INFORME ANEXO DEL PROYECTO SIP 20060438

RESUMEN

El hongo Rhizopus stolonifer, agente causal de la pudrición blanda, penetra a los frutos

a través de heridas, multiplicándose con una rápida velocidad de crecimiento y

desarrollándose en una amplia gama de temperaturas y humedades. Con el desarrollo

del proyecto hemos demostrado una mayor actividad enzimática de poligalacturonasa y

pectin metil esterasas en frutos de jitomate infectados con Rhizopus stolonifer

comparados con frutos control. También hemos encontrado que la adición de diferentes

concentraciones de quitosano inhiben el crecimiento de R. stolonifer. Los mecanismos

de acción por los cuales el quitosano presenta este efecto antifúngico no han sido del

todo establecidos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del quitosano sobre la

membrana celular de R. stolonifer. Se inocularon cultivos de papa-dextrosa a una

concentración de 1 X 105 esporas/mL de R. stolonifer, después se adicionó quitosano a

una concentración de 0.5, 1 y 2 mg/mL. Los matraces se incubaron a temperatura

ambiente a 200 rpm y se extrajeron después de 24, 48 y 72 horas, a partir de estas

condiciones se realizaron las siguientes determinaciones: Cinéticas de crecimiento,

morfológica microscópica, evaluación de pH, determinación de K y actividad

enzimática de la H+ATPasa. En los medios de cultivo donde se creció R. stolonifer en

presencia de quitosano en general se observó una afectación en el peso húmedo del

micelio, deformaciones del micelio, incremento del pH del medio, salida de potasio y

decremento en la actividad específica de la H+ATPasa. Estos resultados indican que el

quitosano afecta el funcionamiento de la membrana celular de R. stolonifer.

INTRODUCCIÓN

Los productos vegetales son importantes en la dieta humana; sin embargo, son

susceptibles a plagas y enfermedades. Los hongos fitopatógenos generan pérdidas

económicas y frecuentemente se controlan con compuestos antifúngicos sintéticos, los

cuales pueden presentar un efecto negativo en la biosfera y provocar el desarrollo de

cepas fúngicas resistentes. Actualmente se buscan alternativas ecológicas para el control

de plagas y enfermedades.

El hongo Rhizopus stolonifer, agente causal de la pudrición blanda, penetra a los frutos

a través de heridas, multiplicándose con una rápida velocidad de crecimiento y

desarrollándose en una amplia gama de temperaturas y humedades. Estas características

le facilitan colonizar rápidamente a su hospedero, tan solo 4 días han sido suficientes

para pudrir totalmente los frutos. Durante el proceso de pudrición blanda las hifas

producidas por el hongo secretan enzimas pectinolíticas que degradan las sustancias

pécticas presentes en la lámina media y en la pared celular primaria vegetal provocando

la pérdida de cohesión en los tejidos celulares y facilitando la excreción de los líquidos

presentes en el interior de la célula (maceración celular). Hemos demostrado una mayor

actividad enzimática de poligalacturonasa (Villanueva-Castillo, 2004) y pectin metil

esterasas (Vicente-López, 2004) en frutos de jitomate infectados con R. stolonifer

comparados con frutos control.

Por otro lado, existen reportes que señalan reducciones significativas de algunas

pudriciones postcosecha cuando los frutos fueron tratados con quitosano, por lo que se

considera a este polisacárido como una alternativa natural para controlar a estas

enfermedades y mantener la vida de anaquel de productos hortofrutícolas (Bautista-

Baños y col. 2006). También hemos encontrado in vitro que la adición de diferentes

concentraciones de quitosano inhiben el crecimiento micelial, la esporulación y la

morfología de las esporas de R. stolonifer. La respuesta in situ evidenció el potencial

antifúngico del quitosano en el control de las pudriciones postcosecha causadas por este

hongo fitopatógeno (Hernández-Lauzardo y col. 2006).

El quitosano esta constituido por unidades de glucosamina, es biodegradable y no tóxico

y se obtiene por desacetilación de la quitina (cutícula de crustáceos, exoesqueleto de

artrópodos, paredes celulares de hongos. Se considera que la naturaleza policatiónica

del quitosano es fundamental para que este compuesto presente actividad antifúngica.

Los mecanismos de acción por los cuales el quitosano presenta este efecto antifúngico

no han sido del todo establecidos, aunque existen algunas propuestas al respecto. Una

de éstas plantea que las cargas positivas del quitosano pueden interaccionar con las

cargas negativas de los esfingolípidos de la membrana celular del hongo (Zakrzewska y

col. 2005). Los mismos autores comentan que los esfingolípidos de la membrana celular

de los mamíferos no poseen carga negativa lo que podría explicar el porque son poco

sensibles al polisacárido. La interacción específica del quitosano con la membrana

celular puede generar una modificación de la permeabilidad de la misma permitiendo el

flujo de diferentes compuestos y iones entre ellos el potasio (K+) y también podría

afectar la actividad de enzimas membranales principalmente la H+ATPasa, enzima

fundamental de la membrana celular que puede constituir hasta el 10% de la proteína de

la membrana plasmática de hongos y consumir hasta el 25% de ATP para el transporte

activo de compuestos indispensables para el metabolismo celular, lo que podría afectar

significativamente el desarrollo del microorganismo. Los trabajos antes citados han sido

realizados fundamentalmente con levaduras. No existen antecedentes en hongos

filamentosos.

Por lo anterior y considerando la importancia que tiene el quitosano como alternativa

natural en el control de hongos postcosecha se propuso el presente proyecto de

investigación con el objetivo de evaluar el efecto del quitosano sobre la membrana

celular del hongo filamentoso Rhizopus stolonifer. Este trabajo puede contribuir a

generar conocimiento básico que permita la mejor comprensión del modo de acción del

quitosano lo cual repercuta de manera positiva en optimizar el uso de este compuesto

para controlar enfermedades poscosecha. Nuestra hipótesis considera que la aplicación

de quitosano a Rhizopus stolonifer afectará su crecimiento, morfología y el

funcionamiento de los procesos de transporte de la membrana celular del hongo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico.

Se utilizó la cepa R3 de Rhizopus stolonifer del cepario de hongos fitopatógenos del

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del IPN, el cual es resembrado y purificado

constantemente. Esta cepa fue aislada de tomates (Lycopersicon esculentum Mill.)

infectados naturalmente y cosechados en el municipio de Yautepec, Morelos.

Estrategia experimental.

Se cultivó R. stolonifer en cajas petri de PDA (papa-dextrosa-agar), posteriormente se

llevó a una cámara de incubación a una temperatura de 27°C durante 72 hrs., a

continuación se tomaron las cajas y se lavaron con agua estéril para obtener las esporas

separadas del micelio. Se tomaron dos gotas de la solución de esporas y mediante el uso

de una cámara de Neubauer se procedió al conteo de esporas, el numero total de esporas

se multiplico por el factor de conversión de 50,000 para obtener como resultado la

concentración de esporas/mL de la solución original, esta suspensión se llevo a una

concentración final de 1 X 105 esporas/mL.

Por otro lado se prepararon cultivos líquidos de PD (papa-dextrosa) y a continuación se

agregó quitosano a una concentración de 0.05, 0.1 y 0.2% (0.5, 1 y 2 mg/mL). Se

inoculó 0.5 mL de la concentración final de esporas a cada matraz.

Una vez inoculados los matraces se incubaron a temperatura ambiente con agitación

constante de 200 revoluciones por minuto. Después de 24, 48 y 72 horas., se extrajeron

los matraces y a partir de estas condiciones se realizaron las siguientes determinaciones:

Cinéticas de crecimiento.

Se cuantificó el crecimiento del hongo evaluando gravimétricamente el peso húmedo

del micelio crecido a las 24, 48 y 72 horas.

Determinación de la morfológica microscópica.

La caracterización morfológica del micelio y las esporas de la cepa R3 de R. stolonifer

se realizó de acuerdo a lo señalado por Hernández-Lauzardo en 2006 y adicionalmente

se realizaron tinciones con el fluorocromo piranina según la técnica descrita por

Enríquez-Freire y col. (1999) y Thevissen y col. (1999).

Evaluación de pH.

Se determinó el valor de pH para cada condición directamente en el medio de cultivo

mediante un electrodo convencional.

Determinación de K+.

Se realizó utilizando un electrodo específico que determina la concentración de iones

potasio y se evaluaron las concentraciones de K+ en el medio de acuerdo a lo descrito

por Enríquez-Freire y col. (1999).

Establecimiento de la actividad H+ATPasa en la membrana celular de R. stolonifer.

Obtención de la membrana celular.- Los micelios obtenidos de las condiciones de

cultivo en presencia y ausencia de quitosano fueron centrifugados a 4000 rpm durante

10 min., a 4 ºC. Después se lavaron dos veces con agua destilada. Una vez obtenida la

biomasa se resuspendió en un amortiguador de rompimiento (Hepes 50 mM a un pH

6.8). La ruptura se realizó utilizando perlas de vidrio en una relación de 75g de perlas

por 50 mL de amortiguador, se agitó con un vortex durante 10 ciclos de un minuto por

uno de descanso. El producto homogenizado se filtró a través de una gasa y se procesó

por centrifugación diferencial, la fracción microsomal se obtuvo después de centrifugar

a 100000 G, se extrajeron las membranas totales y se resuspendieron en 1 mL de

amortiguador de Hepes 50mM a pH 7.5 conteniendo 300 mM de sacarosa y se

almacenó a -70ºC.

Purificación de las membranas.- Se utilizó un gradiente de 2 fases compuesto por

dextran T 500 7% y polietilénglicol al 7% en el regulador de rompimiento a pH 6.8. La

fracción microsomal se ajustó a una concentración de 10 mg/mL en un volumen final de

3 mL Los gradientes se centrifugaron a 4000 G durante 10 min. a 4ºC. y se recuperó la

fase superior del gradiente que contenía la fracción de las membranas celulares.

Actividad de la H+ATPasa.- Se realizó de acuerdo a lo descrito por Valdez-Solana y col.

2005. La fracción enzimática se sometió a una solución de sulfato de amonio que

contenía ATP y piruvato cinasa. El ensayo se realizó a 30°C durante 30 min. y se

terminó con la adición de 10 µL de ácido tricloroacético al 30%. Para la cuantificación

de proteína se utilizó el método de Lowry modificado. La actividad enzimática se

realizó midiendo el fosfato inorgánico (Pi) producido por la reacción de la H+ATPasa

(ATP ADP + Pi) en el que el Pi del medio reacciona con molibdato de amonio

formando el complejo fosfomolibdato de amonio, el cual se reduce por el compuesto

ELON (1- amino- 2 naftol- 4 sulfónico) produciendo un complejo azul de molibdeno

que absorbe a 660 nm y los valores se analizaron utilizando el programa Sigma Plot

RESULTADOS

Cinéticas de crecimiento

En la figura 1 se presentan los resultados de la cinética de crecimiento de R. stolonifer

en ausencia y presencia de quitosano de bajo peso molecular. Se observa dentro de las

primeras 48 horas que la presencia de quitosano afecta el crecimiento micelial del

hongo, este efecto tiende a disminuir e incluso a desaparecer a las 72 horas. Estos

resultados son acordes al efecto antifúngico del quitosano reportado por Bautista-Baños

y col. en 2006.

PESO HUMEDO

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

20 30 40 50 60 70 80

TIEMPO (hrs)

MA

SA (m

g) S/Q0.5 mg/mL1 mg/mL2 mg/mL

Figura 1. Cuantificación del peso húmedo del micelio de Rhizopus stolonifer crecido en

el medio de papa-dextrosa en ausencia y en presencia de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano

durante 72 horas.

Determinación de la morfológica microscópica.

En general las observaciones microscópicas de R. stolonifer crecido con diferentes

concentraciones de quitosano (0.5, 1 y 2 mg/mL), revelaron que afecta la morfología de

la hifa, observándose mayores deformaciones (ramificaciones y engrosamientos) en los

hongos tratados con quitosano como se observa en la figura 2. Este efecto del quitosano

ha sido reportado en otros hongos fitopatógenos (El Ghaouth y col. 1992).

Figura 2. Micelio de Rhizopus stolonifer tratado con 0.5 mg/mL de quitosano, teñido

con piranina y observado en un microscopio de fluorescencia (40 X).

Evaluación de pH

En la figura 3 se observa claramente el efecto de las diferentes dosis de quitosano sobre

el pH del medio de cultivo donde crece R. stolonifer. El control sin inocular y sin

quitosano no presenta cambios de su pH (5.5). R. stolonifer sin quitosano acidifica el

medio de 5.5 a 4.5 en 72 horas. En todos los tratamientos adicionados de quitosano se

observa un incremento en el pH de 5.5 hasta 7.0. El quitosano induce en R. stolonifer el

incremento en el pH del medio de cultivo. Estos resultados resultan novedosos y hasta

ahora no encontramos ningún reporte previo en la literatura.

Nivel del pH del medio

4

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

0 10 20 30 40 50 60 70

Tiempo (h)

pH

S/Q

0.5mg/mL

1mg/mL

2mg/mL

Control

Figura 3. Evaluación del pH del medio de cultivo donde crece Rhizopus stolonifer

tratado con concentraciones de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano.

Determinación de K+

En la figura 4 se observa la respuesta de R. stolonifer tratado con quitosano. El control

sin tratar se mantiene durante 6 minutos en el nivel basal de -165 mV, mientras que en

los tres tratamientos con quitosano se observa un cambio de potencial hasta alcanzar en

el tratamiento con 1 mg/mL -145 mV en 6 minutos. Estos datos nos indican una rápida

salida de K+ del micelio de R. stolonifer tratado con quitosano. En este modelo de

estudio, estos resultados no tienen precedentes.

igura 4. Determinación de salida de K+ de Rhizopus stolonifer tratado con

Salida de potasio

-175

-170

-165

-160

-155

-150

-145

-140

0 1 2 3 4 5 6 7Tiempo (min)

Pot

enci

al (m

V)

Control

0.5mg/mL

1mg/mL

2mg/mL

F

concentraciones de 0.5, 1 y 2 mg/mL de quitosano.

Establecimiento de la actividad H+ATPasa en la membrana celular de R. stolonifer

Cuadro 1. Actividad enzimática total y específica de H+ATPasa de la membrana celular

de Rhizopus stolonifer crecido en medio de papa-dextrosa en ausencia y presencia de

quitosano.

Medio de cultivo Actividad enzimática total

de H+ATPasa (nmol/min.)

Actividad específica de

H+ATPasa (nmol/mg/min.)

Sin quitosano 7.3 122

Con quitosano (1 mg/mL) 7.7 82

En el cuadro 1 se observa que la actividad enzimática total de H+ATPasa de la

membrana de R. stolonifer no es afectada por el quitosano; sin embargo, resulta

evidente la afectación que causa el quitosano en la actividad específica de la H+ATPasa

al causar una disminución de 122 a 82 nmoles/mg/min. Este efecto negativo del

quitosano sobre la H+ATPasa de algún hongo fitopatógeno no ha sido reportado.

En general podemos concluir que el quitosano afecta el crecimiento de R. stolonifer

genera deformaciones en el micelio, induce un incremento en el pH del medio de

cultivo, provoca la salida de K+ y afecta negativamente la actividad específica de la

H+ATPasa. Estos resultados indican que el quitosano afecta el funcionamiento de la

membrana celular de R. stolonifer.

IMPACTO

Los resultados obtenidos en este proyecto de investigación indican que el quitosano

afecta el crecimiento, morfología y el funcionamiento de los procesos de transporte de

la membrana celular de R. stolonifer. Los resultados que muestran afectación en los

procesos de transporte del hongo no tienen precedentes por lo que estamos

contribuyendo en el esclarecimiento de los mecanismos de acción de este polímero que

tiene un gran potencial como alternativa natural en el control de hongos postcosecha en

productos hortofrutícolas. Por lo anterior, consideramos que nuestro proyecto tiene

impacto en los sectores académico y productivo de bienes y servicios. Finalmente, con

este proyecto estamos participando en la formación de recursos humanos altamente

calificados.

LITERATURA CITADA

Bautista-Baños S., Hernández-Lauzardo A. N., Velázquez-del Valle M. G., Hernández-

López M., Ait-Barka E., Bosquez-Molina E., Wilson C. L. 2006. Chitosan as a

potencial natural compound to control pre and postharvest diseases of horticultural

commodities. Crop Protection 25: 108- 118.

El Ghaouth A., Arul J., Grenier J. y Asselin A. 1992. Antifungal activity of chitosan on

two postharvest pathogens of strawberry fruits. Phytopathology 82: 398-402.

Enríquez-Freire E., López R. y Peña A. 1999. Potassium ion efflux induced by cationic

compound in yeast. Biochimica et Biophysica Acta 1418: 147-157.

Hernandez-Lauzardo A. N., Hernández-Martínez M., Velázquez-del Valle, M. G.,

Guerra-Sánchez M. G. y Melo-Giorgana G. E. 2006. Actividad actifúngica del

quitosano en el control de los hongos fitopatógenos Rhizopus stolonifer Ehrenb. (Ex Fr.)

Vuill. y Mucor spp. Revista Mexicana de Fitopatología (enviado).

Hernandez-Lauzardo A. N., Bautista-Baños S., Velázquez-del Valle, M. G. y Trejo-

Espino J. L. 2006. Identification of Rhizopus stolonifer Ehrenb. (Ex Fr.) Vuill., causal

agent of Rhizopus rot disease of fruits and vegetables. Revista Mexicana de

Fitopatología 24 (1): 65-69.

Thevissen K., Terras F. y Broekaert W. 1999. Permeabilization of fungal growth. Applied and Environmental Microbiology 65: 5451-5458.

Valdez-Solana M., Guerra G., Pardo J., Villa-Tanaca L. y Amora-Lazcano E. 2005.

Caracterización bioquímica de la H+ATPasa de membrana plasmática de Ustilago

maydis en la forma micelial en condiciones de estrés nutricional. Memorias del XIV

congreso de bioenergética y biomembranas. Sociedad mexicana de bioquímica. México,

Oaxaca.

Vicente-López, M. L. 2004. Estudio de las pectin metil esterasas fúngicas causantes de

la pudrición blanda en el fruto de jitomate (Lycopersicon esculentum, Mill.). Tesis de

Licenciatura. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Veracruzana. Orizaba,

Veracruz.

Villanueva-Castillo, B. 2004. Determinación de la actividad enzimática de PG en el

proceso de maceración causado por Rhizoupus stolonifer en jitomate (Lycopersicon

esculentum, Mill). Tesis de Licenciatura. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad

Veracruzana. Orizaba, Veracruz.

Zakrzewska A., Boorsma A., Brul S., Klaas J., H. y Klis F. M. 2005. Transcriptional

response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound

chitosan. Eukariotic Cell 4 : 703-715.