Producción de metabolitos de interés a partir de inóculos microbianos..docx

GUIA DE LABORATORIOQUÍMICA APLICADA A LA INDUSTRIAPREPARADA POR: SONIA M BUITRAGO M.PRODUCCIÓN DE METABOLITOS DE INTERÉS A PARTIR DE INÓCULOS MICROBIANOS.

Centro de Gestión IndustrialSistema Integrado de Gestión

1. INTRODUCCIÓN

El crecimiento de un microorganismo se define como un incremento progresivo de células cuando se les proporciona un sustrato adecuado rico en nutrientes, vitaminas y minerales. Durante este proceso, muchos microorganismos son capaces de usar estos nutrientes para llevar a cabo sus procesos celulares y muchos de sus funciones eliminando productos de desecho al medio.

Para la obtención de metabolitos de interés, es necesario el uso de bioprocesos para tal fin. En un proceso fermentativo, los sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por acción microbiana. El microorganismo de interés va aumentando su biomasa en el transcurso del proceso y al mismo tiempo el sustrato se va consumiendo con formación de productos como consecuencia de las actividades catabólicas y anabólicas. Los dos fenómenos tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultáneamente.

Para que se lleve a cabo el proceso fermentativo es necesario conocer las variables involucradas en el proceso como tiempos, temperatura, disponibilidad de oxígeno, pH, fase de crecimiento de los microorganismos y disponibilidad de nutrientes entre otras. Con el control de estos parámetros, se garantiza que los procesos que ocurren en el interior del fermentador sean los apropiados y óptimos para el desarrollo del microorganismo y la producción de los metabolitos de interés.

2. OBJETIVOS- Evaluar la producción del metabolito de interés con los microorganismos seleccionados, usando

como fuente de carbono azúcares fermentables. - Manejar las variables de un proceso fermentativo como pH, contenido de azúcares fermentables,

temperatura y tiempo. - Cuantificar por medio de la técnica de espectrofotometría la biomasa en función del tiempo. - Determinar el consumo de sustrato en función del tiempo utilizando la técnica de azúcares

reductores 3,5 Dinitrosalicílico. - Cuantificar por medio de técnicas directas como recuento en cámara de Neubauer y recuento en

placa la cantidad de microorganismos obtenidos en el inóculo en función del tiempo.

3. METODOLOGÍA

3.1 Elaboración del mosto a utilizarDe acuerdo a la materia prima que el grupo proyecto está trabajando, pesar los siguientes reactivos y agregarlos al sustrato.



REACTIVO CANTIDAD g/LAzúcares fermentables 200Extracto de levadura 3KH2PO4 1MgSO4 7H2O 0,5Peptona 5(NH4)2 SO4 0,5

Ajustar el pH a 5,5 con una solución de NAOH al 0,1N

3.2 Montaje de la fermentación discontinua- Lleve a autoclavar el mosto a 7 lb de presión por 7 minutos después de haberlo filtrado y

clarificado. - Deje enfriar el mosto hasta 30 °C- Tome una alícuota de 50 ml1, centrifúguelos a 4600 rpm por un periodo de 15 minutos. Tome el

sobrenadante, descartando el precipitado y realice la medición de azúcares reductores con lo que comenzará su fermentación. Para esto utilice la técnica de DNS explicada en el numeral 6.3

- Para la realización del inóculo, tome el 10% del total del medio de cultivo y ajuste su turbidez al patrón número 2 de MacFarland. La concentración de este patrón 6x108 UFC/ml.

- Tome 0,5 ml del inóculo puro y dilúyalo con 4,5 ml de solución salina estéril. - Agregue una gota de azul de metileno a cada uno de los tubos. - Colocar con la ayuda de un capilar tome 10 µL de la dilución y realice el montaje en la cámara de

Neubauer. - Enfoque primero a 4X la cámara y luego pásela a 40X con el cuidado de no partir la laminilla ni la

cámara. - Revise que las células se encuentren en proceso de gemación y que se encuentren viables.- Realice una coloración de Gram - Una vez confirmado la viabilidad de las levaduras, adicione el inóculo a la fermentación,

homogenice y tome una muestra de 5 mL en condiciones estériles. Esta muestra la utilizará más adelante para determinar la curva de crecimiento microbiano, el recuento por espectrofotometría y el recuento en placa.

- Tapa bien el frasco de su fermentación y llévelo al agitador por un periodo de 7-12 días a 20 ◦C y 120 rpm.

- Usted debe realizar muestreos de un volumen final de 20 mL a las siguientes horas Hora 0 (inicio de la fermentación), Hora 48 (2 días), Hora 60 (3 días), Hora 120 (6 días), Hora 144 (7 días), Hora 192 (9 días), Hora 240 (día 11). Deposite estos muestreos en tubos estériles para evitar cualquier tipo de contaminación.

3.3 Curva patrón para la determinación de azúcares reductores

3.3.1 Preparación base del reactivo DNS- Para la manipulación de este reactivo es necesario utilizar tapabocas y guantes debido a su alto

poder cancerígeno.

1 Esta solución la deberá mantener estéril y se utilizará en el numeral 6.3 cuando se mida recuento de biomasa por espectrofotometría, usándola como blanco.



- Para la adición del DNS, se debe tener en cuenta, que este en solución es reactiva a la luz; por lo tanto es necesario utilizar un recipiente ámbar o en su defecto cubrir el erlenmeyer con papel aluminio

- Disuelva 1,6 g de NaOH al en agua destilada. Llevar a agitación hasta obtener una solución homogénea.

- A esta solución se le adicionan 30 gramos de Tartrato de Sodio y Potasio y 1 gramo de DNS (ácido 3 – 5 dinitrosalicílico).

- Aforar a 100 ml con agua destilada- Almacenar en frascos ámbar a 4 °C

3.3.2 Preparación de las soluciones de concentraciones conocidas 0.5-2 g/L

- Prepare las muestras a diferentes concentraciones a partir de la solución concentrada de glucosa 2 g/L/. Tenga en cuenta que esta concentración es la C1 y que el volumen final de cada concentración será de 10 ml.

- Con la ayuda de la siguiente fórmula prepare las diferentes concentraciones

V1 x C1 = V2 x C2

Donde

C1: concentración de glucosa concentrada 2 g/LV1: volumen de la solución concentradaC2: concentración de la solución diluidaV2: volumen del diluyente

- Una vez tenga los cálculos complete la tabla que se tiene en los resultados

3.3.3. Determinación de la concentración de glucosa por la técnica de DNS

- Con las soluciones anteriores preparadas y de concentración conocida, depositar 0.25 mL de cada una en tubos de ensayo.

- Cuando las haya dispuesto en cada tubo, continúe con el procedimiento lo descrito en la siguiente tabla, no olvide antes de comenzar colocar papel de aluminio a cada tubo para cubrirlo de la luz.

Reactivo Blanco Concentración g/L0.5 0.7 1 1.5 2 4

Glucosa(mL)

- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua(mL)

0.5 - - - - - -

Reactivo DNS(mL)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

* Calentar a ebullición los tubos de ensayo sin el papel de aluminio por 5 minutos y posteriormente detener la reacción por inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.

AguaDestilada (ml)

5 5 5 5 5 5 5

Agitar y dejar en reposo por 15 minutos. Proteger los tubos de la luz con papel de aluminio y realizar las determinaciones de absorbancia a 540 nm, ajustar a cero de absorbancia con el blanco.

(Miller, G. 1959)



- Realice las mediciones de las absorbancia a 540 nm y complete la tabla que se encuentra en los resultados.

3.4 Determinación de biomasa por espectrofotometría- De cada una de las horas muestreadas, tome 5 ml y llévelas al espectrofotómetro para medir el

aumento de la biomasa. Tome como blanco la alícuota de 50 ml 2 que tomó del medio estéril sin inocular.

3.5 Determinación de biomasa por técnica de recuento en placa en profundidad- De los muestreos respectivos, realizar un recuento en placa en profundidad. - Realice los recuentos sugeridos en la tabla para realizar esta determinación

Hora a muestrear Diluciones a sembrar Tinción de GramHora 0 (inicio de la fermentación)

10-6, 10-7, 10-8 Tinción

Hora 48 (2 día) 10-9, 1010, 10-11

Hora 60 (3 días) 10-10, 10-11, 10-12

Hora 120 (6 día) 10-10, 10-11, 10-12

Hora 144 (7 día) 10-10, 10-11, 10-12 TinciónHora 192 (9 día) 10-10, 10-11, 10-12

Hora 240 (11 días)3 10-7, 10-8, 10-9 Tinción

- Realice la siembra de 1 ml de cada dilución por duplicado en cajas de Petri estériles. - Inmediatamente después, agregue 20 ml del agar seleccionado (Saboroaud) que se encuentre a

una temperatura de 42 ◦C sobre la caja de Petri con la muestra y homogenice, siguiendo estos movimientos

- Deje gelificar el agar, marcar las cajas en el reverso de la caja y sobre los bordes. - Llevar a incubar a 30 ◦C por un periodo de 72 horas. - Después del periodo de incubación realice el recuento de cada una de las cajas de petri. - Informe en la tabla de resultados.

2 La solución que utilizará como blanco, es la que se obtuvo en el numeral 6.23 Después de este tiempo prepare una solución de agar agar al 1,5% y agregue 15 ml de esta solución al fermento. Esto con el fin de comenzar a suspender los sólidos suspendidos.



3.6 Medición de pH

- De cada uno de los muestreos y con ayuda de un pH metro, realice la medición de pH durante su fermentación.

- Si el pH baja más de 4,5 agregue NAOH 0,1 N estéril a su fermento para evitar inhibición por pH bajo.

-3.7 Proceso de separación de células del producto de interés

- Centrifugue su fermento a 7000 rpm por 5 minutos. - En el proceso separe el sobrenadante en un frasco plástico estéril y descarte el precipitado que

corresponde a las células. - Guarde el sobrenadante (extracto crudo) a una temperatura de refrigeración para sus posteriores

análisis.

4 RESULTADOS

4.1. Absorbancias de la curva patrónConcentración g/L Absorbancia λ

540 nm0.50.71

1.524

Realice la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de la concentración (ABS Vs Conc) y determinar la ecuación de la línea recta. Abs 540 nm = m*s+b

Donde: S: concentración de glucosa en g/L b: punto de corte (intercepto) con el eje Ym: pendiente de la recta

4.1.1 Representación gráfica de resultadosGraficar la absorbancia en función de la concentración de glucosa e incluir la ecuación de la línea recta con el coeficiente de determinación (R2)

4.2 Determinación de azúcares reductores- Con la ayuda de la ecuación de la línea recta Y=mx+b obtenida en la curva patrón de la glucosa, remplace x para obtener la concentración de azúcares reductores presentes en cada hora de fermentación.

No olvide que Y= a la absorbancia obtenida.



- Realice una gráfica donde se represente el consumo de sustrato respecto al tiempo de fermentación. el tiempo y las células que conto en la cámara por mililitro.

4.3 Determinación de biomasa por espectrofotometría

- Realice una gráfica donde se represente el tiempo y la absorbancia obtenida durante la fermentación.

4.4 Determinación de microorganismos por recuento en placa

- Realice una gráfica donde se represente el tiempo y las UFC/mL que conto en caja de Petri.

4.5 Determinación de pH

Tiempo (horas) ABS Sustrato residualHora 0 (inicio de la fermentación)Hora 48 (2 día)Hora 60 (3 días)Hora 120 (6 día)Hora 144 (7 día)Hora 192 (9 día)Hora 240 (11 días)

Tiempo (horas) ABSHora 0 (inicio de la fermentación)Hora 48 (2 día)Hora 60 (3 días)Hora 120 (6 día)Hora 144 (7 día)Hora 192 (9 día)Hora 240 (11 días)

Tiempo (horas) UFC/mLHora 0 (inicio de la fermentación)Hora 48 (2 día)Hora 60 (3 días)Hora 120 (6 día)Hora 144 (7 día)Hora 192 (9 día)Hora 240 (11 días)



- Realice una gráfica donde se represente el tiempo y el pH obtenido durante la fermentación.

5 ANÁLISIS DE RESULTADOS6 CONCLUSIONES7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

8 BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA

Alarcón, A.V. (2010). Producción de bioetanol con Zymomonas mobilis. Tesis de Maestría, Instituto Politécnico Nacional. México.

Pedroza, A.M, et al. (2007). Manual de laboratorio de procesos biotecnológicos. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá (Colombia). p 47-51.

Pedroza, A.M, et al. (2007). Manual de introducción a la Biotecnología. Editorial Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá (Colombia). p 81-86

Tiempo (horas) pHHora 0 (inicio de la fermentación)Hora 48 (2 día)Hora 60 (3 días)Hora 120 (6 día)Hora 144 (7 día)Hora 192 (9 día)Hora 240 (11 días)

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