad que es la de
transportar los ácidos grados (insolubles en medio acuoso) por el torrente
sanguíneo. De manera que los agregados de proteína presentes en este medio,
cuentan con la parte hidrofóbica orientada al interior para encapsular los ácidos
grasos y su parte hidrofílica hacia el exterior (Curry et al, 1999) .
En los experimentos de calorimetría isotérmica, se colocó una solución de BSA de
46.0 g/L, se agregó a la jeringa de inyección y agua en la celda de muestra. Se dejó
estabilizar el sistema por media hora y se inició el proceso de agregación a
298.15K. Los resultados se muestran en la Figura 20.
Figura 20. Titulación con BSA en agua.
Los resultados observados en la Figura 20 no se observó un cambio debido a la alta
concentración de la BSA inyectada y a los pequeños volúmenes de inyección
(0.06μL) .
5.5. Estabilización en el tiempo del sistema c-‐tioetilresorcin[4]areno-‐BSA en
solución acuosa
Se prepararon soluciones de albumina de suero bovina de 46.0 g/L (0.0007M) y se
varió en cada una de ellas las concentraciones de c-‐tioetilresorcin[4]areno . Se
27
utilizaron dos concentraciones en la región pre-‐agregación (0.001M y 0.002M) y
dos en la pos-‐agregación de c-‐tioetilresorcin[4]areno(0.007M y 0.018M ) . Se
registró la tensión superficial del sistema albumina-‐resorcin[4]areno en el tiempo
(por 7 horas ) a 298.15K . Se realizó para cada medida una réplica para cada una y
los resultados se muestran en la Figura 21.
Figura 21.Estabilización en el tiempo del sistema c-‐tioetilresorcin[4]areno-‐BSA en solución acuosa
para dos concentraciones en la región de pre agregación (0.001 y 0.002 M) ,dos en la pos agregación
(0.007, 0.018),dos soluciones de solo resorcin[4]areno (0.002M y 0.007M) y una solución de BSA de
46g/L.
Según la Figura 21 los tiempos de estabilización para las soluciones de BSA+RSA
son similares (alrededor de 280-‐300 s). El tiempo de estabilización indica el
tiempo necesario para que los monómeros libres migren, se acomoden en la
interface agua/aire y disminuyan la tensión superficial hasta un valor constante.
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0 5000 10000 15000 20000 25000 30000
γ(mN/m
)
tiempo (s)
0.018M Na4RSA+BSA
0.007M Na4RSA+BSA
0.001M Na4RSA+BSA
0.002M Na4RSA+BSA
46 g/L BSA
0.002M Na4RSA
0.007M Na4RSA
28
Dado que se encontraron tiempos de estabilización similares para todas las
concentraciones, la migración de los monómeros ya sea de BSA o de c-‐
tioetilresorcin[4]areno a la interface agua/aire es similar para una solución con o
sin agregados. Por otra parte, las soluciones de solo Na4RSA y solo BSA presentan
el mismo tiempo de estabilización respecto a las soluciones de BSA+RSA lo que
permite concluir que la presencia de la proteína no altera el tiempo de
estabilización de soluciones del resorcin[4]areno. Así como la presencia de c-‐
tioetilresorcin[4]areno no modifica el tiempo de estabilización para una solución
de BSA.
5.6. Concentración de acomplejamiento para el sistema Resorcin[4]areno-‐
Albumina en solución acuosa
Una solución de albumina de suero bovina 46.0 g/L (0.0007M) se tituló con una
solución de c-‐tioetilresorcin[4]areno 0.095M, con el objetivo de mostrar una
concentración de acomplejamiento del sistema Na4RSA+BSA a 298.15K mediante
mediciones de tensión superficial. La concentración de acomplejamiento fue
calculada mediante el procedimiento descrito en la sección 4.2.4. En la Figura 22 se
observó que para el sistema Na4RSA+BSA la concentración de acomplejamiento es
de 6 [Na4RSA]/[BSA] (0.16-‐0.18 [BSA]/[Na4RSA] ), lo que permite afirmar que hay
6 veces c-‐tioetilresorcin[4]areno unido por unidad de BSA en la concentración de
acomplejamiento.
29
Figura 22.Tensión superficial vs concentración del c-‐tioetilresorcin[4]areno para una concentración
de BSA constante de 46 g/L (0.0007 M )en solución.
Para la experimentación por calorimetría isotérmica, se preparó una solución de
0.037 M de c-‐tioetilresorcin[4]areno y una de albumina de suero bovina de
46.0g/L (0.0007M) . Se agregaron 300 𝜇𝐿 de la solución de albumina en la celda y
se tituló con la solución de resorcin[4]areno. Se permitió que el sistema se
estabilizara durante 3 horas previo al seguimiento por calorimetría. Los resultados
se muestran en las Figura 23 y 24.
En la Figura 24 se observa un pico de inflexión marcado en la sexta inyección y con
una concentración en la muestra de 6 [Na4RSA]/ [BSA], el cual representa la
concentración de acomplejamiento del sistema BSA+Na4RSA. Este resultado
concuerda también con la concentración de acomplejamiento encontrada
mediante tensión superficial.
48
48.5
49
49.5
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50.5
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51.5
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52.5
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0 1 2 3 4 5 6 7 8
γ (m
N/m
)
[BSA]/[Na4RSA]
réplica
30
Figura 23. Resultados de calorimetría ITC de la agregación de c-‐tioetilresorcin[4]areno en solución
acuosa con concentración de BSA constante (46 g/L o 0.0007 M)
Figura 24. Área de cada pico de inyección para la titulación de una dilución de c-‐
tioetilresorcin[4]areno en solución acuosa con concentración de BSA constante (Figura 23)
La Figura 24 muestra antes de la concentración de acomplejamiento, una
liberación de energía. Esto se debe a un proceso de acomplejamiento. Para
concentraciones superiores a la concentración de agregación, se observa un
aumento de energía en el sistema, lo cual puede presentarse por el requerimiento
energético para la formación de agregados del complejo o interacciones.
Adicionalmente, el proceso de rompimiento de agregados o el proceso de dilución
podrían causar el aumento de energía en el sistema.
5.7 Isotermas de Gibbs
Se graficaron las isotermas de tensión superficial γ vs lnc (c: concentración molar)
(Figura 23) para c-‐tioetilresorcin[4]areno y BSA. Usando las ecuaciones 2 ,3 ,4 y 5,
-‐80
-‐70
-‐60
-‐50
-‐40
-‐30
-‐20
-‐10
0
10
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Cambio de entalpía (μJ)
[BSA]/[Na4RSA]
31
se calculó el valor máximo de adsorción de superficie (Γ∞), la concentración de
agregación CMC y la actividad de superficie((γ kkm-‐ γ o)/CMC. Los resultados se
muestran en la Tabla 1.
Figura 25.Tensión superficial vs lnC,. RA simboliza la titulación de Na4RSA (Figura 8) y BSA representa
la titulación de BSA (Figura 11) .
Tabla 1. Parámetros de agregación para los sistemas mostrados en la Figura 21.
Compuesto Na4RSA BSA
Γ∞ (mol/m2) 7.29�10-‐5 2.15�10-‐5
CMC[mol�L-‐1] 6.17�10-‐4 1.12�10-‐6
γ ∞ [mN/m] 71.59 70.64
(γ∞-‐ γ o)/cmc
(mN/(m�mol�L-‐1)) 500.49 8.9�105
En la Figura 23 muestra que el c-‐tioetilresorcin[4]areno muestra un punto de
inflexión que representa la concentración de agregación del sistema (ln c -‐7.32,
0.0006 M). Esta concentración es menor a la registrada con la Figura 10
45
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65
70
75
-‐25 -‐20 -‐15 -‐10 -‐5 0
γ (mN/m
)
Ln C (M)
Na4RSA
BSA
32
probablemente debido a que este tipo de representación gráfica permite obtener
un valor más exacto. Es importante resaltar que el valor de concentración de
agregación registrado para este resorcinareno se encuentra en el mismo rango de
magnitud (0.0001 a 0.01M) de las concentraciones de agregación reportadas para
resorcin[4]arenos funcionalizados con grupos sulfonato en posiciones orto
respecto a los hidroxi y con una cadena alifática o aromática en el carbono puente
(Morozova et al., 2008). Por otro lado, se encontró que la actividad de superficie es
de 500.49 mN/(m*M), lo cual concuerda con otros resorcin[4]areno sulfonados
que presentan valores de actividad de superficie en la magnitud de 102-‐104
(Morozova et al., 2008).
Para la BSA, se observan dos puntos de inflexión, el primero, alrededor de ln c -‐
17.5 (2.5� 10-‐8 M, 0.0016 g/L) y el segundo en ln c -‐14.31 (6.09� 10-‐7 M, 0.0404
g/L). El primer punto corresponde a un cambio conformacional y el segundo punto
corresponde a una concentración de agregación los cuales concuerdan con los
resultados encontrados en las secciones 5.1 y 5.4. Respecto al cálculo de variables
termodinámicas, la actividad superficial calculada para la BSA (8.96� 105
mN/(m*M)) es significativamente mayor respecto a la de resorcin[4]areno,
demostrando así que la BSA disminuye en mayor magnitud la tensión superficial
del agua respecto al Na4RSA lo cual le otorga a esta proteina mayores propiedades
de surfactante.
6. CONCLUSIONES
Se logró calcular mediante tensión superficial, parámetros termodinámicos
relevantes como la actividad superficial, el área de superficie por molécula y el
valor máximo de adsorción. Dichos valores, permitieron evidenciar que la BSA
actúa de manera más eficiente como surfactante respecto al resorcin[4]areno. Así
mismo, se calcularon las concentraciones de agregación para el resorcin[4]areno
(0.0031M-‐0.0041), la BSA(0.041 g/L) y la concentración de acomplejamiento para
el sistema Na4RSA+BSA (6 [Na4RSA]/ [BSA]). También se observó una
concentración de cambio conformacional para la BSA (0.0048 g/L) la cual
concuerda con un cambio de conformacional reportado por He et al. (2014) .
33
Las mediciones de nanocalorimetría ITC no solo permitieron confirmar las
concentraciones de agregación o de acomplejamiento registradas mediante
tensión superficial, sino también mostraron el comportamiento energético de los
procesos de agregación, desmicelización y dilución. Se encontró que para el c-‐
tioetilresorcin[4]areno el proceso de desmicelización absorbe energía hasta
alcanzar la concentración de agregación pero para la BSA no se obtuvieron
resultados concluyentes. Adicionalmente, se podría sugerir que en caso de utilizar
el c-‐tioetilresorcin[4]areno como transportador de fármacos en la sangre, podría
utilizarse con una concentración igual o mayor a 6 [Na4RSA]/ [BSA] para lograr el
acomplejamiento de estas dos moléculas . De esta forma, se propone como trabajo
futuro estudiar la toxicología del c-‐tioetilresorcin[4]areno y realizar las mediciones
descritas en este trabajo de investigación utilizando sangre y no agua como
solvente.
Finalmente, este trabajo de investigación mostró la relevancia de la termodinámica
de formación de agregados o de acomplejamiento para un mejor entendimiento
del comportamiento de una especie en solución.
7. REFERENCIAS
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DOI_10.1039/C5sm00687b
37
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer y dedicar en primer lugar a Dios, a mi papá, mamá y hermana por
su amor y apoyo constante en el desarrollo de mi Tesis. Mi Familia fue mi motor
diario para superarme y convertirme en profesional, pues sin ellos no tendría las
bases de responsabilidad y perseverancia que me permitieron alcanzar este logro
personal. Así mismo, quiero agradecer a mis amigas incondicionales Aura, Laura,
Lina y Viviana que me apoyaron durante toda mi formación académica y se
convirtieron en mi segunda familia.
Al mismo tiempo, expreso mis profundos agradecimientos al grupo de
Termodinámica de Soluciones de la Universidad de los Andes por enseñarme y
acompañarme durante todo el desarrollo de mi Tesis. Especialmente, a mi director
Edgar Vargas y a Valeria Eslava por su apoyo constante desde el inicio hasta la
culminación de este trabajo de investigación.
Finalmente, quiero agradecer el apoyo logístico del departamento de Química de la
Universidad de los Andes por permitirme realizar mi Tesis para optar por mi título
de Química.
Andrea Ordóñez Parra
