OBJETIVOS • Se familiarizara al estudiante con el buen manejo y funcionamiento del microscopio. • Asumirá responsablemente el buen trato y cuidado del microscopio. • Conocerá las partes del microscopio y la función de cada una de ellas. • Adquirirá habilidades en el uso y manejo del microscopio compuesto. • Conocerá y aprenderá a manejar correctamente los demás elementos con los que se trabaja en el

microscopio. MATERIALES • Microscopios. MARCO TEÓRICO HISTORIA El uso de las lupas se remonta a la civilización Asiria. En las ruinas de NINIVE fueron hallados cristales de roca tallados en forma de lentes piano convexa. Los romanos conocían el poder de amplificación de la lente biconvexa. Cuenta Seneca y Plinio que Nerón observaba los combates de los gladiadores a través de una esmeralda tallada, se creen eran utilizadas para corregir la miopía. Los médicos griegos y romanos estudiaban los tejidos enfermos por medio de una bala de vidrio llena de agua para amplificar las imágenes. En el siglo XIII se interpretaron las propiedades de los lentes biconvexos. En el siglo XVII se construyeron varios microscopios pero estos resultaron muy inexactos en sus dimensiones. Un italiano Campani construyo a finales del siglo XVIII un microscopio que hizo posible las observaciones transparentes. Robert Hooke, mediante estudios mas avanzados y basándose en la fabricación de un microscopio rudimentario fabricado a partir de lentes por Anton Van Leeuwenhoek,hizo posible el establecimiento de la microscopia como ciencia. MICROSCOPIO DEFINICIÓN MIKROS: pequeño. SKPECO: Observar. Definido por Jean Faber en 1624. Instrumento óptico que hace visible objetos de tamaño minúsculo; existen varias clases de microscopios desde los mas simples como la lupa, pasando por los microscopios compuestos, hasta llegar a los mas complejos y además sofisticados, como son el microscopio electrónico. Nos ocuparemos del estudio del microscopio óptico compuesto, que puede ser eléctrico o de espejo, y a su vez monocular o binocular. PARTES Todos los microscopios tienen las mismas partes con funciones análogas en cada uno, sus partes están divididas en tres principales:

PRÁCTICA N°4 MICROSCOPÍA ÓPTICA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO

PARTE MECÁNICA v SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. D PLATINA: Lugar donde

se deposita la preparación. v CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, v REVOLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. v TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el

enfoque correcto. PARTE ÓPTICA Se deben distinguir dos sistemas: el objetivo y el ocular. 1. OBJETIVOS: Son sistemas de lentes contenidos dentro de cilindros metálicos incorporados al revolver, consta de dos lentes: la lente cercana a la preparación se llama lente frontal y la localizada en la parte superior se llama lente posterior. La denominación de objetivos se efectúa indicando su aumento propio, el cual se halla gravado en cada pieza. Son objetivos secos (su empleo no requiere el uso de aceite de inmersión) de pequeño aumento: 6X, 8X, 10X y de gran aumento: 40X, 45X, y SOX. El objetivo que requiere el uso de aceite de inmersión es el de 100X, este tiene mayor poder de resolución, El poder de resolución esta condicionado por la abertura numérica (AN). El objetivo de inmersión tiene una distancia focal muy corta y una AN muy limitada. Actúa a una distancia de solo uno a dos milímetro del objetivo. Debido a su estrecha AN se hace necesario una potente iluminación. Cuando los rayos luminosos emergen de la cara superior del condensador algunos son refractados mas allá del alcance del objetivo y se pierden, especialmente los periféricos. Para evitar una parte de la perdida de esos rayos luminosos se coloca un liquido transparente

incoloro, con el mismo índice de refracción del vidrio (aceite de inmersión) entre el objeto y el objetivo con lo cual se aumenta la AN, debido a que recoge mayor cantidad de rayos luminosos. La posición correcta del objetivo se conoce por el tope y el sonido que se siente al alcanzarse la misma. No afloje ni retire los objetivos del microscopio, no toque las lentes de los objetivos, si cree que están sucios y para limpiarlos utilice papel para lentes. El único objetivo con el cual se observan preparaciones con cubreobjetos en el de 40X. El único objetivo que requiere el uso de aceite de inmersión es el de 100X. AUMENTO El poder de aumento de cada objetivo se indica por un número grabado en la manga de la lente. El objetivo 10X aumenta 10 veces; el objetivo 40X aumenta 40 veces; el objetivo 100X aumenta 100 veces. LA ABERTURA NUMERICA (AN) La abertura numérica también se halla grabada en la manga de la lente, junto a la indicación del poder de aumento: 0.3 en el objetivo de 10X, 0.65 en el objetivo de 40X, 1.3 en el objetivo de 100X. A medida que se aumenta la AN es mayor el poder de resolución. EL AUMENTO TOTAL DEL MICROSCOPIO ES IGUAL AL PRODUCTO DEL AUMENTO DEL OCULAR POR EL AUMENTO DEL OBJETIVO. Ej.: tenemos un ocular 16X y un objetivo 40X, el aumento total esta dado por el producto de 16x40esdecir: 640. 2. OCULARES: Son sistemas de lentes cilíndricos intercambiables situados en la parte superior del microscopio, a los que el observador acerca sus ojos para mirar la muestra o preparación. El papel de los oculares consiste en aumentar a manera de lupa, la imagen real proyectada por el objetivo. La distancia entre los oculares puede ajustarse manualmente para igualarla a la distancia que separa las pupilas del observador. Posee 2 lentes: la que queda cerca del ojo se llama OCULAR, la que queda en el extremo inferior se llama COLECTORA. El poder de aumento del Ocular se encuentra marcado en el: un ocular 4X aumenta 4 veces, un ocular 6X aumenta 6 veces. PARTE DE ILUMINACION: El sistema de iluminación consta de las siguientes partes: 1. Condensador: conjunto formado por el condensador del abertura y el de campo. El condensador de apertura es un sistema de lentes convergentes localizado bajo la platina, entre la fuente de luz y la platina, cuya función es concentrar la luz al centra de la platina y por tanto hacia la muestra que observa, posee una cremallera o mecanismo que sirve para acercar o alejar a la muestra, alejando o disminuyendo la luz sobre ella. El condensador de campo se sitúa en la base del microscopio y dirige la luz hacia el condensador de apertura. 2. Diafragma: mecanismo de cierre concéntrico de diámetro variable que regula la luz que pasa a través del condensador de apertura hacia la muestra a través del orificio de la platina. Esta formado por un conjunto de laminas falciformes, las cuales por medio de una palanca lateral se pueden cerrar concéntricamente variando el haz de rayos luminosos. El movimiento de la palanca debe ser lento y en sentido horizontal, sin forzar la palanca hacia arriba o hacia abajo par evitar el daño del dispositivo. El diafragma se estrecha en preparaciones no coloreadas para aumentar la profundidad de enfoque, en tanto que las preparaciones coloreadas que absorben luz, tienen que dilatarse. Usualmente los rayos luminosos emergen de la cara superior del condensador como un cono de luz con el vértice hacia abajo. Los rayos no muy divergentes pasan a través del objetivo y cuanto mas amplio es el alcance de la AN mas amplio es el ángulo que puede investigarse, pues mayor es el número de rayos divergentes que puede recoger. 3. FILTRO: Disco vidrio mate o coloreado localizado entre el diafragma y el condensador de campo. 4. ESPEJO: Por medio de el dirige la luz hacia el microscopio. Lo poseen los microscopios no eléctricos en lugar del bombillo. Hay un espejo piano y otro cóncavo, ambos reunidos en una montura común. Estos giran al rededor de 2 ejes perpendiculares de modo que así es posible dar la iluminación adecuada. El espejo cóncavo se utiliza cuando se necesita menor iluminación (con lentes de 10 a 40) y el espejo piano para mayor iluminación. El espejo se reemplaza por luz incorporada, es decir, un bombillo que da al microscopio directamente los rayos luminosos en los microscopios eléctricos.

5. LÁMPARA O BOMBILLO: Es la fuente de rayos luminosos. Tiene que ser de óptima intensidad (mas o menos de 60-100 voltios) ya que el ojo trabaja menos a niveles de iluminación bastante altos. La iluminación puede ser halógena o de tungsteno. MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el Microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya esta en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora si, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fine. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfoco con el objetivo de inmersión. 6. Empleo del objetivo de inmersión.

a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c. Girar el revolver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre este y el de 40x. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revolver hasta la posición del objetivo de inmersión. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toque la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aún menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revolver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x esta perfectamente limpio.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación,

asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se esta utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se esta utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos

especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasara el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revolver y condensador).

7. El cambio de objetivo se hace girando el revolver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se esta observando a través del ocular.

8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión practica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

UNIDADES DE MEDIDA UTILIZADAS EN MICROSCOPIA SIMPLE Las unidades de medida que utilizara normalmente son el milímetro (mm), el micrómetro (µm) y el nanómetro (nm). EQUIVALENCIAS: 1mm = 1000 µm = 1000000 nm. 1 µm = 0.001 mm = 1000 nm. 1 nm= 0.001 µm = 0.000001 mm. RESPONDA: 1 .Cuantos (µm caben en 1 0 mm?. 2. Cuantas veces es menor 1 µm que 1 mm?. 3. Cuantos µm hay en 0.1 mm? 4. Cuantas veces mayor es 0.674 mm que 1 µm ?. 5. Ordene los organismos A, B y C en forma ascendente según su tamaño: A: 130µm, B: 0006 mm; C: 54000nm. PODERES DEL MICROSCOPIO Estos poderes dependen directamente de las lentes de los objetivos, y son: Amplificación, Resolución, Penetración y Definición. • AMPLIFICACION O AUMENTO: Proporciona una imagen mayor de cualquier objeto de la que se percibe a

simple vista. Si un objeto mide 1 mm de longitud y al observarse al microscopio se ve de 10mm de longitud, ello quiere decir que el poder de aumento es de 10 veces. El aumento esta dado por el producto entre los aumentos proporcionados por el ocular y el objetivo que se utilicen.

• RESOLUCION: Es la capacidad de diferenciar dos puntos que a simple vista parecen solo uno debido a la escasa distancia que los separa. Es la capacidad del microscopio para dar imágenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro y depende de la longitud onda, y de la apertura numérica del objetivo (AN). El límite de resolución se define como la mínima distancia que debe existir entre 2 puntos, para que puedan ser discriminados entre si. El ojo humano solo puede discriminar, dos puntos separados por mas de 0.1 mm. El poder de resolución se da por: R = 2 AN.

Responda: Cual es el poder de resolución de los objetivos 10X y 100X?

• PENETRACION O PROFUNDIDAD DE FOCO: permite observar varios planos con una misma posición de

enfoque del objeto. • DEFINICION: es la capacidad de formar imágenes claras de contornos nítidos. • DIAMETRO DE CAMPO VISUAL: el campo visual es el área circular que se observa al mirar por los oculares.

El diámetro del campo visual se calcula dividiendo el valor del numero de campo que aparece en el ocular por el aumento del objetivo que se esta utilizando, así a mayor aumento del objetivo, el divisor será mayor y por lo tanto el diámetro del campo será menor. En consecuencia, el área real del campo que se observa será igualmente menor.

UTILIZACIÓN DEL OBJETIVO DE INMERSIÓN El objetivo de inmersión (100X) se emplea para la observación de preparaciones o placas permanentes. Para su enfoque: 1. Enfoque con los objetivos de 10X y 40X. 2. Sin desenfocar con el objetivo de 40X, coloque una gota de aceite de inmersión y gire hasta dejar en

posición vertical el objetivo de 10OX, acerque el objetivo a la preparación hasta hacer contacto con el aceite. 3. Empleando el tornillo micrométrico, afine el enfoque, puede desplazar la placa sobre la platina siempre y

cuando la lente del objetivo no pierda contacto con el aceite. Dibuje lo observado con los tres objetivos. 4. limpie y seque suavemente el objetivo de inmersión con papel para lentes.

l

CUESTIONARIO ADICIONAL.

1. Describa el proceso de enfoque en mayor y menor aumento en el microscopio óptico. 2. Escriba el aumento de los objetivos y oculares presentes en el microscopio utilizado en la práctica, y

Calcule el aumento total proporcionado por su microscopio. 3. Defina:

• Abertura numérica • Campo Microscopio • Poder de resolución del Microscopio

4. Cual es la función del aceite, cuando se usa con el objetivo de inmersión? 5. Si se determina que una célula observada con un aumento de 40X tiene un diámetro aparente de 5

mm, Cual será su diámetro aparente si se mira con un aumento de 100X?. 6. Cuantos organismos con un diámetro de 300 µm cabrían en los campos visuales al utilizar los objetivos

de 10X y 40X?.

OBJETIVOS

• Reconocer la importancia de realizar tinciones, para así demostrar la presencia de microorganismos así como la morfología de cualquier célula presente en determinada muestra.

• Preparar una frotis para tinción a partir de cultivos en medio sólido y líquido. • Realizar las técnicas de tinción con: azul de metileno, cristal violeta.

MARCO TEÓRICO Los colorantes simples se emplean para demostrar la presencia de microorganismos así como la morfología de cualquier célula presente en exudados, muestras ambientales, superficies, alimentos, aguas, cultivos axénicos. La tinción puede realizarse con un colorante básico en solución acuosa, aunque ocasionalmente puede añadirse un mordiente, tal como el fenol en carbol-tionina. Siendo el protoplasma ácido y cargado negativamente se combinará con los cationes positivamente cargados o con la fracción coloreada de colorante básico. Los microorganismos después de un lavado con agua retendrán aún el colorante. La importancia de las reacciones de intercambio en los procedimientos de tinción puede hacerse patente considerando la tinción de una bacteria por un colorante básico sencillo, como el azul de metileno. Este es un colorante que ordinariamente se utiliza en forma de cloruro, el cual se disocia en disolución para dar un catión de azul de metileno coloreado y un anión cloruro. Las células bacterianas tienen un gran número de puntos activos, tales como los grupos carboxílicos de las proteínas o los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, en los cuales se forman unas sales con iones cargados positivamente (como, por ejemplo: K+, Ca++ o Mg++). El catión azul de metileno tiene una gran afinidad por tales puntos y puede desplazar de ellos a los demás cationes. Por ejemplo, puede competir con los iones de potasio en los grupos carboxílicos de una proteína. MATERIALES • Asas de inoculación • Bandeja de coloración • Mechero de Bunsen • Microscopio • Papel para limpiar lentes • Láminas o portaobjetos • Reactivo de azul de metileno • Reactivo de cristal violeta

PRÁCTICA N°5 TINCIÓN SIMPLE

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

METODOLOGÍA PREPARACIÓN DE FROTIS PARA TINCIÓN

1. Limpie las láminas (con agua jabón, papel, luego desengrasar con alcohol, dejando evaporar, esta es esencial ya que la grasa o aceite de los dedos no permiten una buena elaboración de frotis).

2. Identifique su lámina con nombre o numeración de la muestra.

3. Si la muestra es de cultivo en caldo:

Tome una o dos asadas de células suspendidas y aplíquelas directamente sobre la lámina con un asa de inoculación estéril y extienda el volumen allí aplicando de manera circular, luego extienda longitudinalmente en la placa.

4. Si la muestra es de cultivo sólido : Coloque una gota de Solución salina Estéril al ( 0.85 % ) sobre la lámina o portaobjetos. Transfiera una pequeña cantidad de células desde el cultivo a la lámina con el asa de inoculación estéril, emulsionando con la solución salina estéril obteniendo así una suspensión semitransparente de forma circular. Coloque el inóculo a un lado y en caso de requerir mas, tome más inoculo y luego homogenice. Permita que el extendido se seque al aire. NO SOPLE U ONDULE LA PREPARACIÓN EN EL AIRE. Fije al calor la preparación para evitar la elusión del frotis durante la tinción. Realizar esta fijación pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un mechero de Bunsen.

PROCEDIMIENTO PARA TINCIONES SIMPLES

1. Realice el frotis con la técnica adecuada para los microorganismos asignados por el tutor y fíjelo al calor.

2. Coloque la lámina en la bandeja de coloración y vierta sobre el frotis uno de los siguientes colorantes indicados usando el tiempo de exposición adecuados para cada uno:

COLORANTE TIEMPO DE EXPOSICION Carbolfuchsina 15 a 30 segundos Cristal violeta 20 a 60 segundos Azul de metileno 1 a 2 minutos

3. Lave el frotis con agua de la llave a baja presión y remueva el exceso de colorante. 4. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada. 5. Observe al microscopio 4 – 10 – 40 – 100X Nota: Prepare solo una lámina que incluya los tres microorganismos encontrados en cultivo sólido (otra de los cultivos líquidos) y realice por separado cada una de las tinciones. En total debe prepara seis láminas. CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el objetivo de realizar fijación de un frotis bacteriano? 2. ¿Cómo se clasifican las bacterias según su morfología?

Ilustre y de 4 ejemplos de bacterias para cada uno. 3. Nombre todos los tipos de agrupación bacteriana de manera sistemática

OBJETIVOS • Realizar diversas técnicas de coloración basándose en las propiedades estructurales de las bacterias,

analizando su fundamento y su interpretación. • Aprender a diferenciar entre algunas estructuras bacterianas especiales, mediante el empleo de técnicas de

coloración apropiadas. • Conocer la definición y función de la cápsula y esporas bacterianas. • Identificar cada uno de los pasos a seguir en la elaboración de coloraciones para observar cápsulas y

esporas. MATERIALES: Láminas o portaobjetos. Asas bacteriológicas. Microscopio

MÉTODOS DE TINCIÓN Los reactivos para tincion estan hechos de materiales colorantes, las cuales pueden clasificarse como naturales o sintéticos. Los colorantes naturales se emplean preferentemente en histologia , siendo los mas importantes: la hematoxilina, extracto etereo de la madera de un arbol mexicano ( Haematoxylon campechianum); el carmin; extracto de la hembra de un insecto ( Coccus cacto ) , y la orceina y el tornasol, extracto de líquenes. Los colorantes artificiales incluyen las anilinas o mas correctamente los colorantes de hulla derivados todos del benceno. Los colorantes pueden dividirse en tres grupos: Acidos, básicos, neutros ( Tabla No 1) . Los mas utilizados son sales, compuestos de un acido y una base. La base es un cation cargado positivamente y el acido es un anion con carga negativa. Los colorantes acidos son aquellos que poseen las sustancias colorantes en el radical acido y el componente basico desprovisto de color. Los básicos poseen, al contrario, el componente coloreado en la base siendo el componente acido incoloro. Los colorantes neutros resultan de una mezcla de soluciones acuosas de determinados acidos y bases. TABLA No 1 Colorantes acidos, básicos y neutros.

COLORANTES ACIDOS COLORANTES BASICOS COLORANTES NEUTROS Acido picrico Nigrosina Fuchsina acida Floxina

Tionina Azul de metileno Fucshina basica Cristal violeta Hematoxilina Safranina Auramina Rojo neutro Verde de malaquita

Giemsa Wrigth Leishman

En el laboratorio de Microbiología se utilizan diversos métodos de tinción o coloración para visualizar los detalles morfológicos de las bacterias, estos se fundamentan en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias frente a los diversos colorantes. Algunas de las coloraciones mas empleadas en Microbiología son: Coloración de Gram, Coloración de Ziehl-Neelsen, Coloración de Alberth, Coloración de Stoltemberg, Coloración de Hiss, Coloración de Dorner, etc. 1. COLORACIÓN PARA IDENTIFICAR ESTRUCTURAS Y COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA PARED BACTERIANA: 1.1 COLORACIÓN DE GRAM: La coloración de Gram , descubierta hace algo mas de 100 años por Hans Christian Gram , es el mas util en el Laboratorio de Microbiologia y Bacteriología, aunque no determina con absoluta certeza el microorganismo

PRÁCTICA N°6 TINCIÓN COMPUESTA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

causal, si establece un diagnostico presuntivo rapido. Esta conformado por una serie de 3 colorantes y un decolorante. Coloreando las bacterias con este metodo, según la composición de la pared celular, se pueden separar en dos grupos: las que toman el colorante basico ( cristal violeta ) o el de contraste ( safranina o fucshina) agrupándose respectivamente en Gram positivas, aquellas coloreadas de violeta y Gram negativas las que se colorean de rojo o rosado. La solucion de lugol actua como mordiente y el alcohol acetona como decolorante. En las bacterias es fundamental la reaccion tintorial al Gram, ya que este dato implica estructura y composición química de la pared bacteriana y la reaccion de la bacteria frente a agentes fisicos y químicos.

FUENTES DE ERROR • Frotis gruesos causan decoloración inadecuada. • Tiempo excesivo de decoloración. • Remoción del frotis durante el secado. • Utilización de un material bacteriano viejo, el cual tiende a decolorarse y tomar el colorante de

contraste. Se recomienda utilizar cultivos bacterianos jóvenes, de 24 horas de incubación.

MATERIALES Cepas: Escherichia coli Reactivos: Cristal violeta Staphylococcus sp. Lugol Alcohol cetona Fucshina o safranina Equipos: Laminas o portaobjetos Asas bacteriológicas Microscopio

PROCEDIMIENTO PARA TINCIÓN DE GRAM 1. Realice el fortis con la técnica adecuada y fìjelos al calor. 2. Vierta sobre el frotis Cristal Violeta y dèjelo actuar por 1 minuto. 3. Lave con agua de la llave a baja presión y escurra. 4. Cubra ahora el frotis con lugol y deje actuar por 1 minuto. 5. Lave con agua de la llave a baja presión y escurra. 6. Cubra ahora con solución decolorante por 30 segundos. 7. Lave con agua de la llave a baja presión y escurra. 8. cubra ahora con colorante de contraste y deje actuar por 45 segundos. 9. Lave con agua de la llave a baja presión y escurra. 10. Permita que se seque al aire dejando la lamina en posición inclinada. 11. Observe al microscopio con los siguientes objetivos: 10X – 40X – 100X utilizando este último con aceite

de inmersión. Interpretación: Microorganismos Gram positivos : violeta Microorganismos Gram negativos: rojo o rosado

CONTROL DE CALIDAD DE LA COLORACIÓN DE GRAM Realizar un frotis con una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus sp, y aplicar la coloración de Gram, teniendo en cuenta los tiempos establecidos para cada sustancia según la técnica de coloración original. Al observar el frotis se deben ver simultáneamente bacilos Gram negativas (Escherichia coli) y cocos Gram positivos ( Staphylococcus sp). Si el resultado obtenido es la observación de sólo bacterias Gram positivas, debera aumentarse el tiempo de decoloración con el alcohol acetona; por el contrario, si solo se ven bacterias Gram negativas, deberá disminuirse el tiempo de decoloración hasta obtener la observación simultanea de los dos tipos de microorganismos cada uno con su color correspondiente. 1.2 COLORACIÓN DE ZIEHL- NEELSEN

Se usa para bacterias que no se tiñen por los colorantes corrientes debido a su alto contenido de lípidos en la pared celular ( Mycobacterium sp) . Se fundamenta en que las bacterias ácido-alcohol resistentes, en especial las micobacterias están cubiertas por un material grueso, ceroso, que resisten la tinción; no obstante, una vez que se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten la decoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol – ácido. Consecuentemente, dichas bacterias son conocidas como resistentes PROCEDIMIENTO DE COLORACIÓN

1. Se prepara una extensión a partir de un cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo, dejar secar y fijar con calor suave.

2. Aplicar el colorante de Albert durante 3 – 5 minutos. 3. Lavar con agua y secar cuidadosamente con papel. 4. Aplicar lugol durante 1 minuto. 5. Lavar con agua, secar cuidadosamente con papel y después con calor suave.

Interpretación: Gránulos: azulado oscuro. Resto del microorganismo: verde. Otros gérmenes se tiñen normalmente de verde pálido. COLORACIÓN DE NEISSER: Se precisan las siguientes soluciones: Colorante de Neisser A Colorante de Neisser B Colorante de Neisser C MATERIALES Cepa: Corynebacterium sp Reactivos: Colorante Neisser A Colorante Neisser B

Colorante Neisser C Equipos: Láminas o portaobjetos. Asas bacteriológicas. Microscopio PROCEDIMIENTO Se necesita la siguiente solución: Colorante de Pugh.

1. Preparar una extensión a partir de un cultivo de 18 – 24 horas del microorganismo, dejar secar y fijar por calor suave.

2. mezclar 2 partes de Neisser A con 1 Neisser B y dejar actuar sobre la preparación durante 16 segundos. 3. lavar rápidamente con agua. 4. teñir por contraste utilizando Neisser <<C>> y dejando que actúe durante 30 segundos. 5. lavar rápidamente con agua, empapar con papel secante y seguidamente dejar secar.

Interpretación: Gránulos: púrpura rojizo. Otras partes del germen: azul claro. 1.2 . TINCIÓN DE ESPIROQUETAS Las espiroquetas son tan sumamente finas que no se pueden observarse microscópicamente menos que se efectúe una iluminación sobre campo oscuro. No se tiñen bien con colorante de anilina, sin embargo tienen la propiedad de reducir nitrato de plata a plata metálica, por lo que pueden emplearse métodos de impregnación argéntica tales como el de fontana para extensiones o el de Levaditi para tejidos. MÉTODO DE FONTANA: Se requiere las siguientes soluciones: Fijador de Fontana Alcohol absoluto. Mordiente de Fontana. Solución argéntica de Fontana.

Método: 1. Tratar la extensión tres veces, durante treinta segundos cada una, con el fijador de Fontana. 2. Eliminar el fijador lavando con alcohol absoluto y dejar que éste actúe durante 3 minutos. 3. Tirar el alcohol sobrante y terminar la eliminación de los restos quemándolos hasta que la extensión quede

seca. 4. Aplicar el mordiente de Fontana, calentar hasta desprendimiento de vapores y dejar actuar durante 30

segundos. 5. Lavar bien con agua destilada y secar de nuevo la preparación. 6. Tratar con la solución argéntica de Fontana hasta desprendimiento de vapores; dejar en reposo durante 30

segundos o bien hasta que la extensión adquiera color marrón. 7. Lavar bien en agua destilada, secar y montar con DPX. Interpretación: Espiroquetas: marrón oscuro. Fondo: amarillo marrón. TINCIÓN DE GIEMSA Se requiere las siguientes soluciones: Alcohol etílico o metílico. Colorante de Giemsa diluido. PROCEDIMIENTO

1. Fijar la extensión con alcohol metílico o etílico durante 2 minutos. 2. Teñir con el colorante de Giemsa diluido (1/20 en agua destilada neutra) y dejar en una estufa a 37ºC

durante 1 hora 3. Aclarar con agua destilada y secar con papel.

Interpretación: Espiroquetas: azul 1.3. COLORACIÓN PARA FLAGELOS La mayor parte de las bacterias móviles poseen flagelos, cuyas formas, cantidad y posición son características importantes en la diferenciación para la identificación de géneros y especies, en particular cuando las reacciones bioquímicas son débiles o confusas. La técnica de coloración de Leifson (o su modificación) es la empleada con más frecuencia en los laboratorios. METODO DE PREPARACIÓN DEL METODO LEIFSON: A. Medio y reactivos.

1. Fucsia básica al 1.2% en alcohol al 95% 2. ácido tánico al 3% en agua. 3. cloruro de sodio al 1.5 % en agua. 4. coloración final: Combinar las tres soluciones stock en volúmenes iguales.

PROCEDIMIENTO METODO LEIFSON: 1. Preparar una suspensión poco densa de bacterias en agua a partir de un cultivo joven. 2. Colocar dos gotas de la suspensión en un extremo del porta objeto. Dejas secar al aire. Con un lápiz de

cera, dibujar una línea perpendicular en la superficie del vidrio en el extremo opuesto de la suspensión. 3. Colocar el portaobjeto en un soporte inclinado y cubrir la suspensión bacteriana seca con una fina película

de colorante. La marca con el lápiz de cera impide que el colorante se escurra del extremo del portaobjeto. 4. Colorear durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se evapora el alcohol.

El tiempo de tinción disminuye si el colorante es fresco, si la temperatura del ambiente es alta. 5. Cuando se forma un precipitado, enjuagar el portaobjeto suavemente con agua destilada, eliminar el exceso

de agua y dejar secar al aire. Nota: Realice una sola lámina que incluye los 3 microorganismos encontrados en cultivo sólido (otra de los de cultivo líquido). En total debe preparar 2 láminas para TINCIÓN DE GRAM.

A partir de las muestras y/o cultivos bacterianos indicados por el tutor realice una coloración para visualización de: bacilos ácido – alcohol – resistentes, para gránulos metacromáticos, para cápsula y para esporas. Observe cada una al microscopio con el objetivo de 100X detallando cada una de las estructuras que desea resaltar con la coloración, así como el color que estas toman con la técnica de coloración respectiva.

PREPARACIÓN DE COLORANTES

METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO COLORACIÓN DE GRAM 1. Cristal Violeta (Hucker’s)

Solución A Cristal violeta (90% de contenido seco) 2.0 gr Alcohol etílico (95%) 20 mL Solución B Oxalato de amonio 0.8 gr Agua destilada 80 mL. Solución de Trabajo: Diluir la solución A en proporción 1:3 con agua destilada y mezclarla con 4 partes de solución B. Guardar en un frasco color ambar y conservar por 24 horas antes de utilizarse. Filtrar cuando se observe formación de precipitado.

2. Yodo de Gram Yodo 1gr. Yoduro de Potasio 2gr. Agua destilada 300 ml. Colocar el yoduro de potasio en un mortero, agregar yodo y triturarlo perfectamente. Agregar el agua en poca cantidad, mezclar y envasar en frasco ámbar. Lavar cada vez el mortero con poca cantidad de agua hasta completar el volumen de 300 ml.

3. Alcohol – acetona Acetona 50 ml. Alcohol etílico 95% 50 ml.

4. Safranina

Safranina O 0.25 ml. Alcohol etílico (95%) 10 ml. Agua destilada 100 ML (completar a este volumen).

METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE ZIEHL NEELSEN

1. Fuscina Solución Madre de Fuscina fenicada de Ziehl: Fuscina básica para microscopia C22H24CIN3 10gr. Etanol 95º 100 mL. Triture la fuscina en un mortero con el alcohol, agregándolo poco a poco; trasvase a un frasco ámbar. En caso que no disponga de un mortero, coloque directamente la fuscina y el alcohol en el frasco ámbar y agite hasta su completa disolución. Coloque la solución madre de fuscina a 37ºC por 8 días, para su maduración; agite diariamente para extraer la mayor cantidad de colorante procedente del polvo de fuscina. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar. Solución de fenol al 5%

Fenol 5mL. Agua destilada 95 mL: Funda los cristales de fenol en baño María; utilice cámara de extracción; mida en probeta los 5 ml y complete con agua destilada a 100 mL. Envase, rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de luz. Solución de trabajo de fuscina fenicada: Solución de fuscina filtrada 10mL. Solución de fenol al 5% 90mL. Envase en frasco ámbar. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegido de la luz. 2. Alcohol ácido al 3% Solución Madre de azul de metileno: Azul de metileno para microscopia C16H18CIN3S.2H2O 10gr. Etanol 95º 100mL. Coloque la solución madre de azul de metileno a 37ºC por 8 días, para su maduración; agite diariamente a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar. Solución de trabaja de azul de metileno: Solución madre filtrada 30mL. Agua destilada 70mL. METODO DE PREPARACIÓN REACTIVO DE MÖLLER. Fuschina carbólica de Zeehl – Neelsen (Z – N), ácido sulfúrico al 1%, azul de metileno de Zeehl – Neelsen. COLORACIÓN DE SCHEFFER – FULTON 1. Verde de Malaquita:

Verde de Malaquita 5.0gr. Agua destilada 100mL.

2. Safranina: la misma de la tinción de Gram METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO HISS. 1. Fuscina

Fuscina básica 0.15 – 0.30gr. Agua destilada 100mL.

2. Sulfato de cobre al 20% en agua destilada. 3. cristal violeta Cristal Violeta 0.05-0.1gr. Agua destilada 100ml. METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO ROJO CONGO En un frasco color ámbar adicione: Rojo congo. 1gr. Etanol 10ml. Agua destilada 90ml. Antes de usar mezcle y filtre. METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE ALBERTH Azul de toluidina 0.15gr. Verde de malaquita 0.2gr. Ácido acético glacial 1ml. Alcohol etílico (95%) 2ml. Agua destilada 100ml.

METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE NEISSER Solución A Azul de metileno 0.1g- Alcohol absoluto 2ml. Ácido acético glacial 5ml. Agua destilada 93ml. Solución B Cristal violeta 0.3g Alcohol absoluto 5ml Agua destilada 95ml Solución C Pardo Bismarck 0.2g Agua destilada 100ml. METODO DE PREPARACIÓN DEL PUGH Azul de toluidina 1g Ácido acético glacial 25ml Alcohol 20ml Agua destilada 500ml Disolver el azul de toluidina en alcohol y añadir sobre el agua acidificada. METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE STOLTEMBERG 1. Verde de malaquita 1.25gr. Agua destilada 500ml. 2. Azul de toluidina 0.25gr. Ácido acético 15ml. 3. Hematoxilina 0.05gr. Alcohol etílico 15ml. Cada colorante se macera en morteros diferentes, se mezclan y se filtran. METODO DE PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE FONTANA Fijador de fontana: Ácido acético glacial 1ml. Formalina 2ml. Agua 100ml. Mordiente de Fontana Ácido tánico (Solución acuosa al 5%) Solución argéntica de Fontana. 1. Disolver 5g de nitrato de plata en 100ml de agua destilada. 2. Diluir 5ml de amoniaco concentrado con 45ml de agua destilada. 3. Añadir 35 ml de la solución diluida de amoníaco a 90 ml de nitrato de plata. 4. Continuar adicionando, gota a gota, hasta que se redisuelva el precipitado formado. Seguir añadiendo

hasta que se obtenga una débil opalescencia. CUESTIONARIO 1. ¿En qué radican las diferencias estructurales entre bacterias Gram positivas y Gram negativas? 2. ¿Por qué razón los colorantes deben guardarse en frascos de color ámbar? 3. ¿Qué se debe tener en cuenta al preparar un colorante? 4. ¿Por qué algunas tinciones no se fijan por calor? 5. ¿Por qué la edad de un cultivo afecta las tinciones?