Guia Microbiologia LEM

LEMLEM Laboratorio de Ecología Microbiana

GUÍA DE APOYO PARA EL CURSO PRÁCTICO DE

MICROBIOLOGÍA INGENIERÍA EN ACUICULTURA Y ECOLOGÍA

MARINA

ELABORACIÓN: Dr. Carlos Riquelme S Ing. Milko Jorquera T

(solo para fines de docencia)

Departamento de Acuicultura, Facultad de Recursos del Mar UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA

LEM L a b o r a t o r i o d e E c o l o g í a M i c r o b i a n aL a b o r a t o r i o d e E c o l o g í a M i c r o b i a n a 1

SECCIÓN I: INTRODUCCIÓN A LA SECCIÓN I: INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍAMICROBIOLOGÍA

La microbiología es el estudio de los organismos, denominados microorganismos, los cuales debido a su pequeño tamaño no pueden ser percibidos por el ojo humano. Los microorganismos, tienen una amplia distribución taxonómica, incluyendo a metazoos, protozoos, microalgas, hongos, bacterias y virus. En el estudio de los microorganismos, debe incluirse el uso de nuevos ambientes acondicionados, materiales especializados y técnicas avanzadas.

El principal objetivo del curso práctico de microbiología es proveer al estudiante el conocimiento básico para el entendimiento de los microorganismos acuáticos, específicamente bacterias, y su manejo efectivo y seguro, entregando al estudiante una profunda apreciación de las relaciones de los microorganismos con su hábitat acuático. Además, de estimular al estudiante al racionamiento sobre presencia de diversos microorganismos en el mundo con el cual estamos diariamente en contacto.

1.1. In f raes t ruc tura y Equipamiento.In f raes t ruc tura y Equipamiento. El lugar destinado a la mantención y cultivo de

bacterias debe estar lo suficientemente aislado para evitar la contaminación de los medios de cultivo, así como, para mantener una temperatura estable, dependiendo de los requerimientos de la especie bacteriana. Generalmente, para el cultivo de bacterias marinas, se recomienda un rango de temperatura de 18-26°C. Este rango sirve tanto para el crecimiento de las células en unidades de cultivo, como para la mantención de cepas a través del tiempo. Actualmente, en el mercado existe una gran variedad de equipos para el control de la temperatura en ambientes cerrados (aire acondicionado), sin embargo, la elección de un equipo va a estar determinado por el tamaño de la habitación, el número de personas que trabajará en la habitación, las fuentes de calor

(mecheros, ampolletas, tubos fluorescentes, etc.) y el valor del equipo (manual o automático).

El trabajo en laboratorio con bacterias debe realizarse en un ambiente libre de agentes contaminantes (polvos, hongos, etc.), por lo cual, el lugar asignado debe presentar ciertas características que aseguren una baja probabilidad de contaminación. Cámaras o campanas de flujo laminar de aire son utilizadas para la transferencia y sembrado de bacterias (Fig. 1). Al interior de esta campana se genera una corriente de aire, libre de microorganismos y polvo, sobre el área de trabajo. El aire que forma la corriente es tomado desde la habitación, pasando por filtros hacía el interior de la campana, además este flujo circulante de aire forma una especie de pared invisible evitando el ingreso de contaminantes desde la habitación hacia el interior de la campana.

Figura 1. Campana de flujo de aire laminar,

utilizada en trabajos microbiológicos in vitro. Como complemento debe ubicarse dentro de

la campana un mechero Bunsen, el cual caliente el aire en el área de trabajo, provocando una corriente de aire ascendente, y un tubo de luz de irradiación ultravioleta (UV), el cual se utiliza para esterilizar el interior de la campana. Previo a trabajar en una campana, su interior debe ser desinfectado cuidadosamente con alcohol 70% (vol/vol), el cual ayuda a eliminar ciertos microorganismos no deseados o bio-


contaminantes. El flujo de aire y la luz UV, debe encenderse 15 minutos antes de su uso.

La mantención y cultivo de bacterias, generalmente se realiza en recipientes de vidrio de borosilicato (placas de Petri y tubos con tapa rosca). Estos recipientes, previo a su uso, deben ser lavados cuidadosamente con un detergente neutro, enjuagados reiteradamente con agua potable y agua destilada o des-ionizada, y finalmente empaquetados y esterilizados. Estos recipientes conteniendo los cultivos bacterianos deben disponerse en estantes metálicos o madera, susceptible a ser limpiados y desinfectados con facilidad periódicamente. Así mismo, para el cultivo de bacterias fototróficas y microalgas, se debe disponer de estantes iluminados por paneles de tubos fluorescentes. Generalmente, los tubos fluorescentes que se utilizan para el cultivo son de luz fría o luz día, ya que estos simulan mejor el rango de longitudes de onda (300-700 nm). Es importante tener en cuenta que los paneles de iluminación producen calor, por lo cual, se debe considerar este factor en el control de la temperatura de la habitación.

2. Es ter i l i zac ión y Des infecc ión.2. Es ter i l i zac ión y Des infecc ión. Como se ha señalado anteriormente, durante

el cultivo de bacterias en laboratorio es necesario disminuir la presencia de agentes bio-contaminantes. En este punto se referirá a los medios físicos y químicos de control de crecimiento microbiano. En general, puede ejercerse el control limitando el crecimiento, desinfección, o bien destruyendo los organismos por esterilización, que es la muerte o eliminación de todos los organismos viables de un medio de cultivo. En la practica, con frecuencia no se logra la esterilidad y por ello, muchas veces se intenta simplemente inhibir el crecimiento rápido de los microorganismos.

2.1. Es te r i l i zac ión.2.1. Es te r i l i zac ión. 2 .1 .1 . E2 .1 .1 . E s t e r i l i z ac ión po r ca lo r .s t e r i l i z ac ión po r ca lo r .

A medida que la temperatura se eleva por encima de la temperatura máxima de

crecimiento, se producen efectos letales sobre la célula bacteriana.

Calo r Húmedo:Ca lo r Húmedo: este tipo de esterilización se

realiza a través de un autoclave. El autoclave, es un aparato hermético que permite la entrada de vapor de agua a presión (Fig. 2). El uso de calor húmedo facilita la muerte de todos los microorganismos, incluidas las endosporas resistentes al calor. Para matar a las bacterias es preciso calentar a temperatura por encima del punto de ebullición del agua y usar el vapor sometido a presión. El procedimiento usual es calentar a 1,1 Kg/cm2 de presión de vapor, lo que proporciona una temperatura de 121°C. A 121°C se considera el tiempo de permanencia en el autoclave. Para lograr la esterilización es necesario un tiempo de permanencia de 10-20 minutos (Fig. 3). Este es el método más ampliamente utilizado y es aplicable tanto a medios de cultivo como a los recipientes de cultivo que soporten un rango de temperatura sobre los 140°C. El uso del autoclave puede, a veces, causar la precipitación de los medios de cultivo, preferentemente aquellos preparados con agua de mar. Esto podría evitarse de acuerdo a: (1) en vez de esterilizar por autoclave, esterilizar por filtración, (2) agregar sales de fosfato, metales trazas y soluciones de silicato estériles posterior al proceso de autoclavado, (3) autoclavar el medio en volúmenes pequeños y (4) disminuir el tiempo de permanencia a 10 minutos.

Calo r Seco :Ca lo r Seco : Sólo usado para material de vidrio o

metálico, ya que requiere temperaturas mayores a las usadas en un autoclave. El procedimiento usual es calentar el material a 160°C durante 2 horas en un horno.

2.1 .2 . E s t e r i l i z ac ión po r i r r ad iac ión .2 .1 .2 . E s t e r i l i z ac ión po r i r r ad iac ión .

Un camino efectivo para la esterilización o reducción de la carga bacteriana en casi cualquier tipo de material es mediante el uso de radiaciones electromagnéticas. La radiación UV, que normalmente se considera entre los 200 y


300 nm, posee energía suficiente para causar daños en el DNA bacteriano, conduciendo la muerte de este. Por ejemplo, las campanas de transferencia utilizadas en laboratorios de microbiología vienen equipadas con luz UV microbicida para descontaminar las superficies antes y después de usarlas. La radiación ultravioleta no puede penetrar en superficies sólidas opacas que absorben la luz, por ello su utilidad se limita a la desinfección de las superficies expuestas.

Figura 2. Autoclaves automáticos utilizados en la

esterilización de medios de cultivo y material de laboratorio.

Figura 3. Ciclo típico de un autoclave. La

temperatura del medio de cultivo u objeto se eleva más lentamente que la temperatura del autoclavado. Fuente: Madigan et al. 1997.

2.1 .3 . E s t e r i l i zac ión po r f i l t r ac ión .2 .1 .3 . E s t e r i l i zac ión po r f i l t r ac ión . Aunque el calentamiento es el camino más

común y eficaz para la esterilización de líquidos, esta no puede utilizarse para esterilizar compuestos sensibles al calor (por ejemplo, vitaminas) o gases (aire, CO2). Una técnica especialmente valiosa para esterilizar de tales materiales es la filtración. Un filtro es un dispositivo con poros demasiados pequeños para que los microorganismos puedan pasar por ellos, pero suficientemente grandes como para permitir el paso de los líquidos y gases.

Para el caso de esterilizar soluciones de cultivo o agua de mar, se usan filtros de membrana de una porosidad de 0,2 µm o menos. Estos deben ser del tamaño adecuado de acorde a la a cantidad y al tipo de líquido que se desea filtrar.

2.2. Des in fecc ión .2 .2 . Des in fecc ión . El crecimiento de los microorganismos también

puede controlarse con desinfectantes, que corresponden a agentes químicos que matan a los microorganismos y se utilizan generalmente sobre objetos inanimados. Estos agentes químicos bactericidas tienen un amplio uso de situaciones en las que no resulta practica la esterilización. Por ejemplo, compuestos clorados son utilizados en el control del crecimiento microbiano en mesones, paredes y pisos del laboratorio. Tabla 1. Tipos de desinfectantes. Fuente:

Madigan et al., 1997. DESINFECTANTES USOS MODO DE ACCION Dicloruro mercúrico

Mesas, superficie de mesones y pisos

Se combina con grupos –SH

Sulfato de cobre Algicida en piscinas Precipita proteínas Solución de iodo Heridas Ioda residuos de

tirosinas Gas cloro Depuración de

suministros de agua Agente oxidante

Compuestos clorados

Superficies, suministros de agua

Agente oxidante

Compuestos fenólicos

Superficies Denaturaliza proteínas

Detergentes catiónicos

Instrumental Interacciona con fosfolípidos

Oxido de etileno Material plástico Agente alquilante Ozono Agua de bebida Fuerte agente

oxidante


2.3. Pas teur i zac ión.2.3. Pas teur i zac ión. Es un proceso que reduce las poblaciones

microbianas en la leche y otros alimentos sensibles al calor. Su nombre deriva de Louis Pasteur. La pasteurización no es sinónimo de esterilización ya que no todos los microorganismos son muertos. Originalmente fue utilizada para matar patógenos causantes de la tuberculosis, la brucelosis, la fiebre Q y la fiebre tifoidea, entre otras. El procedimiento consiste en calentar la solución a 71°C por 15 segundos para luego ser enfriadas rápidamente.

2.4. San i t i zac ión .2 .4 . San i t i zac ión . Es un proceso estrechamente relacionado a la

desinfección. Una rama de la microbiología acuática ha iniciado el desarrollo de procesos para proveer de agua segura para la sociedad. Las aguas de desechos humanos, especialmente las aguas servidas, han requerido el desarrollo de procesos de ingeniería a gran escala de tratamientos de aguas servidas, dentro de los cuales muchos son microbiológicos. En la sanitización las poblaciones microbianas son reducidas a niveles que son considerados seguros por estándares de salud pública.

SECCIÓN II: MEDIOS DE CULTIVOSECCIÓN II: MEDIOS DE CULTIVO Aunque podemos tener una idea de la

apariencia de las bacterias en un hábitat natural, a través de estudios microscópicos, sus características se pueden estudiar mejor obteniéndolos en cultivo puro o axénico. Un cultivo puro es un cultivo que contiene solo una clase de bacteria. Para obtener un cultivo puro debemos ser capaces de hacer crecer las bacterias bajo condiciones de laboratorio. Esto requiere que le suministremos los nutrientes adecuados y las condiciones ambientales que le permita crecer. Es también esencial evitar el ingreso de bio-contaminantes en el cultivo. Existen diversos tipos de medio de cultivo usados en microbiología que varían de acuerdo a las necesidades del microorganismo estudiado.

Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado líquido o como geles semisólidos. Un medio líquido puede pasar a estado semisólido por adición de un agente solidificante, que normalmente es el agar. Los medios de cultivo con agar se disponen en placas circulares de vidrio o poliestireno, con tapaderas, que se denominan placas de Petri, donde las células bacterianas pueden crecer y formar masas visibles denominadas colonias. Los nutrientes que están presentes en el medio de cultivo proporcionan a las células los ingredientes requeridos para que se produzcan más células como ellas mismas. Además, de una fuente de energía, que puede ser un compuesto orgánico o inorgánico, o luz, un medio de cultivo debe tener una fuente de carbono y nitrógeno junto a otros nutrientes. En microbiología se usan dos grandes grupos de medios de cultivo:

1. Medios de cul t ivo químicamente 1. Medios de cul t ivo químicamente def inidos.def inidos.

Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento del microorganismo, en forma de compuestos orgánicos e inorgánicos altamente purificados en concentraciones conocidas y se preparan añadiendo agua destilada en cantidades precisas como solvente. El pH del medio de cultivo debe ser ajustado antes de la esterilización y usualmente son esterilizados en un autoclave por 15-30 minutos.

2. Medios de cul t ivo químicamente 2. Medios de cul t ivo químicamente indef inidos.indef inidos.

En muchos casos, el conocimiento exacto de la composición química no es crítico, por lo cual, se emplean en su preparación extractos nutritivos de la naturaleza (por ejemplo, extracto de suelo). Estos medios contienen todos los nutrientes necesarios para un microorganismo, pero en forma cruda. Muchos componentes son ácidos y enzimas digeridas de plantas, carnes, caseína y células de levadura los cuales proveen de ricas fuentes de polipéptidos, aminoácidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de componentes son las peptonas y triptonas, las cuales son hidrolizados


enzimáticos de proteína animal, o extractos de levadura, ricos en vitaminas con complejo-B. Algunos carbohidratos usualmente están presentes, pero generalmente estos medios son suplementados con azúcar (glucosa).

3. Preparación de medios de cultivo y su 3. Preparación de medios de cultivo y su es ter i l i zación.es ter i l i zación.

Los más comunes medios de cultivo para el cultivo de microorganismos contienen extracto de carnes y triptona. Los mayores constituyentes son proteínas degradadas, bases orgánicas, vitaminas y sales minerales. Generalmente, los medios utilizados en laboratorio se compran a empresas de suministros microbiológicos (Oxoid, Difco, Merck, Fluka, Riedel-deHaën, entre otros). Estos medios vienen deshidratados y deben prepararse según las indicaciones del fabricante. A continuación se presentan algunos ejemplos en la preparación de medios de cultivo.

3.1. Agar triptona soya (tryptone soya agar) 3.1. Agar triptona soya (tryptone soya agar) de Oxoid .de Oxoid.

Medio de cultivo general utilizado para el desarrollo in vitro de una amplia variedad de microorganismos.

Fo rmu la t í p i ca ( g ramo/ l i t r o ) :Fo rmu la t í p i ca ( g ramo/ l i t r o ) : triptona (15),

peptona de soya (5), cloruro de sodio (5) y agar bacteriológico (15). pH 7,3±0,2. Almacenamiento 10-25°C.

P repa rac ión :P repa rac ión : Añadir 40 gramos a 1 litro de agua destilada o des-ionizada. Llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

3.2. Agar Marino 2216 (marine agar) de 3.2. Agar Marino 2216 (marine agar) de Di fco . D i fco .

Aislamiento, cultivo y enumeración in vitro de bacterias heterótrofas marinas.

Fo rmu la t í p i ca :Fo rmu la t í p i ca : contiene todos los nutrientes

esenciales para el cultivo de bacterias heterótrofas marinas, incluyendo minerales que duplican la mayor parte de los minerales

contenidos en el agua de mar. pH 7,6±0,2 a 25°C.

P repa rac ión :P repa rac ión : Suspender 55,1 gramos en 1 litro de agua destilada o des-ionizada. Llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar a 121-124°C por 15 minutos.

4.4 . Distribución del medio de cultivo y Distribución del medio de cultivo y a lmacenamiento.almacenamiento.

Una vez esterilizado el medio de cultivo en el autoclave y presentando una temperatura aproximada de 60°C, este debe ser, en forma aséptica, cuidadosamente distribuido en placas de Petri (aproximadamente 15 ml/placa) o tubos de ensayo con tapa rosca (aproximadamente 15 ml/tubo). Si aparecen burbujas en la superficie del agar , estas deben ser removidas rápidamente con la llama invirtiendo el mechero Bunsen sobre la superficie del agar. Rotular y secar las placas por 48 horas a 30°C o 72 horas a temperatura ambiente. Posteriormente al secado, verificar la posible contaminación del medio de cultivo, en caso de placas contaminadas estas deben ser descartadas inmediatamente. En caso de contaminación con hongos, las placas no deben abrirse dentro del laboratorio, para evitar la diseminación de las esporas y/o posibles futuras contaminaciones. Por último, almacenar las placas rotuladas y debidamente empaquetadas, a 4°C hasta su uso.

Cabe destacar que los medios de cultivo semi-sólidos en placas de Petri, corresponden a caldos de cultivo a los cuales se les ha agregado 1,5-2,0% de agar. Por ejemplo, el caldo nutritivo (nutrient broth) de Oxoid, el cual esta compuesto de polvo “Lab-Lemco”, extracto de levadura, peptona y cloruro de sodio; se le agrega agar (15 gramos/litro), pasa a llamarse agar nutritivo (nutrient agar), el cual solidifica a temperatura ambiente.


SECCIÓN I I I : S IEMBRA Y SECCIÓN I I I : S IEMBRA Y AISLAMIENTO DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.MICROORGANISMOS.

En microbiología básicamente existen dos clases de acciones: el aislamiento, que consiste en la separación de un microorganismo en particular desde una población natural, conteniendo millones o billones de individuos, y el cultivo que es crecimiento de poblaciones en un ambiente artificial (medio de cultivo) bajo condiciones de laboratorio. Las bacterias no requieren grandes espacios para su desarrollo, ambientes artificiales pueden ser creados en unidades de confinamiento como los tubos, placas de Petri y matraces. Estos recipientes con medio de cultivo, inicialmente debe estar completamente estériles y después de la introducción de los microorganismos deseados, deben ser protegidos de una posterior contaminación externa.

Cuando se desea aislar una bacteria desde una muestra, es aconsejable llevar a cabo cultivos preparatorios antes de proceder al aislamiento. Uno de los más usados es el denominado es el cultivo de enriquecimiento. Los factores más importantes al preparar un cultivo de enriquecimiento son: (1) las condiciones de cultivo deben favorecer el crecimiento de las especies deseadas y (2) inhibir el crecimiento de especies competidoras para facilitar el posterior aislamiento. El cultivo de enriquecimiento debe incubarse en condiciones ambientales adecuadas, acorde con aquellas del ambiente natural, y debe ser examinado periódicamente, comenzando aproximadamente 24 horas después de haberse sembrado. El inóculo es comúnmente introducido a través de un asa de metal estéril o a través del uso de micropipetas graduadas (Fig. 3). A continuación se referirá a las tres técnicas comúnmente utilizadas en laboratorio para sembrar muestras de cultivo bacteriano.

Figura 3. Vista interior de la campana

bacteriológica. Se puede observar bolsas conteniendo placas de Petri estériles y un set de micropipetas para la inoculación y sembrado en medio de cultivo.

1. Siembra en estrías o rayado sobre el 1. Siembra en estrías o rayado sobre el agar.agar.

Cultivos bacterianos pueden realizarse sobre la superficie del agar en una placa de Petri, a través del sembrado en estrías con un asa metálica estéril (Fig. 4). Para esta técnica es necesario preparar placas con medio de cultivo sólido (1,5-2,0% agar bacteriológico). El objetivo de las estrías es producir colonias de bacterias en forma separada sobre el agar, a través de la distribución de un inóculo bacteriano proveniente de una suspensión de células concentradas. Al comenzar el estriado sobre el agar, las células quedan dispuestas en forma agrupada, pero al continuar el estriado las células se van liberando paulatinamente desde el asa quedando distribuidas en forma cada vez más separada sobre el agar. Una buena placa resulta de varios movimientos continuos del asa sobre el agar. El inóculo puede ser una pequeñísima cantidad de células provenientes de una colonia previamente cultivada, o bien provenir de pequeñas gotas de cultivo o suspensiones bacterianas (por ejemplo, gotas de agua de mar, homogenizado de tejido animal, secreciones, mucosidades, etc.).


Finalmente, las placas se sellan y dejan incubando en forma invertida.

Figura 4. Siembra en estrías sobre medio sólido. Fuente: Seeley et al. 1991.

2. Siembra en forma extendida.2. Siembra en forma extendida. Esta técnica se utiliza cuando el inóculo a

utilizar es líquido (caldo de cultivo, muestras de agua servida, orina, etc.). La técnica se basa en distribuir la muestra sobre la superficie del medio cultivo sólido en una placa de Petri. Un volumen de 0,1 ml (100 µl) de muestra se dispone sobre el medio con la ayuda de una micropipeta y posteriormente con un asa de vidrio (previamente sumergida en etanol 90%, flameada y enfriada) se comienza a distribuir el inóculo sobre el agar, hasta que este sea absorbido por el agar (Fig. 5). Finalmente, las placas se rotulan, sellan y dejan incubando en forma invertida. Para muestras con alta carga bacteriana, es necesario realizar diluciones a través de una serie de tubos conteniendo: (1) solución salina marina SSM (marine-saline solution, Austin 1988) o (2) solución de nueve sales SNS (nine-salts solution, Malmcrona-Friberg et al. 1990). El objetivo de las diluciones es obtener el desarrollo de colonias separadas sobre el agar, ya que a través de esta técnica es posible cuantificar las colonias y de esta forma estimar la carga bacteriana en la muestra inicial.

Figura 5. Siembra en forma extendida sobre medio sólido. Fuente: Seeley et al. 1991.

Fo rmu la t í p i ca de SSM (g ramo/ l i t r o ) :Fo rmu la t í p i ca de SSM (g ramo/ l i t r o ) : MgSO4×7H2O (7), KCl (0,8) y NaCl (24). Disolver en agua destilada y ajustar el pH 7,0 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Formula típica de SNS (gramo/litro)Formula típica de SNS (gramo/litro) :: NaCl (17,6), Na2SO4 (1,47), NaHCO3 (0,008), KCl (0,25), KBr (0,04), MgCl2×6H2O (1,87), CaCl2×2H2O (0,41), SrCl2×6H2O (0,001) y H3BO3 (0,01). Disolver en agua destilada y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

3. Siembra en forma ver t ida.3. Siembra en forma ver t ida. Al igual que la siembra en placa extendida, se

debe utilizar un inóculo líquido. Para esta técnica es necesario preparar tubos con 15 ml de medio de cultivo al cual se le ha adicionado 1,0% de agar. El tubo es licuado y mantenido en un baño termoregulado a una temperatura de 45-50°C (a punto de solidificar). Usando una micropipeta se transfiere a una placa de Petri estéril (sin medio de cultivo) 1 ml de la muestra inicial, o bien de las respectivas diluciones (Fig. 6). Posteriormente, se vierte sobre la muestra el medio de cultivo contenido en el tubo, se homogeniza vigorosamente en forma de cruz y se espera a que el agar solidifique (Fig. 7). En esta


etapa es necesario verificar que el medio de cultivo presente la menor temperatura posible, ya que esta puede afectar a las bacterias contenida en la muestra. Finalmente, las placas con el medio solidificado se rotulan, sellan y dejan en forma invertida hasta obtener el desarrollo de colonias embebidas en el agar. Al igual que la siembra en forma extendida, con esta técnica es posible cuantificar las colonias y de esta forma estimar la carga bacteriana en la muestra inicial.

Figura 6. Siembra en forma vertida, se adiciona 1

ml de la muestra sobre una placa de Petri estéril.

Figura 7. Siembra en forma vertida, se adiciona

el medio de cultivo, a punto de solidificar, sobre la muestra bacteriana, posteriormente se homogeniza y se espera que este solidifique antes de su incubación.

4. Siembra en medio de cultivo líquido.4. Siembra en medio de cultivo líquido. Esta técnica es bastante simple y consiste en

transferir el inóculo (sólido o líquido) a tubos conteniendo medio de cultivo líquido o caldo de cultivo. En el caso de inóculos sólidos (por ejemplo, trozos de tejido infectado por alguna patología), estos se transfiere con un asa de metal estéril, la cual es sumergida y agitada vigorosamente en el caldo de cultivo con el fin de liberar células bacterianas. Para inóculos líquidos se adiciona entre 10-20 µl de muestra en el caldo con la ayuda de una micropipeta. Una vez inoculado el caldo este es rotulado, sellado, homogenizado e incubado hasta obtener el crecimiento bacteriano, evidenciado por un aumento de la turbidez del caldo mirado a tras luz.

5. Aislamiento y obtención de cultivos 5. Aislamiento y obtención de cultivos puros. puros.

Teniendo éxito en el sembrado de las muestras, reflejado en el crecimiento de diversos componentes microbianos en el caldo de cultivo o sobre el agar, el siguiente paso es aislar cada uno de los componentes microbianos presentes o asociados a dichas muestras.

5.1. A is lamiento por es t r ías en agar .5.1. A is lamiento por es t r ías en agar . Células bacterianas pueden aislarse fácilmente

por estrías en agar. Esta técnica se basa en la siembra en forma de estrias y consiste en disponer una gota de la muestra líquida o una pequeñísima cantidad de una colonia sobre el agar a través de un asa metálica estéril. Con el asa se realiza continuos rayados sobre la superficie del agar. Posteriormente, las placas se incuban por 48 horas o más, hasta poder visualizar las microcolonias bacterianas que se forman sobre el medio de cultivo (Fig. 8). Finalmente, las colonias o unidades formadoras de colonias (UFC) son trasladadas a un medio de cultivo (líquido o sólido) nuevo.


Figura 8: Aislamiento por estrías en medio sólido,

observe el crecimiento de las UFC individuales. Fuente: John Durham/Photo Researchers, Inc.

5 .2. A i s lamien to por d i luc ión.5.2. A i s lamien to por d i luc ión. Esta técnica se utiliza cuando la bacteria que

se desea aislar está en abundancia. El principio básico es estimar la densidad poblacional de una muestra y efectuar diluciones necesarias para reducir la densidad, teóricamente, a una o unas pocas células. Por ejemplo, se toma 1 ml de una muestras (dilución 100), a la cual se le estimó bajo microscopía una concentración de 106 células/ml, y se inócula en un tubo de 9 ml de SSM estéril (dilución 10-1). Luego se homogeniza el tubo con la dilución 10-1 y se le extrae 1 ml para inocular otro tubo con 9 ml de SSM estéril (dilución 10-2). Esta operación se realiza sucesivamente hasta obtener la dilución 10-6, la cual teóricamente contiene una concentración de 1 célula/ml. Posteriormente, se realiza la siembra en forma extendida de las últimas diluciones (10-

4, 10-5 y 10-6) sobre medio de cultivo enriquecido. Estas placas se incuban hasta poder visualizar las UFC para luego ser traspasadas individualmente a nuevos recipientes de cultivos.

SECCIÓN IV: DINAMICA DE UN SECCIÓN IV: DINAMICA DE UN CULTIVO BACTERIANOCULTIVO BACTERIANO Durante el cultivo de una especie de bacteria en particular, se requiere de una comprensión adecuada de su ciclo de crecimiento, edad de cultivo y fase de desarrollo dinámico del cultivo. En microbiología, el crecimiento se define como un incremento en el número de células. El crecimiento es un componente esencial de la función celular, ya que una célula tiene un periodo de vida determinado en la naturaleza y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la población celular. El crecimiento de una población de bacterias puede ser medido como un incremento en la masa microbiana. La velocidad de crecimiento es el cambio en el número de células o masa celular, donde todos los componentes estructurales de las células se duplican. El tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células se denomina tiempo de generación. Por lo tanto, el tiempo de generación es el tiempo requerido para duplicarse el número de células con el de la masa microbiana. El tiempo de generación varía ampliamente entre las diferentes especies de bacterias.

1. Ciclo de crecimiento de poblaciones de 1. Ciclo de crecimiento de poblaciones de bacter ias. bacter ias.

En un recipiente cerrado o batch, una típica curva de crecimiento es la que se representa en la figura 9. Esta curva de crecimiento puede dividirse en varias fases: de latencia, exponencial, estacionaria y muerte.

1.1. Fase de la tenc ia o fase lag.1.1. Fase de la tenc ia o fase lag. Cuando una población bacteriana se inocula

en medio de cultivo fresco, no ocurre crecimiento inmediatamente, sino después de cierto tiempo que se llama fase de latencia, que puede ser más larga o más corta dependiendo de muchos factores. Si un cultivo en crecimiento exponencial se inocula exactamente en el mismo medio de


cultivo, no se observa esta fase sino que sigue creciendo exponencialmente. Sin embargo, si un inoculo se toma a partir de un cultivo viejo, entonces tiene lugar una fase de adaptación. Esto ocurre porque las células, en estas condiciones, carecen de determinados componentes esenciales y tiene que transcurrir un cierto tiempo para que se proceda su síntesis.

1.2 Fase exponenc ia l o fase log.1.2 Fase exponenc ia l o fase log. La fase exponencial es la consecuencia de que

una célula se divida en dos, éstas en otras dos y así sucesivamente. La mayoría de las bacterias crecen exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento exponencial pueden variar considerablemente. Tal velocidad es influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, composición del medio de cultivo, etc.), así como por las características genéticas de la bacteria en cuestión. Una de las característica del crecimiento en el número de células es lenta inicialmente, para después incrementar constantemente en una auténtica explosión del número de células.

Para muchos propósitos es útil conocer el tiempo de generación de una población bacteriana durante el crecimiento exponencial; tal información puede obtenerse de un análisis matemático de los datos del número células que tiene lugar en un cultivo creciendo exponencialmente, es una progresión geométrica del número 2. Al dividirse dos (para dar cuatro células) podemos expresar como 22-23 y así sucesivamente. Debido a la progresión geométrica, hay una relación directa entre el número de células presente en el momento inicial y el habido en un momento determinado del crecimiento exponencial, de modo que:

N1 = N02

n n = (log N2/N1)/log(t2-t1)

n = Número de generaciones ocurrido durante el

período de fase exponencial. t1 = Unidad de tiempo inicial. t2 = Unidad de tiempo final. N1 = Número de células/ml en el tiempo inicial. N2 = Número de células/ml en el tiempo final.

Como n esta expresado en términos de

cantidades, se pueden calcular los tiempos de generación. El tiempo de generación g se calcula como t/n, donde t son las horas o minutos de crecimiento exponencial. Por ejemplo, el tiempo de generación de un cultivo que inicio su fase exponencial con una densidad de 5×106 células/ml y que luego de 4 horas de crecimiento exponencial incrementó su densidad a 1×108 células/ml.

n = log (1×108) – log (5×106) = 8 – 6,698 = 2,162

Log 4 0,602

g = 4 = 1,85 2,162

Entonces, 2,162 generaciones de bacterias

tuvieron lugar durante 4 horas de crecimiento exponencial y la población bacteriana se duplicó cada 1,85 horas. El tiempo de generación g puede calcularse también de la pendiente en una gráfica semi-logarítmica de crecimiento exponencial. Con el conocimiento de n y t, uno puede calcular g para diversos organismos creciendo exponencialmente bajo diferentes condiciones de cultivo (Tabla 2). Los tiempos de generación en investigaciones microbiológicas son a menudo buenos indicadores del estado de salud fisiológico de una población celular.

Tabla 2. Tiempo de generación de algunas bacterias, de acuerdo a su temperatura óptima de crecimiento y cultivados en medio de cultivo complejos. Fuente: Stainer et al. 1990. ESPECIE TEMPERATURA

(°C) g (horas)

Vibrio natriegens 37 0,16

Bacillus stearothermophilus 60 0,14

Escherichia coli 40 0,35 Bacillus subtilis 40 0,43

Pseudomonas putida 30 0,75 Vibrio marinus 15 1,35

Rhodobacter sphaeroides 30 2,2

Mycobacterium tuberculosis 37 ~6 Nitrobacter agilis 27 ~20*

*Crecimiento en medio sintético.


1.3. Fase es tac ionar ia .1.3. Fase es tac ionar ia . En un cultivo donde no se renueva el medio de

cultivo, el crecimiento exponencial no es indefinido. Lo que habitualmente sucede es que, o bien un nutriente esencial del medio de cultivo se acaba, o algún producto de desecho se acumula en el medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del crecimiento exponencial. En esta fase no hay crecimiento neto (o decremento) del número de células. Sin embargo, aunque en esta fase no tiene lugar crecimiento, todavía ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energético y algunos procesos bio-sintéticos. En algunos microorganismos puede incluso tener lugar un crecimiento lento durante la fase estacionaría; algunas células crecen y otras mueren, siendo el balance total de ausencia de incremento en el número de células, este fenómeno se conoce como crecimiento críptico.

1.4. Fase de muer te .1.4. Fase de muer te . Si la incubación continúa después de que la

población alcance la fase estacionaria, las células deben permanecer vivas y metabólicamente activas, pero también deben morir. Si esto último ocurre se dice que las células entran en su fase de muerte. En algunos casos la muerte va acompañada de la lisis celular.

Figura 9. Curva de crecimiento ideal de una

población bacteriana en un cultivo batch.

2. Medición de crecimiento 2. Medición de crecimiento microbiano.microbiano. El crecimiento de una población microbiana se

mide siguiendo los cambios en el número o el peso de la biomasa celular. Existen diversos métodos para contar el número de células o para estimar la masa celular dependiendo del microorganismo que se trate.

2.1. Recuento directo de bacterias totales.2.1. Recuento directo de bacterias totales. El número de células de una población puede

medirse directamente al microscopio, es el método denominado como recuento directo. Se puede realizar en muestras secas o líquidas. El recuento microscópico directo es una manera rápida de estimar el número de células microbianas. Sin embargo, tiene una serie de limitaciones: (1) las células muertas no se distinguen de las vivas, (2) las células pequeñas son difíciles de ver al microscopio, (3) se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisión por este método, (4) se requiere de un microscopio de contraste de fase cuando la muestra no es teñida, o con sistema de fluorescencia cuando se trabaja con tinciones fluorescentes y (5) este método no es bueno para una suspensión de células poco densa (<106 células/ml).

2 .1 .1 . Mé todo de B reed .2 .1 .1 . Mé todo de B reed .

Este método se basa en distribuir un volumen conocido de la muestra, que se quiere cuantificar, en un cuadrado de 1 cm2 sobre un portaobjeto. El número de microorganismos en la muestra es determinado contando diferente campos bajo el microscopio. Para la realización de este método es necesario fijar la muestra y teñir las células con una tinción básica (Fig. 10).

Para entender como la tinción actúa sobre la célula, primero se debe saber que es una tinción. Muchas tinciones son sales, de las cuales una parte es coloreada. Una sal es un compuesto constituido por un ión con carga positiva y otro ión con carga negativa. Por ejemplo, el azul de metileno corresponde a cloruro de azul de metileno:


AMC azul metileno+ + cloruro-

El color se encuentra en la carga positiva. Las células bacterianas tiene una carga negativa cuando el pH que las rodea es cercano a 7. La carga negativa de la célula se combina con la carga positiva del ión azul de metileno, dando como resultado la célula teñida. Las tinciones pueden dividirse en básica y ácida. Si el color se encuentra en el ión positivo se denomina tinción básica, por el contrario si el color se encuentra en el ión negativo se denomina tinción ácida.

A continuación se referirá al procedimiento

utilizando para el recuento como tinción básica, a través del uso de cristal violeta. P roced im ien to :P roced im ien to : - Dibuje un cuadrado de 1 cm2 sobre un

portaobjeto. - Prepare una suspensión bacteriana en un tubo

de SSM o SNS y disponga una gota (10-20 µl) de la suspensión sobre el portaobjeto, o bien, disponga una gota (10-20 µl) de SSM o SNS sobre el portaobjeto y a través de un asa metálica estéril disuelva un pequeño inóculo tomado desde una UFC.

- Distribuya la muestra tratando de cubrir el área del cuadrado.

- Seque la muestra con la ayuda de la llama del mechero Bunsen. Cuide no calentar excesivamente la muestra, ya que puede producir cambios en la morfología de la célula.

- Tiña con cristal violeta por 30 segundos y lave con agua.

- Seque la muestra a la llama del mechero. - Observe y cuente las células bajo microscopía

con aceite de inmersión. - Haga el cálculo para determinar la

concentración bacteriana de la muestra.

Figura 10. Bacillus sp. teñido con cristal violeta

para la realización del recuento de Breed.

2.2. Recuento de células viables cultivables.2.2. Recuento de células viables cultivables. En el método anterior se cuentan tanto

bacterias vivas como muertas. En muchos casos estaremos interesados en contar solo las vivas y para ello se han desarrollado métodos recuentos para bacterias activas. Una célula viable cultivable se define como la que es capaz de dividirse y dar lugar a descendencia y la forma habitual de llevar a cabo el recuento, es determinar el número de células capaces de formar colonias sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. El racionamiento que se sustenta este método es que cada célula viable puede dar lugar a una colonia, por lo cual, esta se denomina unidad formadora de colonia o UFC. Hay dos maneras de llevar este contaje en placa, por siembra en forma extendida o por siembra de forma vertida.

2.3. Recuento directo de bacterias viables.2.3. Recuento directo de bacterias viables. Diversos estudios han señalado que los

métodos tradicionales de siembras en medio de cultivo arrojan recuentos bacterianos que solo representan 0,001% a 0,1% del total de las bacterias presentes en un ecosistemas marino. Por lo tanto, existe un alto porcentaje de bacterias que se encuentran activas pero el medio de cultivo o las condiciones de cultivo no facilitan su crecimiento. Para soslayar esta problemática, se han desarrollados diversos métodos de recuento directo de bacterias viables


o direct viable-cell counting (DVC), basados en observaciones de frecuencia de división celular y/o basados en reacciones de actividad enzimática. Uno de estos métodos generalmente usados, corresponde al método del ácido nalidíxico (Fig. 11), este se refiere a la incubación de una suspensión bacteriana con agentes antibacterianos (ácido nalidíxico, ácido piromídico, etc.). El agente antibacteriano actúa como inhibidor de la síntesis de ADN y previene la división celular sin afectar la actividad metabólica de la célula. Como resultado la célula metaboliza los nutrientes y comienza a elongarse o engordar, en cambio las células muertas permanecen con el tamaño original. Este recuento de células elongadas suele ser más representativos de las bacterias metabólicamente activas en las muestra que aquellas obtenidas por recuentos de viables cultivables en placas.

Figura 11. Método de ácido nalidíxico, donde

se aprecia, bajo técnicas de observación con fluorescencia, células elongadas (células activas) después del periodo de incubación.

2.4. Es t imac ión de masa ce lu lar .2 .4. Es t imac ión de masa ce lu lar . En algunos casos, es necesario estimar la masa

de células presente en el cultivo más que el número de células. Sin embargo, debido a que la masa celular es proporcional al número se puede utilizar la determinación de un parámetro

para estimar otro. Se puede medir la masa celular neta por centrifugación o filtración de un volumen conocido y simplemente pesar el precipitado o las células retenidas en el filtro. El procedimiento habitual es determinar el peso seco después de secar la muestra durante una noche a 90-110°C.

2.5. Estimación por absorción de la luz.2.5. Estimación por absorción de la luz. Un método más rápido y útil, para obtener una

estimación del número de células o biomasa, consiste en la utilización de medidas de dispersión luminosa. Una suspensión celular aparece turbia por que las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. Esta turbidez puede medirse con un fotómetro o espectrofotómetro, aparatos que hacen pasar la luz a través de una suspensión celular y detectan la cantidad de luz no dispersada. Sin embargo, previo al uso de esta técnica es necesario realizar recuentos directos celulares con el objeto de establecer una curva de cantidad de luz no dispersada versus concentración bacteriana.

SECCIÓN V: IDENTIFICACIÓN SECCIÓN V: IDENTIFICACIÓN BACTERIANABACTERIANA

Los hábitats acuáticos raramente contienen una sola especie de bacteria. Para determinar que microorganismo vive en un hábitat, cada especie presente debe ser aislada en un cultivo puro e identificada. Los microorganismos no tienen una variedad definida de características anatómicas y obviamente difieren notablemente de los patrones utilizados en botánica y zoología. La identificación bacteriana se basa en una variedad de características que incluye no solo la morfología, sino también características fisiológicas, patógenas, serológicas y, recientemente, información genética. Para muchos microbiólogos la forma de las células, la apariencia de los cultivos en laboratorios, respecto a la forma de la UFC y su pigmentación, con herramientas útiles en su identificación (Fig. 12). Otras características importantes en el reconocimiento de una bacteria pueden ser la


habilidad de utilizar o atacar ciertas substancias (substratos), producir cambios o productos químicos y causar una enfermedad en particular.

Sin embargo, la tarea de identificación de una especie bacteriana no sencilla pudiendo ser simplificada por pruebas acerca de las características particulares de los microorganismos: requerimientos nutricionales y de temperatura, productos metabólicos y otros.

Añadiendo sustancias químicas selectivas a la formula típica de los medios de cultivo o imponiendo una condición especial durante el crecimiento del cultivo se puede reprimir el crecimiento de ciertos microorganismos no-deseados y favorecer el crecimiento de microorganismos deseados para estudiar.

Figura 12. Guía de términos frecuentemente usados en la descripción de UFC. Whole colony: forma de

UFC (puntiforme, circular, rizoidea, irregular, filamentosa, etc.), edge: borde de la UFC (entero, ondulado, lobulado, rizado, etc.), elevation: elevación de la UFC (plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, etc.), Surface, superficie de la UFC (lisa, brillante, rugosa, encarrujada, seca, polvorosa, etc.). Fuente: Seeley et al. 1991.

1. Medio de cul t ivo enr iquecido o 1. Medio de cul t ivo enr iquecido o se lec t ivo.se lec t ivo.

El objetivo de este medio es favorecer el desarrollo de microorganismos dándole ventajas por sobre sus competidores. Por ejemplo, ajustando el pH 4 de un medio e incubándolo en condiciones anaeróbicas se previene el

crecimiento de gran parte de los grupos bacterianos, promoviendo el crecimiento de bacterias ácido-tolerantes como bacterias del ácido láctico Lactobacillus. Si el medio es preparado con lactato de sodio como la única fuente de energía, de preferencia se producirá el desarrollo de bacterias que utilizan el lactato como Propionibacterium o Veillonella. Si se pretende aislar miembros del género Vibrio,


habitante común de los ecosistemas acuáticos y comúnmente asociado a la flora de invertebrados marinos, el medio utilizado corresponde al tiopsulfato-citrato-sales biliares-sucrosa o TCBS. Este medio de cultivo favorece de crecimiento de vibrionáceas inhibiendo el desarrollo de otros componentes bacterianos en una muestra.

2. Medio de cul t ivo di ferencial .2. Medio de cul t ivo di ferencial . Algunos medios de cultivos están sujeto a

muchas (a veces inadvertidas) influencias selectivas: la composición del medio, temperatura de incubación, pH, relación de oxigeno y otros. El aislamiento e identificación bacteriana puede ser orientada a bacterias que pueden realizar una reacción en particular. Por ejemplo, si se desea aislar un microorganismo que puede hidrolizar la urea, las muestras deben sembrarse en medio conteniendo urea y un indicador de pH. Durante el desarrollo de las colonias, aquellas que utilizan la urea produciendo amonio, deberían ser reveladas debido al cambio de color del indicador a su alrededor. Otro ejemplo, corresponde al medio TCBS, anteriormente señalado, ya que este medio además de ser selectivo para Vibrios presenta un indicador de pH el cual vira de verde a amarillo cuando se produce el desarrollo de colonias de bacterias capaces de fermentar la sucrosa, siendo denominadas sucrosa +.

3. Tinción Di ferencial .3. T inción Di ferencial . Se denominan tinciones diferenciales aquellas

que no tiñen de manera homogénea a todos los tipos de células. La más importante tinción diferencial utilizada en microbiología se denomina tinción de Gram, en honor al microbiólogo que lo describió.

3.1. T inc ión Gram.3.1. T inc ión Gram. Este procedimiento divide a las bacterias en

dos grandes grupos: gram-positiva y gram-negativa. La diferencia entre los dos tipos de células es debido a la variación de su pared celular. La capa responsable de la rigidez en las

paredes de las gram-positivas y gram-negativas es muy similar en su composición química. Se le denomina peptidoglicano (o mureína) y esta formada por dos derivados de azucares N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico, y un pequeño grupo de aminoácidos que incluye la L-alanina, D-alanina, D-glutámico y lisina entre otros. Estos componentes se unen entre sí para formar una estructura que se repite a lo largo de la pared y que se denomina tetrapéptido del glicano. En bacterias gram-posititvas el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared. En bacterias gram negativas el peptidoglicano constituye sólo alrededor del 10% de la pared, estando constituido el resto por una compleja capa de lipopolisacaridos y proteínas.

La tinción Gram requiere de cuatro soluciones: una tinción básica, un mordiente, un agente decolorante y una contra-tinción. El mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y la tinción. Bajo la acción del mordiente la célula es intensamente teñida y mucho más dificultosa de lavar después de la aplicación del mordiente. El agente decolorante, como el nombre lo señala, es una sustancia que remueve la tinción desde la célula. Algunas células teñidas decoloran más fácilmente que otras. La contra-tinción, es una tinción básica de un color diferente a la tinción inicial. El propósito de esta es dar a las células decoloradas un color diferente al de la tinción inicial. Los microorganismos que no son fácilmente decolorados retienen el color inicial de la tinción básica y aquellos que son fácilmente decolorados toman el color de la contra-tinción (Fig. 13). A continuación se referirá al procedimiento gram utilizando como tinción básica a cristal violeta, mordiente lugol, decolorante alcohol y contra-tinción safranina. Procedimiento: - Prepare una suspensión bacteriana en SSM o

SNS sobre un portaobjeto y fíjela bajo la llama del mechero Bunsen.

- Tiña con cristal violeta por 30 segundos y lave con agua.

- Cubra la muestra con lugol y deje actuar por 30 segundos.


- Lave con agua. - Decolore la muestra con alcohol 95° por 10-

20 segundos y lave con agua. - Tiña con safranina por 20-30 segundos y lave

con agua. - Seque la muestra a la llama del mechero. - Observe bajo microscopía con aceite de

inmersión. - Haga un esquema en una hoja de reporte.

Figura 13. Tinción de Gram. Observe las células

de color violeta o azul oscuro, correspondiendo a bacterias gram-positivas. Fuente: John Durham/Photo Researchers, Inc.

4. Pruebas bioqu4. Pruebas bioqu ímicas.ímicas. Como se ha señalado anteriormente, una

parte importante en la identificación es la habilidad de utilizar substancias y producir ciertos productos químicos. Tradicional la identificación, esta basada en la suposición que se cuenta con un cultivo bacteriano puro (libre de bio-contaminantes) y en esquemas de identificación (Fig. 14) constituidos por una serie de fermentación de azucares e hidrólisis de compuestos químicos. Las características utilizadas para la identificación bacteriana pueden ser consultadas en el Manual de Sistemática Bacteriológica de Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Holt et al. 1994). Este manual, de proporciones de enciclopedia, comprende un sistema taxonómico

que es seguido por la mayoría de los microbiólogos. Para ubicar una especie en particular en la amplia clasificación géneros y familias, es necesario seguir diversos esquemas de identificación constituidos por una amplia gama de pruebas, de las cuales a continuación se describirán algunas:

FermentacióFermentación de Carbohidratos (glucosa, lactosa n de Carbohidratos (glucosa, lactosa

y a rab inosa ) :y a rab inosa ) : Los productos finales de esta fermentación son ácido y/o gas. Producto de esto el medio de cultivo se acidifica evidenciado por el cambio de color rojo (alcalino) a amarillo (ácido) utilizando como indicador rojo fenol. Uso en la diferenciación de Enterobacteriaceae.

Descarboxilación (lisina, ornitina y arginina)Descarboxilación (lisina, ornitina y arginina): La descarboxilación de los aminoácidos libera CO2 y amina, resultando en la alcalinización del medio. Esta reacción produce el cambio de pH pasando de un color amarillo pálido (ácido) a púrpura (alcalino) utilizando como indicador el púrpura de bromocresol. Uso en la diferenciación de grupos dentro de la familia Enterobacteriaceae.

P rueba de P rueba de ββ -- ga lac to s i dasa (ONPG)ga lac to s i dasa (ONPG) : El ortonitrofenil-βgalactósido es un substrato artificial para la enzima. Cuando se hidroliza, se forma el nitrofenol (amarillo). Utilizado en la identificación de algunas especies de Shigella y Pseudomonas.

P roducc ión de HP roducc ión de H22 S :S : El sulfito de hidrogeno, liberado por la bacteria capaces de romper los aminoácidos azufrados o de reducir el tiosulfato, reacciona con las sales de hierro presentes en el medio de cultivo formando un precipitado negro de sulfuro férrico. Utilizado en la identificación de Salmonella.

Fo rmac ión de i ndo l :Fo rmac ión de i ndo l : La producción de indol obedece al metabolismo del triptofano por la enzima triptofanasa que es detectada por el desarrollo de un color rosa-rojo después de la adición del reactivo de Kovac (di-metilaminobenzaldehido). Utilizado en la identificación de Escherichia y Edwardsiella.

VogesVoges -- P roskauer :P roskauer : Acetilmetilcarninol (acetoina) es un intermediario en la producción de glicol


butileno producto de la fermentación de la glucosa. La presencia de acetoína es indicada por el desarrollo de un color rojo producto de la adición de α-naftol. Utilizado para identificar Bacillus y separar Klebsiella-Enterobacter de Escherichia.

Hid ró l i s i s de l a u r ea :H id ró l i s i s de l a u r ea : La producción de ureasa por algunas bacterias, la cual hidroliza la urea produciendo amonio, es revelada por el cambio de pH pasando de un color amarillo (ácido) a un color rojizo-púrpura (básico) utilizando como indicador el rojo fenol. Uso para distinguir Klebsiella de Escherichia.

Uti l i zac ión de c i t ra to: Ut i l i zac ión de c i t ra to: Microorganismos capaces de utilizar el citrato, en un medio que contiene a este como única fuente de carbono, producen la alcalinización del medio, los cuales son evidenciados utilizando el indicador azul de bromotimol, el cual con el cambio del pH en el medio pasa de un color verde (ácido) a un color azul marino (alcalino). Uso en la identificación de Klebsiella-Enterobacter y Salmonella.

Ox idasa :Ox ida sa : La oxidasa determina la capacidad de una bacteria para oxidar ciertas aminas aromáticas, por ejemplo, p-aminodimetilanilina, produciendo productos coloreados. Esta oxidación esta relacionada con la actividad citocromo oxidasa de algunas bacterias. Utilizado en la identificación de Pseudomonas y Aeromonas.

Ca ta la sa :Ca ta la sa : La catalasa es una enzima producida por una gran variedad de bacterias, esta enzima descompone el peróxido de hidrogeno (agua oxigenada) liberando O2. Utilizado en la identificación de Bacillus.

Figura 14. Esquema para la identificación de grupos bacterianos. Fuente: Seeley et al. 1991.


Fig. 15. Sistema API 20E mostrando el resultado de las pruebas de identificación con Proteus vulgaris (arriba) y Escherichia coli (abajo). Fuente: Seeley et al. 1991.

4.1. S i s temas min ia tur i zados de 4.1. S i s temas min ia tur i zados de iden t i f i cac ión.iden t i f i cac ión.

La pruebas descritas anteriormente pueden ser costosas y/o ocupar demasiado tiempo. La identificación se ha ido inclinando por el uso de sistemas miniaturizados de identificación bacteriana. Estos sistemas emplean multi-compartimentos que requieren menos medios de cultivo y provee rápidos resultados que son adaptados a procesos computacionales. Un ejemplo de estos sistemas corresponde al Sistema API 20E (Fig. 15). Este es la versión estandarizada, miniaturizada de 23 pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de Enterobacteriacea y otras bacterias gram-negativa. Este sistema puede ser usado el mismo día y el periodo de incubación para la identificación abarca de 18-24 horas para Enterobacterias y 36-48 para otras bacterias gram-negativa. El sistema consiste en microtubos conteniendo substratos deshidratados de diferentes reactivos para la identificación. Como otros sistemas de identificación los resultados son

presuntivos y deben complementarse la identificación con pruebas inmunológicas utilizando controles positivos como Salmonella, Shigella, E. Coli y Vibrio cholerae. Los resultados de las diferentes pruebas bioquímicas son reducidos a valores, usando números binarios. Estos números son sometidos a análisis computacionales contrastándolos con una base de datos.

Sin embargo, estos sistemas presentan una serie de desventajas, tales como: (1) la sensibilidad de algunas pruebas son cuestionables, (2) la interpretación de los resultados puede ser difícil, (3) algunas veces es necesario desarrollar otros ensayos bioquímicos y serológicos.

5. Técnicas moleculares de identificación.5. Técnicas moleculares de identificación. En los últimos años, métodos moleculares

basados en análisis comparativos de secuencias génicas del 16S y 23S ARN ribosomal han revelado una nueva diversidad de las comunidades bacterianas en ambientes


acuáticos. Numerosas nuevas secuencias genéticas han sido encontradas, indicando que una alto porcentaje de especies bacterianas no se encuentra representada en las colecciones clásicas de cepas bacterianas de los centros microbiológicos. Esta información se encuentra contenida en el ADN y ARN de las células bacterianas proveyendo las bases del entendimiento, desarrollo y racionamiento en el uso de técnicas moleculares para la detección e identificación bacteriana a nivel individual o comunitario. Estas técnicas están basadas en la identificación de porciones de material genético (cadenas de ácidos nucleicos) específicos de cada grupo o especie bacteriana. Con esta secuencia se diseñan sondas o cadenas de ácidos nucleico perfectamente complementarias con la secuencia específica de cada grupo bacteriano. La detección esta basada en la formación de cadenas dobles, formando un híbrido ADN-ADN o ARN-ADN, entre la sonda y el material genético de la muestra a identificar. Estas pruebas pueden ser usadas con tecnologías de amplificación para otorgar una mayor sensibilidad, o bien, pueden ser etiquetadas usando radio-isotopos o moléculas fluorescentes, siendo visibles bajo equipos de fluorescencia. Actualmente, varias técnicas y sondas basadas en secuencias de ADN o ARN están disponibles pudiendo ser usadas para la detección de específicas grupos bacterianos.

5.1. Hibridización f luorescente in s i tu o 5.1. Hibridización f luorescente in s i tu o f luorescent in s i tu hybr id iza t ionf luorescent in s i tu hybr id iza t ion (FISH). (FISH).

Para la técnica de FISH se utilizan sondas de oligonucleotidos ARNr que a través de un procedimiento de hibridización penetra la célula y se une a su complementaria con el ARNr de las bacteria. Estas sondas deben presentar afiliación con cierto grupos bacterianos y deben ser etiquetadas con una tinción fluorescente para poder ser cuantificadas en un microscopio equipado con un sistema de fluorescencia.

SECCIÓN VI: MÉTODOS DE SECCIÓN VI: MÉTODOS DE MUESTREOS BACTERIOLÓGICOS MUESTREOS BACTERIOLÓGICOS EN PECES Y MOLUSCOS.EN PECES Y MOLUSCOS.

Durante las últimas décadas se han desarrollados significativos avances sobre el estudio de la asociación de microorganismos a peces y moluscos. Este conocimiento se ha centrado en interrelaciones patogénicas y parasitarias de bacterias, hongos, protozoos y virus. Principalmente la atención se ha enfocado a microbiología de organismos cultivados, producto de la importancia de la acuicultura como contribución económica en muchos países.

Los organismos acuáticos están continuamente inmersos en suspensiones de microorganismos, los cuales están en contacto con sus superficies externas. De igual forma, estos organismos ingresan porciones de agua y alimento a su tracto digestivo, conteniendo un amplio rango de microorganismos patógenos y parásitos. Algunas bacterias pueden ser atraídas activamente por los organismos acuáticos a través de procesos quimiotáctico, mientras que otros solo hacen contacto en forma accidental.

Las diferentes relaciones existentes entre los organismos acuáticos y las bacterias, pueden resumirse de la siguiente forma: - Algunas bacterias pueden estar estrechamente

asociadas con las superficies externas e internas, siendo frecuentemente colonizadores.

- Algunas bacterias pueden ser inhibidas por compuestos antimicrobianos producidos por el organismos hospedador.

- Algunas bacterias pueden ser atraídas y acumuladas en zonas dañadas (heridas) del hospedador.

- Ciertas bacterias pueden ser atrapadas por los filamentos branquiales, donde luego pueden ser incorporadas como microflora estable del organismo.

- Dentro del tracto intestinal, los microorganismos pueden ser retenidos como parte de la microflora estable, ser destruidos por la acción digestiva del hospedador, ser utilizados como fuente de alimento o pasar a


través del tracto para luego ser eliminadas como material fecal.

1. Muest reos de peces y moluscos.1. Muest reos de peces y moluscos. El avance de la acuicultura ha llevado a la

necesidad de controlar y reducir los efectos infecciosos en peces y moluscos cultivados. Atendiendo al control en cultivos se han establecidos varias técnicas, las cuales incluyen la administración de drogas, vacunas y químicos. Así como métodos profilácticos seguido del diagnostico clínico de enfermedades. Métodos bacteriológicos han sido comúnmente utilizados para el diagnostico enfermedades en peces y moluscos. Esto se debe a las significativas perdidas producidas por el ataque de bacterias patógenas a los centros de cultivo, lo cual conlleva a cuantiosas perdidas económicas. A continuación se referirá al procedimiento de muestreo para el aislamiento de componentes bacterianos asociados a órganos internos de invertebrados marinos, en el caso de que estos estuviesen afectados por alguna patología.

P roP ro ced im ien to :ced im ien to : - Sitúe un pescado o molusco sobre un mesón

de trabajo con un mechero Bunsen encendido. - Desinfecte la superficie del mesón con alcohol

70°. - Proceda a etiquetar el organismo y elabore

una ficha con todos los datos necesarios para una buena identificación del organismos (número, fecha, procedencia, peso, longitud, etc.).

- Realice una observación externa del organismo verificando la presencia de anormalidades, tales como: heridas, úlceras, forúnculos, coloración, inflamación, condición general del organismo, etc.

- Realice la disecación del organismo con el fin de permitir examinar los órganos internos (glándula digestiva, gónadas, riñón, etc.). Utilice material (pinzas y tijeras) desinfectado con alcohol 90° y flameado en el mechero.

- Realice una observación de los órganos internos del organismo verificando la presencia

de anormalidades, tales como: heridas, úlceras, forúnculos, coloración, inflamación, condición general del organismo, etc.

- Corte un trozo de tejido (aproximadamente 1 gramo), deposítelo al interior de una bolsa de poliestileno estéril y agregue 10 ml de SSM o SNS.

- Homogenize la muestra durante 3-5 minutos con la ayuda de un homogenizador Stomacher®.

- Traspase la muestra homogeneizada a un tubo de ensayo estéril y diluya para su sembrado.

- Siembre la muestra en estrías y en forma extendida sobre medios de cultivo general y selectivo, según el grupo de microorganismos que se desea aislar.

- Incube la muestra y posteriormente realice el recuento de UFC en la placa sembrada en forma extendida y realice aislamientos en estrías desde la placa sembrada en estrías.

Nota: recuerde que la carga bacteriana debe ser expresada en UFC por gramo de tejido muestreado.

2. Ant ibiograma.2. Ant ibiograma. Cuando un centro de cultivo es afectado por

una enfermedad bacterianas es necesario tomar medidas rápidas para su control. En primer lugar es necesario identificar los síntomas presentes en los organismos enfermos, de esta forma se obtiene un acercamiento de cual tipo de organismos patógeno puede tratarse. Esta búsqueda de información debe realizarse en literatura especializada acerca de bacterias que afectan a organismos marinos. En segundo lugar deben realizarse aislamiento de los diversos componentes bacterianos desde los tejidos externos o internos de los organismos enfermos, utilizando medios de cultivos selectivos de acuerdo al agente etiológico que se sospecha como causante de la patología. Una vez obtenidos los diferentes aislados se pueden hacer diferentes pruebas de identificación bioquímicas para confirmar la presencia del patógeno, o bien, si se desea tratar la enfermedad a través de tratamientos con antibiótico es necesario realizar pruebas de sensibilidad en disco de los aislados


microbianos sospechosos, como se describe a continuación.

Filtros de papel impregnados con varios antibióticos son utilizados para determinar in vitro la susceptibilidad de los aislados a los antibióticos. Estos filtros son ubicados sobre la superficie de una placa de medio donde previamente fue sembrado en forma extendida con el microorganismo a ser examinado (Fig. 16). El crecimiento microbiano durante la incubación se desarrolla alrededor de los discos conteniendo el antibiótico. Zonas sin crecimiento o halos de inhibición son encontradas alrededor de antibióticos que inhiben el crecimiento del microorganismo examinado. El diámetro del halo causada por la difusión del agente antibacteriano sobre el agar está directamente relacionado con el grado de susceptibilidad de la bacteria (Fig. 17).

Figura 16. Antibiograma o técnica de Kirby-

Baeur. Disposición de discos con diversos antibióticos sobre un medio de cultivo de cultivo previamente sembrado con el microorganismo a ensayar. Fuente: Seeley et al. 1991.

SECCIÓN VI I : ANALISIS DE SECCIÓN VI I : ANALISIS DE CALIDAD DE AGUA Y DE CALIDAD DE AGUA Y DE PRODUCTOS HIDROBIOLÓGICOSPRODUCTOS HIDROBIOLÓGICOS

Microorganismos son generalmente usados como indicadores de posibles contaminaciones y

como un índice de calidad de agua. Gran relevancia se les ha atribuido a grupos bacteriano denominados coliformes, para determinar los niveles seguros del agua potable, así mismo coliformes y otros organismos son también asociados a consecuencias adversas para la salud humana en aguas recreacionales y productos provenientes de la acuicultura y pesquerías. Gastroenteritis es la principal aflicción asociada a patógenos en agua. La presencia de Enterobacteriaceae en agua potable, aguas recreacionales y productos hidrobiológicos (pescados, moluscos, crustáceos, cefalópodos, equinodermos, algas y otros provenientes de la pesca o acuicultura en cualquier estado de preparación, frescos, enfriado, congelados o ahumados) son de extremada importancia para determinar calidad microbiológica de estas.

Figura 17. Formación y medición de halos de

inhibición alrededor de discos conteniendo antibióticos, a los cuales la bacteria ensayada es susceptible. Fuente: Seeley et al. 1991.

La Familia Enterobacteriaceae, son bacterias

colonizadoras normales del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente. Son bacilos gram-negativos aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con o sin


producción de gas, reducen los nitratos a nitritos, son oxidasa negativo y catalasa positivo.

Métodos de cultivo son generalmente utilizados para la detección de bacterias. Sin embargo, miles de diferentes microorganismos asociados a brotes epidémicos no crecen en medio de cultivo debido a la continua acción estresante de los desinfectantes usados en el tratamiento de agua potable. Como resultado, análisis de bacterias patógenos en agua es extremadamente complicado y no asegura una completa seguridad para el consumidor. A continuación se referirá a grupos de organismos y técnicas que son usadas para determinar la calidad microbiológica de agua y productos hidrobiológicos.

1. Microorganismos indicadores.1. Microorganismos indicadores.

1.1. Col i formes to ta les .1.1. Col i formes to ta les . La tradicional definición de este grupo de

bacterias se refiere a bacilo curvado que fermenta la lactosa con producción de gas y ácido en 24 a 48 h a 35°C. Este grupo pertenece a la familia Enterobacteriaceae, incluyendo a Escherichia coli así como a varios miembros del genero Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter cuando son aplicados criterios de análisis microbiológicos de calidad de agua. Estas bacterias son clásicamente usadas como indicador de contaminación fecal de aguas o de polución.

1.2. Coliformes 1.2. Coliformes fecales (coliformes termofecales (coliformes termo--to lerantes ) .to lerantes ) .

Este grupo constituye el indicador de contaminación homeoterma fecal. Estas bacterias pueden crecer y fermentar lactosa con formación de gas y ácido a las 48 horas de incubación a una temperatura de 44,5ºC. Este grupo se encuentra presente en el intestino del hombre y otros animales de sangre caliente. Estas bacterias corresponden principalmente a los géneros Escherichia y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales se utiliza como indicador de la

presencia aguas servidas o de manipulación inadecuada de la higiene de los alimentos.

E. coli no solo satisface el criterio de coliformes totales y fecales, sino que ha demostrado ser el mas específico indicador de la presencia de contaminación fecal.

1.3. S t rep tococc i y En1.3. S t rep tococc i y En terococci fecales.terococci fecales. Estos microorganismos gram-negativos son

usados como indicadores microbiológicos de agua. Como el grupo de coliformes, han sido persistente patrones patógenicidad en aguas. Particularmente enterococci como Streptococcus faecalis y S. Faecium son específicos del intestino humano.

2. Métodos generales de Anál is is . 2. Métodos generales de Anál is is .

2.1. Técnica del número más probables 2.1. Técnica del número más probables NMP.NMP.

Este método esta basado en la fermentación de lactosa por parte de Enterobactericeae. El modo de operación de la técnica consiste en inocular una muestra de agua (en diluciones seriadas) en caldo de cultivo para observar la fermentación de lactosa. Posterior a la inoculación, el aspecto del caldo de cultivo es modificado por la acción de las coliformes fecales, con lo cual su presencia es confirmada. La estimación de la densidad bacteriana se basa en la comparación con tablas pre-establecidas, el número de microorganismos coliformes que se encuentran en una muestra (de agua, tejido o alimento), la cual se puede como indicador microbiológico de calidad o como criterio microbiológico para aceptar o rechazar un alimento muestreado. La precisión de cada test depende del número de tubos usados.

2 .1 .1 . P roced im ien to .2 .1 .1 . P roced im ien to . 2 .1 .1 .1 . Co l i f o rmes P re sun t i va s o Fase 2 .1 .1 .1 . Co l i f o rmes P re sun t i va s o Fase P re sun t i va .P re sun t i va .

Inoculación de tres tubos de caldo lauril sulfato triptona (LST) “doble-concentración” con un volumen de 10 ml de la muestra de ensayo si el producto es líquido, o con un volumen de 10 ml


de un homogenizado en el caso de que muestra sea sólida, por ejemplo, tejido de moluscos.

Inoculación de tres tubos de caldo LST “simple-concentración” con un volumen de 1 ml de la muestra de ensayo, o con un volumen de 1 ml de un homogenizado en el caso de que la muestra sea sólida. Luego, bajo las mismas condiciones, inoculación de tres tubos de caldo LST “simple-concentración” con la dilución 10-1 de la muestra de ensayo o de la suspensión inicial. Todos los tubos presentan en su interior una campana de fermentación Durham. Se puede preparar diluciones mayores si se sospecha una alta carga bacteriana en la muestra (por ejemplo, aguas servidas) y cada muestra analizada es sembrada en duplicado, para obtener una confianza mayor en los resultados finales de recuento de coliformes fecales. Todos los tubos son puestos en incubadora a una temperatura constante de 35±0,5ºC durante 48 horas. Los resultados positivos de esta etapa se expresan como tubos con producción de gas, el cual queda atrapado en el interior de la campana de Durham, entre los tubos de una misma dilución. Los resultados se expresan, a modo de ejemplo, de la siguiente manera:

Dilución Tubos con gas 10-1 3 10-2 3 10-3 2

Con estos resultados se procede estimar la

densidad bacteriana desde la tabla 3 usando el número de tubos positivos (con producción de gas) en las diluciones múltiples. En nuestro ejemplo los tubos con reacción positiva son 3 (para la dilución 10-1), 3 (para la dilución 10-2) y 2 (dilución 10-3); en consecuencia, según la tabla 3, nuestro NMP de coliformes presuntivas es de 24/100 ml de muestra.

Tabla 3. Extracto de la tabla para el cálculo de

NMP por 100 ml con series de cinco tubos con dilución de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. Fuente:

Proyecto de Norma en consulta publica NCh2635.c2001.

N° de tubos positivos

NMP N° de tubos positivos

NMP N° de tubos positivos

NMP

3.3.0 17 4.3.0 27 5.3.0 79 3.3.1 21 4.3.1 33 5.3.1 110 3.3.2 24 4.3.2 39 5.3.2 140 3.3.3 28 4.3.3 45 5.3.3 180 3.3.4 31 4.3.4 52 5.3.4 210 3.3.5 35 4.3.5 59 5.3.5 250

2.1.1.2. Col i formes Conf i rmat ivas o Fase 2.1.1.2. Col i formes Conf i rmat ivas o Fase Con f i rma t i va .Con f i rma t i va .

Esta etapa tiene por finalidad conocer el número de coliformes fecales presentes en la muestra. De los tubos de cada dilución que presentaron formación de gas en la etapa anterior, se debe agitar los tubos presuntivos positivos y transferir con asa metálica el inóculo a tubos con caldo lactosa verde bilis brillante 2% (LBVB) para confirmar coliformes totales y a caldo EC para confirmar coliformes fecales.

Cada tubo con LBVB es cuidadosamente identificado con la dilución de la cual fue extraída la alícuota. Todos los tubos son puestos en incubadora a una temperatura constante de 35±0,5ºC durante 24 horas. Como control positivo se usa Enterobacter aerogenes y como control negativo se usa Staphylococcus aureus. Pasado el tiempo de incubación se procede a contabilizar los tubos con producción de gas (reacción positiva) en cada dilución.

Para determinar coliformes fecales los tubos con caldo EC deben ser incubados a 44,5±0,2 °C en un baño termorregulado por 24±2 horas. Como control positivo se usa Escherichia coli y como control negativo se usa Enterobacter aerogenes. Luego de la incubación se observa la formación de gas en las campanas Durham y se registra el número de tubos positivos, cualquiera que sea la cantidad de gas producida en el tubo.

Luego, con el número de tubos con reacción positiva obtenido para coliformes totales y coliformes fecales se procede a ir a la tabla 4, anteriormente usada. La forma de obtener el NMP es idéntica a la descrita en la primera etapa, pero esta vez el resultado se expresa como


coliformes totales y coliformes fecales por cada 100 ml de muestra.

2.2. Recuento de coliformes totales y fecales 2.2. Recuento de coliformes totales y fecales en p laca.en p laca. 2.2.1. Recuento en Agar ENDO2.2.1. Recuento en Agar ENDO-- C de MerckC de Merck

Medio de cultivo selectivo para la demostración y aislamiento de E. coli fecal y Coliformes en los más diversos materiales (agua, alimentos, etc.). Formula típica (gramo/litro):Formula típica (gramo/litro): peptona (10) fosfato

di-potásico (2,5), lactosa (10) , sulfito sódico (2,5) fucsina (0,3)* y agar bacteriológico (12,5). PH 7,4±0,2. Almacenamiento a 15-25°C.

P repa rac ión :P repa rac ión : Disolver 39 gramos en 1 litro de agua destilada o des-ionizada, esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121°C y verter en las placas. Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarse dicho exceso de rojo añadiendo algunas gotas (hasta 1ml/litro, como máximo) de una solución recién preparada al 10% de sulfito sódico anhidro e hirviendo el conjunto a continuación. Por la acción del oxígeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible. Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, sólo es utilizable durante pocos días.

Modo de acc ión : Modo de acc ión : El sulfito sódico y la fucsina inhiben a las bacterias gram-positivas. E. coli y Coliformes consumen la lactosa formando aldehído y ácido. Por otra parte, el aldehído libera fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. coli, esta reacción es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina cristalizada)

Emp leo e i n tEmp leo e i n t erpretación: erpretación: sembrar las placas en estría o placa extendida, por agotamiento. Incubación 24 horas a 37.5°C.

COLONIAS ESPECIE Rojas Lactosa-positivos Rojas con brillo metálico estable

Escherichia coli

Rojas hasta rojizas Enterobacter aerogenes Esféricas, mucosas Klebsiella y otros Incoloras, claras Lactosa-negativos

2.2.2. Recuento en agar McConkey de Merck2.2.2. Recuento en agar McConkey de Merck

Agar selectivo para el aislamiento de Salmonellas, Shigellas y bacterias coliformes, a partir de heces, orina, alimentos, aguas residuales etc.

Formula típica (gramo/litro):Formula típica (gramo/litro): peptona de caseína

(17), peptona de carne (3), cloruro de sódio (5), lactosa (10), mezcla de sales biliares (1,5), rojo neutro (0,03), cristal violeta (0,001) y agar bacteriológico (13,5).

P repa rac ión : P repa rac ión : Disolver 50 gramos en un litro de agua destilada o des-ionizada, esterilizar en autoclave (15 min. a 121°C) y verter las placas. Los medios de cultivo son claros y de color rojo parduzco.

Fo rma de ac tuac ión : Fo rma de ac tuac ión : las sales biliares y el cristal violeta inhiben considerablemente la flora gram-positiva. La lactosa, junto con el indicador de pH rojo neutro, sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar.

Empleo e interpretación: Empleo e interpretación: sembrar las placas por el procedimiento de estría o placa extendida. Incubación 18-24 horas a 37,5°C. Las colonias lactosa-negativas son incoloras y las lactosas-positivas son rojas con un halo turbio debido al descenso del pH provocado por los ácidos biliares.

COLONIAS ESPECIE Incoloras y transparentes Salmonella, Shigella y otros Grandes, rojas, halo turbio Escherichia coli Grandes, rosadas, mucosas Enterobacter, Klebsiella Diminutas, de crecimiento aislado, opacas

Enterococos, Estafilococos y otros


2.2.3. Recuento Medio Cromogénico (CM956B) 2.2.3. Recuento Medio Cromogénico (CM956B) de Oxo id .de Oxo id .

El medio cromogénico es un medio diferencial para la identificación tanto de E. coli como coliformes totales a partir de un solo medio, para muestras de alimentos y aguas. El medio cromogénico está constituido por un agar base, más dos sustratos (agentes cromogénicos) que son capaces de identificar una enzima que es altamente específica tanto para E.coli (â-glucoronidasa) como para los coliformes totales (â-galactosidasa). De esta manera las colonias de E. coli se observan de un color púrpura y las de coliformes totales de un color rosado. Formula t ípica (gramo/l i t ro):Formula t ípica (gramo/l i t ro): mix cromogénico (20,3), extracto de Levadura (3), peptona (5), lactosa (2,5), cloruro de sodio (5), di-sodio hidrógeno fosfato (3,5), potasio-dihidrógeno fosfato (1,5), rojo Neutro (0,03) y agar bacteriológico (15). PP repa rac ión : r epa rac ión : suspender 55,8 gramo en 1 litro de agua destilada o des-ionizada. Esterilizar en autoclave a 121°C por 15 minutos y verter en placas. Emp leo :Emp leo : Preparar las diluciones adecuadas (10-1, 10-2, 10-3) con agua peptonada tamponada. Sembrar en placa extendida e incubar por 18-24 horas a 37.5°C


LITERATURA CITADALITERATURA CITADA AUSTIN B (1988) Marine Microbiology. Cambridge University Press. 221 pp. AUSTIN B & DA Austin (1989) Methods for the Microbiological Examination of Fish and Shellfish.

Ellis Horwood Ltd. 317 pp. EATON, Clesceri & Greenberg (1995) Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater GERHARDT P, RGE Murray, WA Wood & NR Krieg (1994) Methods for General and Molecular

Bacteriology. American Society for Microbiology. 791 pp. HOLT JG, NR Krieg, PHA Sneath, JT Staley & ST Williams (1994) Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology, Ninth edition. Williams & Wilkins. 787 pp. HURST CJ, GR Knudsen, MJ McInerney, LD Stetzenbach & MV Walter (1997) Manual of

Environmental Microbiology. American Society ofr Microbiology. 893 pp. MADIGAN MT, JM Martinko & J Parker (1997) Brock Biology of Microorganisms. Eighth edition.

Prentice Hall Inc. 987 pp. SEELEY HW, PJ Vandemark & JJ Lee (1991) Microbes in Action. A laboratory manual of microbiology.

Fourth edition. WH Freeman and Company. 450 pp. STAINER RY, JL Ingraham, ML Wheelis & PR Painter (1990) General Microbiology. Fifth edition.

Macmillan Education Ltd. 689 pp.

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Edi tor ia les Cient í f icas.Edi tor ia les Cient í f icas. - American Society for Microbiology http://www.journals.asm.org/ - FEMS The Federation of European Microbiological Societies http://www.fems-microbiology.org/ - Society for General Microbiology http://www.sgmjournals.org - Asociación Chilena de Microbiología http://158.170.16.193/ACHM/

Otros s i t ios de in terés en In ternet .Otros s i t ios de in terés en In ternet . - Colección de especies bacterianas -American Type Culture Collection http://www.atcc.org/ - Biblioteca online – Microbe Library of American Society for Microbiology http://www.microbelibrary.org/

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