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Tesis de Posgrado

Relación epitelio-conectivo en laRelación epitelio-conectivo en lacarcinogénesis experimental bucal:carcinogénesis experimental bucal:variaciones de ploidía variaciones de ploidía epitelial enepitelial en

relación a la expresión del factor derelación a la expresión del factor decrecimiento fibroblástico-básico ycrecimiento fibroblástico-básico y

fibrosisfibrosis

Raimondi, Ana Rosa

2003

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Raimondi, Ana Rosa. (2003). Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesis experimentalbucal: variaciones de ploidía epitelial en relación a la expresión del factor de crecimientofibroblástico-básico y fibrosis. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3636_Raimondi.pdf

Cita tipo Chicago:Raimondi, Ana Rosa. "Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesis experimental bucal:variaciones de ploidía epitelial en relación a la expresión del factor de crecimiento fibroblástico-básico y fibrosis". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad deBuenos Aires. 2003. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3636_Raimondi.pdf

Tesis Doctoral

Relación epitelio-conectivo en la carcinogénesisexperimental bucal:

Variaciones de la ploidia epitelial en relación a la

expresión del factor de crecimiento fibroblástico­básico y fibrosis

Autor: Lic. Ana Rosa Raimondi

Director: Dra. M. E. Itoiz

Laboratorio de I-Iistoquírnica,Cátedra de AnatomíaPatológica, Facultad de Odontología, Universidad de Buenos

Aires.

3636n— A.

Universidad de Buenos AiresFacultad de Ciencias Exactas y Naturales

Buenos Aires, noviembre de 2003

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Caracteristicas generales de las neoplasias malignasCarcinogénesis 12Agentes 12

Modelosparadignfdíax en el estudio de la cardnogénesis 14Factoresde aedm'ento yoánoer 16

Familiasde factoresde aedmierto reladmadas al tánoer 17Receptores de factores de crecim'ento 21

Interacción epitelio-mesénquima 22

Cáncer de Cabeza y Cuello: Cáncer Bucal 25Cánoerbua-¡I 25

EpiderriologíayEio/ogía 25Biologíadel cánaar bucal 29

Cadnogénesís bucal:'Camfizadán de mmpo' 30Pdologv'adel cáncer bucal 33

inonec pre-neoplásimsde la cavidadbad 34Modelosde cáncer bucal 36

Objetivos 38

Sección I-a 39

Reproducción del modelo de la bolsa de la mejilla del hámster. Análisis macro ymicroscópico.

Introducción 39Objetivos 43Materiales y métodos 43Resultados 44Conclusiones 49

Sección I-b 51

Variacionesde la ploidía epitelial en la carcinogénesis de la bolsa de la mejilla delhámster

Introducción 51Ajuste metodológico del Análisis de ploidia 52Anáisis de Ia Ploiaïa 53

Objetivos 5 7Materiales y métodos 58

Ajuste metodológico del Análisis de ploidía 58Anáisis de la Ploicfia 61Anáisis Estadsfioo 63

Resultados 63Aiuste"Hoddógioo del Análisisde ploidía 63Análisis dela PIoiaïa 65

Camízaa‘ón durantetiemposlargos (desarrollode tunores) 66

Cmoelizaa'ón en tienpos irtenneaïos (lesionespre-neoplásims) 68Conclusiones 71

Sección I-c 72

Análisis de lafibrosis inducida en el conectivo subyacente al epitelio transformado.Introducción 72

Objetivos 74Materiales y métodos 74

Témica de Piero Sirius-Red 74alantificadón 75Análisis Estadistica 76

Resultados 77Conclusiones 81

Sección II-a 82

Expresión delfactor de crecimientoflbroblástico-básico.Introducción 82

Elfadord: ' '4 " " bá’dccfiFGF) 85ReoeptoresdeFGFs 88

Objetivos 89Materiales y métodos 89

1 da’ b-FGF 90Determinación inmunoh‘stoquímicade los FGFR- 2 y 3 91Determinadür dd b-FGFpor westemblds 92Andisis Estadístico 95

Resultadm 95

Expresión de FGFR 2 y 3 103Conclusiones I08

Sección II-b 109

Estudio delfactor de crecimientode endotelios vascularesy la actividadproteollticaIntroducción 109Objetivos l l lMaterialesy métodos l ll

r . . .1 . L. . .1 dd VEGF 111

Zimogamas 113Resultados l 14

Emesión ¡mndüdoquínim del VEGF114Resultados preliminaes sobre edividad ploteo/¡tien 118

Conclusiones l 19

Discusión 120

Conclusiones 129

Bit" a ti. 132

AGRADECMIENTOS

Ala Dra. María Elina ltoiz, mi directora de tesis por introducirme y guiarme en el mundode la anatomía patológica, por permitirme crecer en el laboratorio y por el afecto querecibí todos estos años.

Al Dr. R. L. Cabrini por sus críticas y consejos.

A Víctor Hugo por ser mi compañero de laboratorio todos estos años.

A Mariana por sus consejos y compañía de todos estos años.

A mis compañeros de laboratorio, Miguel, Luisa, Ana, Sara y Pablito, por compartir tantosalmuerzos, charlas, alegrías y frustraciones.

A la Dra. M. B. Guglielmotti por su constante apoyo y consejos.

A todo el personal docente y no docente de la Cátedra de Anatomía Patológica porhaberme hecho sentir acompañada todos estos años.

AI Dr. A. Molinolopor sus ganas, consejos y apoyo constante.

A los directores del laboratorio de Carcinogénesis Hormonal del lByME,Drs. A. MolinoloyC. Lanari, por haberme facilitado los anticuerpos utilizados en este trabajo para el estudiode los receptores del FGF.

A Marina por haberme enseñado y ayudado con el estudio de la actividad enzimática ypor su buen humor constante.

A las chicas del lByME,Caro, Vicky, Rocío, Cecilia y María, por los almuerzos y matescompartidos entre las largas horas de espera entre inmuno e inmuno.

Ala gente del departamento de Radiobiologíade CNEAdonde pasé muchas horascuantificando ADN por su compañía y aliento, principalmente a Mandy.

A Silvi y Erika mis compañeras de CNEA.

A mamá, Diego y Mariana por acompañarme, como siempre.

A Juan por todo y más.

RESUMEN

El modelo de la bolsa de la mejilla del hámster muy aceptado y utilizado. reproduce la

cancerización de la boca humana y una fibrosis subepitelial semejante a la fibrosis de

la submucosa. En el se han analizado extensamente las características de los tumores

que produce, pero se ha prestado menos atención al estudio de las etapas previas a la

aparición de tumores. Las neoplasias que se observan en el modelo se dan en forma

focal, precedidas por lesiones pre-malignas muitifocales, en una clara manifestación

de la instalación de un campo cancen'zado al igual que en la boca humana. Dado que

el carcinoma de la mucosa bucal ha mantenido su incidencia y sus bajos índices de

sobrevida durante los últimos 20 años parece importante disponer de un modelo

experimental bien caracterizado para su estudio. Aproximadamente el 90% de los

cánceres humanos son carcinomas. por lo cual resulta de interés que el abordaje del

estudio de la biología de los carcinomas sea desde la perspectiva de la interacción

epitelio-mesénquima. En base a estas observaciones, el objetivode esta tesis doctoral

fue el de estudiar los cambios que subyacen a la transformación maligna del epitelio, a

través del análisis de ploidía y la desregulación de la interacción epitelio-conectivo,

caracterizándola por medio del estudio de los cuadros fibrosos subyacentes al epitelio

transformado. Tratando de aportar datos que pudieran ser trasladados a Ia biología de

las lesiones pre-malignas humanas y a la búsqueda de marcadores de cancerización

de campo. Para ello describimos las áreas NUMF(epitelios histológicamente normales

pero cancerizados) que configuran los cuadros propios de la cancen'zación de campo.

Como primer paso en el estudio de la interacción epitelio-conectivo evaluamos a

través del análisis de ploidía las alteraciones epiteliales, cuantificamos las áreas

NUMF, pre-neoplásicas y neoplásicas. encontrando que las zonas NUMFpresentan

un mayor contenido de ADN respecto de la mucosa normal a las 16 semanas de

tratamiento. Para analizar las alteraciones en el tejido conectivo caracterizamos los

cuadros desmoplásicos a través de la cuantificación de las áreas de fibrosis.

Encontramos que la fibrohilalinosis aparece muy precozmente, antes que se

evidencien cambios morfológicos en el epitelio transformado (a las 7 semanas de

tratamiento, subyacente a las áreas NUMF) se presentan volúmenes de fibrosis

aumentados significativamente respecto de la mucosa normal. Luego analizamos la

expresión del FGF-2 durante el proceso, tratando de relacionado con los cuadros

fibrosos. Encontramos que las variaciones en la expresión del FGF-2 en el tejido

epitelial coinciden con Ia evolución de la fibrosis subepitelial en las etapas tempranas y

que los carcinomas expresan en muy baja cantidad el factor o no lo expresan (se

observó una regulación a través de la isofonna de 18 kd del factor). Encontramos

expresión de los receptores 2 y 3 del FGF en el tejido epitelial y conectivo en las

lesiones pre-malignas y expresión irregular de los mismos en los tumores. Finalmente

analizamos si existía expresión de VEGF en el modelo. El VEGF presentó un cambio

de su patrón de expresión en el epitelio en relación a los cuadros fibrosos durante las

etapas pre-neoplásicas. También estudiamos si existia actividad proteolitica,

encontrando un patrón de actividad correspondiente al de las MMP-2 y 9 en las

etapas tempranas. El análisis conjunto de los resultados expuestos en esta tesis nos

lleva a considerar que ni el b-FGF ni el VEGF tendrían un rol preponderante en el

proceso angiogénioo general de este modelo, ni en los tumores, pero el b-FGF tendn'a

un rol importante en la producción de fibrosis, de gran magnitud en las etapas

tempranas. Tanto el factor como los cuadros desmoplásicos disminuyen desde las

etapas intermedias en adelante, revelando su influencia en la dismpción temprana de

la interacción epitelio-conectivo. Por lo tanto, la fibrosis junto a la ploidia de las áreas

pre-neoplásicas son una manifestación temprana de la cancerización de campo.

ABSTRACT

The hamster cheek pouch carcinogenesis model is universally accepted and wider

employed as a model of human oral cancer. It closer mimics human oral

carcinogenesis and exhibits a subepithelial fibrosis that resembles the fibrosis of the

submucosa. The tumors that develop as a result of the carcinogenesis protocols have

been extensiver studied. However, the earlier stages of malignant transformation

have been less studied. Foci of neoplastic growth are preceded by multifocal

premalignant lesions that evidence the presence of field canoen'zed tissue as occurs in

the human oral cavity. Given that the incidence and low survival rate of oral carcinoma

have remained unchanged over the last 20 years. a well characterized experimental

model to study the different aspects of this pathology is of great value. Approximately

90% of all human cancers are carcinomas. Within this context it is interesting to

address carcinoma biology from the viewpoint of epithelium-mesenchyma interactions.

Based on these observations, the aim of the present PhD Thesis was to study the

changes that underlie epithelial malignant transformation employing ploidy analysis

and the evaluation of the deregulation of the interaction between epithelium and

connective tissue. We characterized this interaction by evaluating the fibrosis that

underlies the transforrned epithelium. The particular aim was to contribute data that

may be applied to the biologyof human precancerous lesions and search for markers

of field cancerization. Vlfithinthis context we described NUMF areas (histologically

normal but cancerized areas of epithelium), characteristic of field cancerization. As the

first stage in our study of epithelium-connective tissue interactions we performed a

ploidy analysis of the different areas of epithelium, i.e. NUMF, pre-neoplastic and

neoplastic epithelia. We showed that the DNA content of NUMF epithelium at 16

weeks of treatment was larger than that of normal epithelium. We analyzed the

changes in connective tissue in terms of desmoplastic features by quantitative

evaluation of areas of fibrosis. We demonstrated that fibrohyalinosis appears very

early on in the process of malignant transformation before the morphological changes

become apparent in the transfonned epithelium. At 7 weeks of treatment significantly

larger volumes of fibrosis were detected underlying NUMFareas than those underlying

normal tissue. We also analyzed the expression of FG-2 during the process and the

association with fibrosis. We found that variations in the expression of FG-2 in

epithelial tissue conelate with the evolution of subepithelial fibrosis in the early stages

and that carcinomas express the factor very littleor not at all (we observed regulation

via the 18 kd isofon'n of the factor). We detected expression of receptors 2 and 3 of

FG-2 in the epithelium and the connective tissue in precancerous lesions and irregular

expression in tumors. We also examined the expression of VEGF in the model. VEGF

evidenoed a change in its expression pattem in the epithelium above areas of fibrosis

that appear dun'ng the preneoplastic stages. The analysis of proteolytic activity

revealed patterns of activity corresponding to MMP-2 and 9 in the early stages. A

comprehensive analysis of the data presented in the present Thesis suggests that b­

FGF and VEGF do not play a central role in angiogenesis in this model or in tumors. b­

FGF would have an important role in the induction of fibrosis, a process which is

particularly important in the early stages. Both the factor and the desmoplastic features

decrease from the intermediate stages onwards, revealing their influence on the early

disruption of the interaction between epithelium and connective tissue. In this way,

fibrosis and ploidy in preneoplastic areas would be an early manifestation of field

cancerization.

ABREVIATURAS

a-FGF: factor de crecimiento fibroblástico ácido

b-FGF, FGF-2: factor de crecimiento fibroblástico básico o factor de crecimientofibroblástico 2

BrDu: 5-bromo-2'-deoxiuridina

Ca: carcinoma

CCC: cáncer de cabeza y cuelloCCE : carcinoma de células escamosasCCEB : carcinoma de células escamosas bucal

CCECC: carcinoma de células escamosas de cabeza y cuelloCIS: carcinoma in situ

D: displasia

DMBA:7,12-dimetilbenz(a)antraceno

EGF: factor de crecimiento epidérmico

EGFR: receptor del factor de crecimiento epidérmicoFC: factores de crecimientoFGF: factor de crecimiento fibroblástico

FGFR: receptor del factor de crecimiento fibroblástico

GAG, glucosaminoglucanosGMS: grado de marcación suprabasal

H: hiperplasia|F2: indice de fibrosis 2

IGF: factor de crecimiento similar a insulina

IHQ: inmunohistoquímica

LI: índice de proliferación celularMEC: matriz extracelular

MMP:metaloproteasa de matriz

NUMF: epitelio cancen'zado de aspecto morfológico normal (por sus siglas en inglés: nounusual microscopiofeatures).

OSMF: fibrosis de Ia submucosa bucal

PDGF: factor de crecimiento derivado de las plaquetasPREN: pre-neoplásicasTADS: tracto aero-digestivo superiorTGF-a: factor de crecimiento transformante-a

TGF-B: factor de crecimiento transformante-BVEGF: factor de crecimiento de endotelios vasculares

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS NEOPLASIAS MALIGNAS

Por su etimología neoplasia significa “nuevo crecimiento", entendiendo por "nuevo"

un crecimiento "autónomo", es decir independiente de las señales regulatorias que

impone normalmente el micro-ambiente tisular. Una célula anormal aislada que no

prolifere mas que sus vecinas normales, puede ser controlada por sistemas

homeostáticos, sean cuales fueren las otras propiedades desviadas que pueda tener;

pero si su proliferación esta fuera de control, producirá una masa de células o tumor

(Brugge y col., 1991). La palabra latina tumor se utilizaba en un principio para referirse a

cualquier tumefacción tisular, y actualmente solo se usa como sinónimo de neoplasia.

Realmente fue y es dificil encontrar una definición adecuada para el término

neoplasia. Se puede comenzar con definiciones clásicas como la de Willis,quien en 1952

(VWllis,1952) afirmaba que: “ una neoplasia es una masa anormal de tejido, cuyo

crecimiento excede y carece de coordinación con el de los tejidos normales y

persiste en forma similar luego de cesado el estímulo que le dio origen".

En ésta definición Willis incorpora varias diferencias vitales entre neoplasia y otros

tipos de crecimiento. Primero, el crecimiento es anormal. En muchos puntos del desarrollo

normal, algunos grupos de células proliferanmás rápidamente que sus vecinas, y pueden

también mostrar nuevas propiedades como Ia capacidad de infiltrarse entre las

estructuras adyacentes. Un ejemplo de esto es el trofoblasto. Pero este tejido es normal y,

por último, el hecho de que su crecimiento está estrechamente regulado es obvio. El

crecimiento neoplásico persiste después de la remoción del estímulo inicial. Willis indicó

esto para distinguir neoplasia de hiperplasia reactiva o la proliferación celular inducida por

la reacción inflamatoria y Ia cicatrización, las cuales son reversibles.

A aquella definición se le fueron agregando otros conceptos tales como el de que

esa masa anormal crece desde su inicio sin finalidad positiva para el organismo, es

autónoma y compite por nutrientes con las células normales. La idea de su autonomía

también fue discutida debido a que las neoplasias necesitan de los nutrientes del huésped

e incluso algunos tumores necesitan soporte endócrino.

Estas características y las enunciadas por Willis, son comunes a los tumores

benignos y malignos. Pueden asimismo, establecerse en forma general características

introducción 10

diferenciales entre ambos tipos tumorales. Así, por ejemplo los tumores benignos crecen

más lentamente, se rodean de una cápsula conectiva o establecen un plano de clivaje

entre ellos y los tejidos circundantes y están formados por células casi idénticas a las de

los tejidos normales. Pero en todas estas propiedades se encuentran excepciones cuando

se analizan las entidades en particular. Desde el punto de vista clínico, la diferencia

fundamental es que los tumores malignos, o cánceres, liberados a su evolución

espontánea, terminarán con la vida del portador y los tumores benignos pueden nohacerlo.

Desde el punto de vista biológico las células cancerosas se caracterizan por dos

propiedades hereditarias: ellas y su progenie se reproducen a pesar de las restricciones

normales, e invaden y colonizan tern'ton'osnormalmente reservados para otras células (De

Vita y col., 1993).

El crecimiento desmedido de una población de células neoplásicas es el rasgo

fenotipico más relevante. No obstante, la capacidad de invadir tejidos circundantes y

abandonar el sitio primario constituye un atributo biológico tan importante como el

anterior, que en la mayor parte de los casos determina el pronóstico del individuo

portador. La conjunción de ambas propiedades condiciona las dos características clínicas

mas importantes de los tumores malignos: infiltracióny metástasis.

Las células cancerosas adquieren estas características a través de acumulación de

mutaciones que finalmente conducen a un fracaso de los mecanismos que controlan

normalmente Ia proliferación y maduración celular. Como resultado de la alteración en los

controles del ciclo celular las células neoplásicas tienen en muchos casos cantidades

anormales de ADN y de proteínas citoplasmáticas anómalas, que se traducen

morfológicamente en cambios de forma, volumen y afinidad tinton'al, conocidos como

“atipías”.

La evolución de este proceso, desde la alteración a nivel celular hasta el

desequilibrio a nivel de tejido u órgano con la instalación de un tumor maligno que

finalmente excederá el lugar de origen, se denomina carcinogénesis.Otra característica de las células tumorales es su tendencia a la indiferenciación.

Tras Ia división celular, a partir de un precursor o célula madre, las células normales

asumen una función específica, que implica el desarrollo de estructuras especializadas

como filamentos de queratina, vacuolas mucinosas, microvellosidades o cilios, lo que se

conoce como diferenciación. Mientras las células madre son indiferenciadas, la célula

completamente madura de cualquier tipo celular está altamente diferenciada (figura 1).

introducción 11

,."wimlwmlfi

a diferenciación terminal

FlGURA1

Representación esquemática del control normal y alterado en la producción de células a partir de célulasmadre. a) Proceso normal de diferenciación celular. b) y c) Dos fipos de alteraciones distintas en la diferenciación quepueden producir proliferaciónalterada. El caso c) representa el efecto de una velocidad excesiva de división celular enuna célula madre.

Junto con la pérdida de la regulación del crecimiento celular, las células malignas no

suelen alcanzar su diferenciación final. Así como, las células de las neoplasias benignas

están diferenciadas hasta un punto que se corresponde estrechamente con el de las

células de las que derivan, en las neoplasias malignas pueden observarse distintos

grados de diferenciación:

o neoplasia maligna diferenciada (cuando una proporción importante de las

células que la forman alcanzan la maduración propia del tejido de origen)

o neoplasia maligna pobremente diferenciada (cuando las células tumorales

muestran grados intermedios de maduración)

o neoplasia maligna anaplásica (cuando la indiferenciación es de tal grado que se

hace dificil morfológicamente identificar el tejido de origen).

Todos los tumores, benignos y malignos, poseen dos componentes básicos: 1­

células proliferantes neoplásicas que constituyen el parénquima tumoral y 2- estroma de

soporte formado por tejido conectivo y vasos sanguíneos. Las células neoplásicas, al igual

que las normales, interaccionan con los tejidos de sostén e inducen la formación deestroma. Los tumores desarrollan un estroma vascular mediante la secreción de factores

angiogénicos. La capacidad del tumor de inducir y mantener su aporte vascular

representa un factor fundamental para su crecimiento. Una masa tumoral, por tanto,

contiene células neoplásicas genéticamente anormales y un componente de tejidos desostén normales.

introducción 12

En los cánceres de origen epitelial, o carcinomas, como el estudiado en el presente

trabajo, suele haber una distinción clara entre parénquima y estroma fácilmente

identificable histológicamente. Los cánceres de origen conectivo, o sarcomas, se originan

generalmente en uno de los tipos celulares mesenquimáticos y las células neoplásicas

proliferan entre las demás células conectivas por lo que la distinción morfológica entre

parénquima y estroma puede no ser tan neta.

CARCINOGÉNESIS

Es ampliamente aceptado que la carcinogénesis es un proceso de pasos múltiples

que involucra una serie de alteraciones genéticas y epigenéticas, las cuales actúan

activando oncogenes e inactivando genes supresores de tumor. Esas mutaciones se

acumulan en las células y llevan al cambio de su comportamiento, de un crecimiento

normal a uno sin restricciones, el cual puede conducir a Ia invasión del tejido circundante

y a la producción de metástasis (Wu y Pandolfi, 2001). Este proceso de pasos múltiples

ha podido ser identificado en observaciones clínicas, epidemiológicas y experimentos delaboratorio.

Sorprendentemente, el intrincado proceso que implica la iniciacióny la progresión de

un cáncer, depende de la acumulación de mutaciones que guardan semejanzas

asombrosas entre las distintas variantes tumorales. Aunque las neoplasias son muy

diferentes de acuerdo con el tejido donde se originan, la localización anatómica o su

manifestación clínica, los daños moleculares que las iniciaronsuelen ser similares.

Los cambios genéticos más tempranos que ponen en marcha la carcinogénesis

dependen de factores ambientales -a veces alteraciones intrínsecas heredadas- y, al

parecer, fomentan la inestabilidad de todo el genoma. Por Io general se acepta que las

neoplasias tienen un origen clonal. Mientras se expande la población derivada de la

primera célula portadora de daños genéticos irreparables, se van acumulando nuevas

alteraciones en genes específicos, que confieren ventajas adaptativas para proliferar

indiscriminadamente y finalmente, invadir los tejidos normales vecinos.

o Agentes Carcinggénicos

La correlación entre carcinogénesis (la generación de cáncer) y mutagénesis (Ia

producción de un cambio en la secuencia de ADN)está clara para tres tipos de agentes:

introducción 13

los carcinógenos químicos (que habitualmente causan simples cambios en la secuencia

de nucleótidos), las radiaciones ionizantes, como los rayos X (que típicamente causan

roturas de cromosomas y translocaciones) y los virus (que introducen en las células ADN

ajeno).

Ya que en éste trabajo se utilizó un carcinógeno químico analizaremos éstos endetalle.

El origen de los carcinógenos químicos es variado; algunos son productos naturales,

presentes en vegetales, microorganismos y combustibles fósiles, mientras que otros son

productos sintéticos industriales o, inclusive, utilizados en Ia medicina. Estos carcinógenos

forman uniones covalentes con muchos elementos celulares, aunque es la interacción

directa con el ADNla que se asocia con la capacidad de inducir tumores a través de sus

propiedades mutagénicas. Los agentes alquilantes y acilantes se comportan como

carcinógenos directos, el resto de las sustancias identificadas son pro-carcinógenos y

requieren de su activación metabólica en el organismo.

Se considera que la transformación neoplásica inducida por carcinógenos químicos

sigue una serie de pasos, donde los linajes sucesivos de una población celular sufren

exposiciones repetidas a agentes iniciadores y promotores de cáncer. Los carcinógenos

químicos iniciadores son mutagénicos y sus acciones son irreversibles, mientras que los

promotores no alteran al ADNy sus efectos en ausencia de células iniciadas se revierten

después de un tiempo. Los agentes promotores estimulan la proliferación celular y en

general por si mismos son solo hiperplasiantes, pero en presencia del gen mutado por

acción del agente iniciadoro mutagénico favorecen su expresión.

La iniciación y la promoción forman parte del periodo pre-neoplásico de Ia

transformación cancerosa, en el cual la población celular altera su recambio, pero el

proceso todavía puede revertirse si cesa la exposición a los agentes carcinogénicos.

En un determinado momento, cuando se acumulan los cambios genéticos

suficientes, tiene lugar la conversión neoplásica. La población celular entonces adquiere

un crecimiento descontrolado y autónomo, que ya no se revierte aun con la desaparición

de los factores causales (tabla 1) (Nowell, 1986; Root-Bernstein, 1992).

introducción 14

CÉLULA NORMAL

. . .. Exposición a carcinógenos iniciadores1- '"'°'a°'°" CELULAINICIADA

.. Exposición crónica a carcinógenos promotores2- Pr°m°°'°" LESIÓNPRENEOPLASICA

., Cambios genéticos suficientes3- C°"Ve'5'°" NEOPLASIABENIGNAo lNsrru

Inestabilidad genómica, cambios adaptativos,selección de subpoblaciones

NEOPLASIA INVASIVA

Inestabilidad genómica, cambios adaptativos,selección de subpoblacionesCANCER METASTASICO

4. Progresión

TABLA 1

Serie de cambios acumulativos involucrados en la carcinogénesis y la progresión neoplásica.

o Modelos paradigmáticos en el estudio dela carcinggénesis

Cada tipo de cáncer humano en que se ha estudiado el proceso carcinogénico

reveló múltiples alteraciones genéticas que involucraban la activación de distintos

oncogenes y la pérdida de dos o más genes supresores. Cada una de esas alteraciones

representa un paso crucial en la progresión de un tejido normal a uno tumoral. Existen dos

ejemplos ya clásicos y paradigmáticos en la literatura científica. Estos han aportado

muchos datos y siguen haciéndolo, en el avance del entendimiento de la patogenia del

cáncer. Es relevante el hecho de que en esos modelos se correlacionan

morfológicamente y molecularrnente los distintos pasos de Ia tumorigénesis.

Uno de ellos es modelo de la carcinogénesis de cáncer de colon humano. En el

cáncer de colon las mutaciones que inactivan al gen APC (Adenomatous Polyposis Coli)

parecen ser las primeras, o al menos corresponden a una etapa muy temprana. Pueden

ser detectadas en pequeños pólipos adenomatosos benignos con la misma frecuencia

elevada que en los tumores malignos. Su efecto sería el de incrementar la velocidad de

proliferación en relación a la velocidad de pérdida de células, sin afectar Ia forma en que

las células se diferencian o los detalles del patrón histológico. Las mutaciones que activan

al oncogén ras ocurren un poco más tarde, son raras en los pólipos pequeños pero son

comunes en los grandes que ya presentan alteraciones en la diferenciación celular y en el

patrón morfológico, si bien mantiene sus signos morfológicos de adenoma. Las

mutaciones en DCC (delecionado en carcinoma de colon) y en p53 se producen más

tarde. Son raras en pólipos pero comunes en tumores malignos. La pérdida de p53 nativa

libera a las células mutantes de sus últimas inhibiciones. No solo proliferan libremente sin

control sino que también acumulan más mutaciones a rápida velocidad dado que

progresan en el ciclo celular cuando no están preparadas para hacerlo. El resultado

morfológicoes un adenocarcinoma (Fearon y Vogelstein, 1990).

El segundo ejemplo es uno de los modelos mejor establecidos de tumorigénesis: Ia

carcinogénesis experimental en la piel de ratón. La aplicación secuencial de carcinógeno,

seguida por el tratamiento con un promotor no carcinogénico pueden inducir eficazmente

tumores de piel. Ese esquema de cancerización ha permitido establecer 3 etapas en el

desarrollo tumoral: iniciación, promoción y progresión (Yuspa, 1998; Akhurst y Balmain,

1999).

En este modelo, la iniciación se produce por aplicaciones tópicas de una dosis

simple sub-carcinogénica de 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA).El tratamiento causa

un daño irreversible en el ADN, que resulta en la mutación del onoogen Ha-ras de las

células epidérmicas (Quintanilla y col., 1986; Bizub y col., 1986). La promoción se realiza

con aplicaciones repetidas de una sustancia promotora para la piel, las mas comunes son

los ésteres de forbol como el 12-O-tetradecanoyl-forboI-13-acetato (TPA). Aunque la

mayoria de los promotores tumorales no se unen covalentemente al ADN y no son

mutagénicos per se, ellos producen una sen'e de cambios celulares y bioquímicos como

por ejemplo el aumento de la actividad de la proteína quinasa C (PKC), el aumento de Ia

expresión del factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), y los factores de

transcripción c-Jun y c-Fos, los cuales tienen una conexión directa con la regulación del

crecimiento y diferenciación celular (Yuspa, 1998). Esto conduce a una expansión cional

selectiva de las células epidérmicas iniciadas y lleva a la formación de múltiples

papilomas. La etapa de progresión es generalmente un proceso espontáneo,

caracterizado por inestabilidad genómica, en particular las alteraciones cromosomales

identificadas en el modelo resultan en una elevada expresión de los genes que codifican

Ha-ras y la ciclina D1 y la pérdida de la expresión del gen supresor de tumor p53 (Kemp y

co|., 1993a; Kemp y col., 1993b) (figura 2).

Estos cambios le confieren a las células del papiloma una ventaja de crecimiento, y

lo llevan a su conversión en un carcinoma escamoso. Este estado se asocia con cambios

en los marcadores de diferenciación epitelial, como una disminución en la expresión de E­

caden'na, queratina K1 y un aumento en la expresión de la integrina (16134(Cano y col.,

1996).

El modelo de carcinogénesis de piel de ratón ha permitido establecer la relación

introducción 16

entre los cambios genéticos y las etapas histológicas de la carcinogénesis y actualmente

sirve de modelo para estudiar la función de muchos otros genes moduladores de este

proceso. Por ejemplo, al tratar con DMBAy TPA ratones deficientes en la ciclina D1 se ha

observado una disminución en el desarrollo de tumores, demostrando que esa ciclina es

un blanco importante de Ha-ras en Ia tumorigénesis de piel (Robles y col., 1998). También

utilizando ratones deficientes genéticamente para la proteína p53 se ha observado una

conversión mas rápida de papiloma a carcinoma revelando la importancia de p53 en el

proceso (Kemp y col_, 1993b).

DMBA TPA

células _c'éllulasepiteliales in¡ola d a s

carcinomal papiloma de Células

¡"má l _ escamosas

en H-ras ciclina D1 p53alteración mutación sobreexpresión inativación

FlGURA 2

Esquema de los distintos pasos característicos en el modelo de carcinogénesis química de la piel de ratón(Wu y Pandolfi, 2001).

o Factores de crecimiento y cáncer

Los organismos multicelulares poseen mecanismos finamente regulados para

controlar la interacción entre células. Esa compleja red de señalización regula el

desarrollo embriológico normal y es responsable de la respuesta sistémica a heridas e

infecciones. Los distintos elementos proteicos que participan en los mecanismos de

transducción de señales celulares se localizan, de acuerdo con su función, en distintos

compartimientos celulares. El extracelular para los factores de crecimiento, la membrana

plasmática, en el caso de muchos receptores, el citoplasma para diferentes proteínas

quinasas o el núcleo celular, para los factores transcripcionales que regulan en forma

directa la expresión de los genes.

En esa compleja red de señalización donde se cruzan diversos tipos de moléculas

señal incluyendo proteínas, pequeños péptidos, aminoácidos, nucleótidos, esteroides,

retinoides, derivados de ácidos grasos e incluso gases disueltos, se encuentran los

factores de crecimiento (FC). Es difícil buscar una definición de FC mas allá de Io que

implica su nombre, que describe su función. Pero entonces resulta útil recordar elcomienzo del desarrollo de los cultivos celulares. Cuando se cultivaban células de

mamíferos solo era posible el crecimiento -aún en medios que incluían glucosa,

introducción 17

aminoácidos y vitaminas- cuando se añadía suero. Luego de un tiempo se demostró que

los componentes fundamentales que aportaba el suero eran proteinas muy específicas a

las que se llamó factores de crecimiento (Pollack, 1981). Esas proteínas tienen en común

el poseer receptores de membrana, en general se sintetizan como precursores, son de

bajo peso molecular y poseen efecto biológico a muy bajas concentraciones (10'g a 10'11

M).

Desde el descubrimiento del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)

(Westermark y Heldin, 1991) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Carpenter,

1981) se han identificado una gama muy amplia de factores que afectan al crecimiento de

los diversos tipos celulares. Estos factores pueden actuar modulando positiva o

negativamente Ia proliferación y diferenciación celular. La interacción de factores de

crecimiento, citoquinas y hormonas, con sus receptores desencadenan una cascada de

señales bioquímicas intracelulares que resultan en la activación o inactivaciónde diversos

genes. Las alteraciones genéticas en las vías de señalización de factores de crecimiento

están ligadas al desarrollo de diversas patologías. La relevancia de los distintos sistemas

de transducción en el control del “comportamiento social" en los organismos multicelulares

queda de manifiesto en las anomalías relacionadas al rembio celular que afecta a los

tejidos cancerosos.

Cuando una célula capta una señal de su entorno, luego de integrarla la transmite al

núcleo, donde se desarrollará la respuesta. Por ejemplo, para las señales mitogénicas

mediadas por factores de crecimiento el estímulo pone en marcha Ia duplicación del ADN

y la progresión del ciclo celular.

Existen varias clasificaciones para los FC. Se los puede agrupar en base a los

receptores con los que interactúan y el tipo de acción que desencadena su receptor, o sea

por el mecanismo de transducción de la señal. En otros casos se los relaciona con

distintos oncogenes, y se clasifican los proto-oncogenes que codifican FC de acuerdo a

como se descubrieron. También se los clasifica estrictamente en familias de acuerdo a la

homología en sus secuencias proteicas. Brevemente reseñaremos los principales factores

de crecimiento relacionados con la carcinogénesis.

o Familias de factores de crecimiento relacionadas al cáncer

1. Factor de crecimiento epidérmico y Factor de crecimiento transformante-a

introducción 18

El EGF es un polipéptido que estimula proliferación y diferenciación de diversos tipos

celulares in vivo e in vitro (Carpenter, 1981), mientras que el factor de crecimiento

transformante-a (TGF-a) es un mitógeno que fue aislado originalmentede sobrenadantes

de cultivos de fibroblastos transformados y comparte un 40% de homología en su

secuencia con el EGF (Massague, 1983). Ambos están ampliamente distribuidos en

tejidos humanos (Kajikawa y col., 1991) y se unen y activan al receptor del EGF (EGFR),

una proteína quinasa. El EGFR está codificado por el oncogén c-erbB (Downward y co|.,

1984). El EGF, el TGF-a y el EGFR se expresan ampliamente en células tumorales y

actúan en forma autócrina señalizando procesos tumorales (Hunter, 1984). Por ejemplo,

se ha reportado expresión de EGF y TGF-a en células de cáncer gástrico(Yoshida y col.,

1989a; Yoshida y col., 1990a) y expresión de EGFR en carcinomas de mama, laringe y

esófago entre otros (Yoshida y col., 1990b).

2. Factor de crecimiento transformante-B

Es miembro de una familia de al menos 5 citoquinas relacionadas estructuralmente,

(factor de crecimiento transformante-B, TGF-B 1 al 5), que producen respuestas biológicas

pleiotrópicas en diversos tipos celulares (Massague, 1990). Actualmente se sabe que esta

super-familia incluye varias formas de TGF-B, las proteínas morfogenéticas de hueso, y

las activinas, entre otros factores relacionados estructuralmente (Massague, 1998).

El TGF-B1, el primero de la familia en ser descubierto y el mas estudiado, se

describió originalmente como un factor que causaba transformación en células de riñón de

rata. Hoy se sabe que su efecto en muchos tipos celulares por el contrario es inhibitorio

(Moses y col., 1990). Se ha observado expresión de TGF-B en distintos tipos de

carcinomas, como por ejemplo los de pulmón, colon, mama y estómago (Derynck y col.,

1987; Yoshida y col., 1989b).

3. Factor de crecimientoderivado de las plaquetas

El PDGF fue uno de los primeros en ser caracterizado y relacionado con el cáncer.

Es un mitógeno muy potente para células de origen mesenquimático incluyendo

fibroblastos, células de músculo liso (Westermark y Heldin, 1991), y algunas células

neurogliales. Existen 3 subtipos, el proto-oncogén c-sis codifica la cadena B del PDGF.

Hace tiempo se ha descripto que diversos tumores humanos Io producen, por ejemplo

introducción ¡9

gliomas y carcinomas de colon (Tsuda y col., 1989b). También se ha observado que

algunos tumores expresan los receptores para PDGF y allí se observa estimulación

autócrina por parte del factor (Tsuda y col., 1989b).

4. Factor de crecimiento similar a insulina

El factor de crecimiento similar a insulina (IGF) es un polipéptido con alta similitud

estructural a la pro-insulina y existen por lo menos 2 tipos (IGF-1, IGF-2). Estimula

supervivencia y metabolismo celular e interactúa con otros factores en la estimulación de

la proliferación celular. Se ha reportado su expresión en carcinomas de mama, colon y

liposarcomas (Tn’coliy col., 1986; Cullen y col., 1990).

5. Factor de crecimiento fibroblástico

Los factores de crecimiento fibroblástico (FGFS) han sido descriptos como

estimuladores del crecimiento de fibroblastos y células epiteliales (Goldfarb, 1996). La

familia de los FGFs está formada por moléculas señalizadoras que participan en la

regulación de una amplia gama de funciones celulares (crecimiento, sobrevida, apoptosis,

motilidad, diferenciación), influyen en una gran variedad de procesos biológicos

(desarrollo, angiogénesis, metabolismo, reparación de heridas) en organismos muy

diversos, desde los gusanos hasta el ser humano (Jeffers y col., 2002). La secuencia del

FGF se ha conservado notablemente a Io largo de la evolución de los vertebrados. La

mayor parte de los FGFs presentan mas de un 90% de homología en la secuencia

principal (core) de Ia proteína en los mamíferos y mas de un 83% de identidad entre los

vertebrados (Coulier y co|., 1997).

La familia de FGFs humanos está compuesta por 22 miembros (Jeffers y col.,

2002). Cada uno posee una secuencia conservada de 120 aminoácidos en el dominio

central y pueden organizarse en 6 gmpos de acuerdo a su relación filogenética (Kim,

2001). Muchos de ellos tienen nombres alternativos debido a las diferentes circunstancias

en que se dieron sus descubrimientos.

Existen 9 miembros de la familia bien caracterizados, de los que se conoce que

comparten homología en el dominio principal de la molécula de entre un 30 a un 65%.

Estos factores se almacenan en la membrana basal unidos a heparina y esto los

protege de la degradación por enzimas proteolíticas, haciendo así posible la existencia de

introducción 20

un reservorio de FGF. Se liberan por clivaje enzimático de los componentes de la matriz

extracelular (MEC)a través de proteasas o heparanasas.

Del FGF-3 al 9 se sabe que son secretados constitutivamente y en la mayoría de los

casos son glicosilados (Goldfarb, 1996). Su secuencia homóloga, el core de 120

aminoácidos, es la responsable de una estructura terciaria en común entre los FGFs así

como de la habilidad de los FGFs de unirse con alta afinidad a glucosaminoglucanos

(GAG) como la heparina o el heparán sulfato (Shing y col., 1984; Burgess y col., 1986;

Faham y col., 1996).

Los péptidos mejor caracterizados son el FGF básico y ácido (b-FGF y a-FGF

respectivamente). Comparten la mayoría de las características de la familia pero difieren

del resto de los FGFsen que no presentan una secuencia consenso de secreción celular

(en la sección II-a se continúa con los antecedentes sobre b-FGF y su relación en

procesos carcinogénicos).

Ya hemos mencionado que un elemento de suma importancia en la patogenia del

cáncer es la alteración en el control de la proliferación celular, por lo tanto los FGFS, al

igual que otros factores de crecimiento, están involucrados en la tumorigénesis. Es asi

que trabajos con células de mamíferos inmortalizadas revelaron que distintos FGFs son

capaces de inducir desregulación en el crecimiento y transformación de esas células in

vitro y resultaron tumorigénicas al implantarlas en animales inmunosuprimidos (Taira y

col., 1987; Matsumoto -Yoshitomi y col., 1997; Ropiquet y coI., 1999; Jeffers y col., 2001).

La sobre-expresión de FGFs mitogénicos en animales transgénicos induce hiperplasia así

como tumores malignos y benignos. Animales transgénicos para FGF-8 han desarrollado

neoplasias de glándulas salivales e hiperplasia ovárica (Daphna-Iken y co|., 1998). De

carcinomas gástricos humanos se ha aislado el gen hst-1 (FGF-4) (Yoshida y col., 1987).

Este gen y el del FGF-3 están amplificados en cánceres de esófago (Tsuda y col., 1989a).

6. Factor de crecimientode endotelios vasculares

El factor de crecimiento de endotelios vasculares (VEGF)comparte homologia en su

secuencia aminoacídica con el PDGF (Keck y col., 1989). Promueve la formación de

vasos sanguíneos en el desarrollo embrionario (vasculogénesis) y luego del desarrollo en

diversos procesos fisiológicos como por ejemplo la reparación de heridas y los estados

inflamatorios crónicos. Cumple un rol preponderante en la angiogénesis tumoral y se ha

estudiado su expresión en variedad de tumores humanos (Salven y co|., 1998). (en la

introducción 21

sección ll-b se analizaran más detalles sobre la actividad de éste factor).

o Receptores de factores de crecimiento

Los mecanismos por los cuales una célula influye sobre el comportamiento de otra

implicanun sistema de transducción de señales desde la célula productora del estímqu a

la célula blanco. Sea cual fuere la naturaleza de Ia molécula señal, la célula blanco

responde mediante un receptor específico. Este puede ubicarse en distintos

compartimientos celulares. En la superficie celular se conocen tres clases de proteínas

receptoras. Ellas son las asociadas a canales iónicos, las asociadas a proteínas G y las

asociadas a enzimas. Los receptores asociados a enzimas, son proteínas transmembrana

cuya región de unión al Iigando se halla en el dominio extracelular. Poseen un dominio

citosólico que tiene actividadenzimática o están asociados a una enzima.

Existen 5 tipos de receptores asociados a enzimas:

Los receptores guanilato ciclasa.

Los receptores tirosina quinasa.

Los receptores asociados a tirosinas quinasas.

Los receptores tirosina fosfatasa.

.U‘PP’.“ Y los receptores serina-treonina quinasa.

Los receptores para Ia mayoría de los factores de crecimiento descriptos son

proteínas transmembrana que presentan actividad de proteína tirosina quinasa específica

(Clark y col., 1992). La primera proteína receptora que se reconoció que presentaba esa

actividad fue el receptor del EGF y luego se describió la misma actividad para el receptor

del PDGF, de los FGFs, y el lGF-1. En cada caso los receptores se fosforilan a si mismos

para iniciar la cascada de señalización intracelular.

Una excepción la constituyen los receptores de la superfamilia de los TGF-B , estos

receptores son proteínas que atraviesan una vez la membrana plasmática y poseen

dominios serina-treonina quinasa sobre la cara citosólica de la membrana.

introducción 22

INTERACCIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA

Aproximadamente el 90% de los cánceres humanos son carcinomas, quizás porque

la mayor parte de la proliferación celular del cuerpo se produce en los epitelios, o quizás

porque los tejidos epiteliales están expuestos mas frecuentemente a las diversas formas

de lesión fisica y química que favorecen el desarrollo del cáncer (lngber, 2002). Resulta

entonces que uno de los abordajes de interés para el estudio de la biología de los

carcinomas sea desde Ia perspectiva de la ruptura de Ia interacción epitelio-mesénquima

(figura 3). Estas interacciones han sido profundamente estudiadas en el desarrollo del

embrión, donde cobran su máxima expresión. En los embriones, la activa interacción

entre los tejidos vecinos conduce la epiteliogénesis y determina las características

tridimensionales del tejido. Las interacciones epitelio-estroma también juegan un rol clave

en el control de la angiogénesis en el estroma circundante y guían la formación de la

vasculatura funcional requerida para alimentar al órgano en crecimiento. La MEC que se

acumula a lo largo de la interfase epitelio-mesénquima como resultado de esas

interacciones es un elemento crítico en el control del proceso de desarrollo.

FIGURA 3

Mmm«¡o Esquema descriptivo de lascolngcnn

principales caracteristicas del tejido(nnilm .

conectivo normal subyacente a unMim Plnstu‘a . _ . . .

. epitelio celular. Esta oonsüturdo, en sumastocno

mayor parte, por una matriz extracelularglucosummoglutnnns.

prolcoglucanos vglucoprolemas

tejidoconectivo

que es secretada por los fibroblastos.

"361187 '

La génesis del tipo de tejido epitelial característico (acinar, tubular, simple o

estratificado) es determinada a través de complejas interacciones entre el epitelio y su

tejido mesenquimático subyacente en el embrión (Dodson y Hay, 1971; Banerjee y col.,

1977). Estudios en distintos tipos tisulares embriogénicos en donde se aisló el epitelio del

mesénquima y luego se han vuelto a combinar heterotópicamente revelaron que la

precisa forma tridimensional del tejido es determinada por el tipo de mesénquima,

(histodiferenciación) (Sakakura y coI., 1976). En contraste la producción específica de un

tipo epitelial es gobernada por el mismo epitelio (cfiodiferenciación).

introducción 23

En condiciones normales los órganos están formados por tejidos que intercambian

información entre los diversos tipos celulares por medio de la comunicación célula-célula,

las citoquinas y la MEC. La MEC es producida en colaboración entre fibroblastos

estromales y células epiteliales, para proporcionar andamiaje estructural para las células

así como información contextual. La vasculatura endotelial provee nutrientes y oxígeno,

mientras que el sistema inmune combate patógenos y remueve células apoptóticas.

Las células epiteliales se asocian en hojas embrionarias polanzadas continuas y se

comunican a través de una compleja red de interconexiones: fisicas, a través de contacto

directo, por medio de la MEC, o por conexión bioquímica mediante moléculas

señalizadoras solubles e insolubles. En combinación, estas interacciones proveen Ia

información necesaria para mantener el proceso de proliferacióny diferenciación oelular y

crear estructuras tisulares complejas (Bissell y Radisky, 2001).

En los organismos adultos las interacciones epitelio-conectivo se mantienen en la

misma dirección aunque en actividades menos intensas. En condiciones patológicas, las

señales intercelulares que definen el contexto normal pueden ser modificadas.

La superficie basal de las células epiteliales asociadas con la membrana basal, una

forma especializada de la MEC, provee soporte estructural y señales de polarización

epitelial (Schwartz y Baron, 1999; Giancotti y Ruoslahti, 1999). Dependiendo de la

composición y características fisicas de la membrana basal, diferentes factores solubles

que interactúan con ella pueden tener efectos celulares completamente diferentes sobre

la proliferación celular, arresto del crecimiento, diferenciación o apoptosis (Radisky y col,

2001).

Otras condiciones patológicas diferentes a la cancerización modifican

temporariamente Ia interfase epitelio-conectivo. También modifican el proceso de

carcinogénesis si este coexiste con ellas. Por ejemplo, Ia pérdida patológica de la

continuidad del epitelio produce aumento de su proliferación, activación de fibroblastos

mesenquimales y neovasculan'zación, tal como sucede en la reparación de heridas.

Normalmente esta condición es temporaria y reversible, pero cuando la inflamación es

sostenida, se desencadena un proceso automantenido. Bajo condiciones inflamatorias

persistentes el aumento en la expresión de enzimas como metaloproteasas dada por

fibroblastos estromales, puede conducir a una alteración en el equilibrio de la MEC y su

vez las células inmunes infiltrantes pueden aumentar la producción de factores que

promueven la proliferación celular. Si el proceso continúa, la organización normal del

órgano es reemplazada por un desorden funcional. Si dentro de este contexto de cambio

introducción 24

hubiese células epiteliales pre-existentes que posean un potencial tumorigénico, es decir

células iniciadas, podrían comenzar a proliferar, produciéndose así la promoción tumoral.

Alternativamente las interacciones anormales pueden conducir a inestabilidad genómica

dentro de las células epiteliales y a la adquisición de un fenotipo pre-neoplásico o

directamente neoplásico (Bissell y Radisky, 2001).

Si bien las características mas distintivas de las neoplasias malignas son su

descontrol en la proliferación y su capacidad invasiva, visto desde la perspectiva de las

interacciones parénquima-estroma el cáncer no es solo una patología celular. Al aumento

del crecimiento, se suman la pérdida de la histoarquitectura normal, la ruptura de los

límites tisulares normales, los cambios estromales, el proceso angiogénico, y el

compromiso de órganos distantes a través de la diseminación metastásica. El cáncer

debe ser visto como resultado de la desregulación de un proceso coordinado que

gobierna normalmente a las células individuales integradas en un tejido, ese tejido

integrado en un órgano y este en un organismo funcional vivo (Ingber y Jamieson, 1985).

imroducción 25

CÁNCER DE CABEZA Y CUELLO: CÁNCER BUCAL

Bajo la denominación de cáncer de cabeza y cuello (CCC) se agrupan tumores de

muy diversa histologia y ubicación anatómica variada que tienen en común pertenecer al

tracto aero-digestivo superior (TADS) (Dawson y Okamura, 1990). El TADS está revestido

por una mucosa con variaciones según la anatomía a la que corresponde, pero con

respuesta común a diversos carcinógenos ambientales.

La tasa de incidencia de CCC, estandarizada por edad, para hombres, excede

30/100000 en regiones de Francia, Hong Kong, el subcontinente Indio, Europa central, del

este y del sur, regiones de Sudamérica y entre los hombres negros de USA. Entre las

mujeres, la tasa excede 10/100000 en India y Hong Kong (Nagpal y Das, 2003).

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (CCECC) y el carcinoma de

células escamosas bucal (CCEB) presentan un patrón de carcinogénesis y evolución en

común, es por ello que recurrentemente en la literatura se menciona indistintamente a uno

u otro si bien existen datos clínicos y/o experimentales generales y particulares.

CÁNCER BUCAL

o Epidemiolggía y Etiolmía

Los procesos malignos bucales representan un 3% de los canceres diagnosticados

en hombres y el 2% en mujeres en todo el mundo. Por año se diagnostican alrededor de

500000 sos nuevos de cáncer bucal y faríngeo a nivel mundial.Tres cuarta partes de

ellos provienen de países en vías de desarrollo (Nagpal y Das, 2003).

El CCEB representa mas del 95% de los cánceres de la cavidad bucal (Roder y

Wilson, 1983; Chen y col., 1991; Muir y Weiland, 1995; Ostman y coI., 1995) y ocupa el

sexto lugar entre las neoplasias malignas mas frecuentes (Nagpal y Das, 2003). Es una

de las mayores causas de morbilidaden el mundo y la tasa de sobrevida, menor al 50%,

no ha mejorado en las últimas dos décadas (Vokes y col., 1993). Esta tasa de sobrevida

es más pobre que la conocida para cáncer de cérvix, próstata, vejiga, melanoma y

Enfermedad de Hodgkin (Winn y col., 1998). Los problemas funcionales y cosméticos que

acarrea el paciente de cáncer bucal y faríngeo luego del tratamiento son muy frecuentes e

importantes.

La incidencia de cáncer oral difiere ampliamente según los hábitos de consumo de

tabaco prevalentes en diversos países del mundo. Aumenta considerablemente en las

introducción 26

sociedades donde el consumo importante de tabaco comienza a una edad temprana y

continua a lo largo de la vida del individuo. Debido a la diferencia en los hábitos de

consumo de tabaco, en muchas partes del mundo el cáncer de boca es el mayor

problema de salud. Así se observa que en el sub-continente lndio y en diversas zonas de

Asia, debido no solo al hábito de fumar sino al de mascar betel o nuez de areca, en esas

regiones aun hoy el cáncer de boca es una de las formas de cáncer mas frecuentes entre

todos los de la economia (Moore y col., 2000).

En USA, un 35.2% de los cánceres intrabucales se localizan en lengua y el 64.8%

restante correspOnde a otras localizaciones intrabucales (Moore y col., 2000). Todos ellos

tienen en común su etiología, y características clinicas e histológicas (Mashberg y col.,

1989).

La incidencia de CCEB es mayor en hombres que en mujeres y la ocurrencia de su

aparición aumenta con la edad con un pico en la sexta y séptima década de vida (Krollsy

Hoffman, 1976; Chen y col., 1990; Jensen y col, 1990). Estas tendencias varían según de

la población de referencia.

En particular, respecto de la República Argentina, se puede decir que los únicos

datos epidemiológicos controlados existentes son los pertenecientes a los estudios del

grupo Matos (Matos y col., 1997) utilizados en el reporte de Moore, 2000. Se conocen,

además, datos de centros especializados en patología Oral, como los servicios de

Patología y Estomatología de la Facultad de Odontología de la Universidad de Buenos

Aires. Estos datos coinciden en su mayoria con los reportados para América Latina y

ciertas regiones de Europa y USAen cuanto a incidencia entre los demás cánceres de la

economía, edad de aparición y frecuencia por sexo.

Etiología

El proceso de carcinogénesis en el cáncer de cabeza y cuello es complejo e

involucra interacciones dinámicas entre diversos factores (McCoy y col., 1980; Decker y

Goldstein, 1982; Cann y col., 1985; Baden, 1987). Aproximadamente el 90% del CCC

ocurre luego de la exposición a carcinógenos conocidos para el tracto aero-digestivo

superior. De esos carcinógenos los principales son el tabaco, el alcohol y sustancias

den'vadas o relacionadas con ellos corno las hojas de betel. El uso del alcohol esta

estrechamente relacionado al del tabaco. Pertenece al grupo de agentes que potencian la

carcinogénesis por tabaco. Otros factores etiológicos importantes son: virus,

predisposición genética, ocupación, exposición a la radiación solar (para el caso del

introducción 27

cáncer de labio) y Ia dieta alimentaria (Holland y Frei, 2000).

I) Tabaco y alcohol

Se ha descrito que el consumo habitual de tabaco en sus diversas formas,

principalmente cigarrillos, puros, tabaco en pipa, rapé, y tabaco de mascar es el factor

mas importante asociado con la transformación de las células epiteliales de la mucosa

bucal. Los datos epidemiológicosseñalan que 8 de cada 10 pacientes con cáncer de boca

habían sido fumadores durante mucho tiempo (Hays y col., 1995; Sapp y col., 1998). El

tabaco inicia un efecto carcinogénico dosis-respuesta lineal, en el cual, más importante

que la intensidad de la exposición, es la duración de la misma. La mayor actividad

carcinogénica del cigarrillo reside en la fracción particulada (alquitrán) que contiene una

compleja mezcla de carcinógenos iniciadores y promotores que interactúan entre si.

Las localizaciones mas frecuentes del CCEB en los fumadores de cigarrillocoinciden

con las regiones que poseen mayor contacto con la saliva (que retiene los carcinógenos

del cigarrillo) la cual por efecto de la gravedad se acumula en la superficie lateral y ventral

de la lengua y en el piso de boca (Moore y Catlin, 1967).

Hay evidencias clínicas que indican que aproximadamente en 35% de los pacientes

que continúan fumando después del tratamiento del CCEB desarrollan una nueva lesión

en otro punto de la orofaringe, mientras que sólo entre el 6 y el 13% de los que dejaron de

fumar desarrollan nuevas lesiones (Sapp y col, 1998).

En países del sudeste Asiático y la India la población consume extensivamente

tabaco sin humo, en diversas formas, como el betel quid, el pan masala o el naswar entre

otros. En el sudeste asiático, debido a ello, el cánoer bucal en la mucosa de la mejilla

representa la principalzona de desarrollo de cáncer en comparación con la lengua y el

piso de boca, que son las principales zonas de incidencia de cáncer bucal en los paises

occidentales (Paz y col., 1997). También alli se consume tabaco con humo en forma de

cigarrillos al igual que en el resto del mundo.

El alcohol es un importante promotor de la carcinogénesis y es un factor que

contribuye, en al menos un 75% de los casos, al desarrollo de cánceres vías aero­

digestivas superiores (Bloty col., 1988).

Como factor independiente tiene un efecto moderado (Spitz y col., 1988). Diversos

estudios le adjudican distintos grados de riesgo dependiendo del tipo de bebida

alcohólica. La mayoría de los estudios reportan al etanol como el factor de mayor

introducción 28

relevancia (Kabat y Wynder, 1989). La mayor significancia clínica del uso y abuso de

alcohol se relaciona con el efecto potenciador sobre el efecto carcinogénico del tabaco.

il) Virus

Los virus han sido implicados en la patogénesis de carcinomas bucales, laríngeos y

nasofaríngeos (Hollinshead y col., 1973; Brachman y col., 1992).

Estudios sero-epidemiológicos en CCEB sugieren la participación del virus herpes

simple tipo 1 (HSV-1), que actuaría como mutágeno en el desarrollo de este cáncer. Se

han encontrado series de pacientes con CCEB que presentan niveles aumentados de

anticuerpos anti- HSV-1 del tipo lgA e lgM (Shillitoe y col., 1986), los cuales son de

significancia pronóstica. En otros estudios relativizan la importancia del HSV-1 dado que

el producto génico del virus aparece en los CCEB en casos aislados (Shillitoe y col.,

1986).

Por otra parte, mas recientemente se ha reportado asociación entre CCC y el virus

del papiloma humano -HPV- (Syrjanen y coI., 1988; Brandsma y Abramson, 1989;

Brachman y col., 1992). Los virus de la familia HPV son al menos 65 subtipos y han sido

extensamente estudiados en cáncer cervical y recientemente relacionados con otros

cánceres epiteliales. Los primeros estudios relacionan a los HPVs con el carcinoma

verrugoso, otra entidad menos agresiva que el CCE que se da en mucosa bucal. Estudios

inmunohistoquimicos realizados con antígenos de la cápside viralde distintos subtipos de

HPV (subtipos 6,11,16, 18) y estudios de hibridación ¡n sr'tu y PCR apoyan la asociación

entre HPVy Ia carcinogénesis bucal (Loning y coI., 1985; Syrjanen y col., 1988). Algunos

de estos estudios son controversiales dado el pequeño número de casos utilizados y el

hallazgo de expresión viral superpuesta entre CCEB y la mucosa bucal normal. Serán

necesarios nuevos trabajos con más sondas y acoplados a importantes análisis

epidemiológicos controlados para proveer datos más concluyentes sobre el rol de la

familia de los HPVsen la carcinogénesis bucal.

iii)Factor genético

Es poca y algo confusa la información bibliográfica existente sobre el rol de factores

genéticos en la etiología del cáncer bucal. Por ejemplo se ha observado un aumento en

los niveles de la enzima aril hidroxilasa, la cual activa a los hidrocarburos aromáticos

policiclicos (el mayor agente carcinógeno del humo del tabaco), en pacientes con cáncer

laríngeo (Holland y Frei, 2000). Por otra parte, se han reportado antígenos leucocitarios

introducción 29

en pacientes con CCC. Datos recientes de diversos grupos sugieren que pacientes con

CCECC presentan una sensibilidad aumentada a la exposición a agentes carcinógenos

(Spitz y col., 1988). Junto con los factores ambientales, los factores genéticos podrían ser

un componente útil para estudios cuantitativos en modelos de riesgo (Schantz y col.,

1990; Lippman y col., 1994).

iv) Ocupación

Aunque la exposición ocupacional probablemente juegue un rol menor en el

desarrollo del CCC, se reconoce su influencia en la producción de cáncer de la región

sinusal, en medio ambientes relacionados a refinerías de níquel o trabajadores del cuero

o la madera. No se ha encontrado otra relación entre factores ocupacionales y cáncer

bucal (Barton y Hogetveit, 1980; Cann y col., 1985).

v) Radiación

Las personas que están sometidas a una exposición ocupacional o recreativa

prolongada a la luz solar directa corren mayor riesgo de desarrollar CCE de labio. En este

caso al igual que en el cáncer de piel la carcinogénesis se asocia a la radiación ionizante

(rayos UV-B).

vr)Factores nutricionales

Existe considerable evidencia epidemiológi que sugiere que la vitamina A y el B­

caroteno juegan un rol protector en neoplasias epiteliales (McLaughlin y col., 1988). En

consecuencia las deficiencias en carotenos aparecen como un factor de riesgo para

cánceres de las vías aero-digestivas superiores. De todas maneras no se sabe cual o

cuales de los más de 500 carotenoides conocidos ejercen función de protección. Diversos

grupos han estudiado especificamente la relación entre vitamina A, B-caroteno, riesgo y

cáncer bucal (Henderson y co|., 1976; Winn y col., 1984). Por otra parte se suma como

factor de confusión a los estudios nutricionales el efecto del tabaco, dado que el

tabaquismo se asocia a una disminuciónen la dieta y los niveles séricos de carotenoides.

o Biología del cáncer bucal

El cáncer bucal es una neoplasia epitelial que generalmente comienza corno un

aumento focalizado del crecimiento en un grupo de células progenitoras cercanas a la

membrana basal que se expanden vertical y lateralmente, reemplazando al epitelio

introducción 30

normal.

Histológicamente suele producirse una secuencia de cambios epiteliales:

hiperplasia, displasia, carcinoma in situ, y finalmente carcinoma invasivo (Nagpal y Das,

2003). Todo este proceso esta asociado con acumulación de alteraciones genéticas.

Como en todas las neoplasias, la proliferación celular es excesiva y autónoma, no está

coordinada con el tejido ni con la división celular normal. A pesar del daño al ADN el ciclo

celular continúa, debido a la pérdida de los puntos de control del mismo. Finalmente esas

células neoplásicas llegan a los vasos linfáticosy hacen metástasis generalmente pn'mero

en los ganglios linfáticos locales y luego se inicia la diseminación metastásica general .

La carcinogénesis en diversos órganos y en la cavidad bucal en particular es un

proceso de pasos múltiples.Ese proceso involucra cambios biomoleculares que preceden

a lesiones pre-malignas las cuales a su vez preceden al cáncer invasivo (Bouquot y col.,

1988; Brennan y col, 1995). Ya hemos analizado in extenso el tema de la carcinogénesis

y definimos esquemáticamente las etapas de la carcinogénesis epitelial como: iniciación,

promoción y progresión. Aunque en las neoplasias humanas no es dable observar este

esquema tripartito, sirve como modelo para comprender los fundamentos biológicos y el

tratamiento de esta patología.

Carcinogénesis bucal: “Cancen‘zaciónde campo"

En el ya clásico trabajo de Slaughter (Slaughter y co|., 1953), se propuso Ia idea de

“cancerización de campo" en el cáncer bucal para explicar la carcinogénesis del tracto

aero-digestivo superior. La exposición repetida, de un área extensa de mucosa, a la

agresión carcinogénica (por ejemplo del tabaco y el alcohol) aumenta el riesgo de que ese

tejido desarrolle múltiples focos independientes pre-malignos y malignos (Slaughter y col.,

1953; Strong y col, 1984; Lippman y Hong, 1992). Slaugther et al propusieron su

concepto basados en las siguientes observaciones: a- el cáncer bucal se desarrolla en

áreas múltiples de cambios precancerosos b- el tejido que rodea al tumor presenta

alteraciones premalignas c- el cáncer bucal puede darse en forma multifocald- luego del

tratamiento quirúrgico, con alguna frecuencia se observa la ocurrencia local de segundos

tumores primarios. A partir de entonces, el concepto de campo cancerizado o “efecto de

campo" fue y es utilizado en el contexto de la existencia de procesos pre-neoplásicos en

sitios múltiples, a veces sin probar que esos procesos tengan evolución independiente. La

cancerización de campo ha sido descripta en: CCECC en la cavidad bucal, orofaringe y

laringe (Copper y col., 1993; Braakhuis y col., 2003), pulmón (Franklin y col, 1997),

introducción 31

esófago (Prevo y col., 1999), vulva (Rosenthal y col., 2002), cérvix (Chu y col., 1999),

colon (Jothy y col., 1996), mama (Forsti y col., 2001) y piel (Stern y col., 2002).

Existen reportes sobre análisis de mutaciones en p53 que proveen un soporte

molecular importante para el concepto de cancerización de campo (Chung y col., 1993;

Shin y col., 1994). Brennan y col. reportan asociación significativa entre el uso de tabaco y

alcohol con la alta frecuencia de mutaciones en p53 (Brennan y col., 1995). Esos

resultados preliminares sugieren que esas mutaciones ocurren en sitios no nativos de la

proteína p53, y sugieren un rol del tabaco en las alteraciones moleculares de amplias

regiones de la mucosa.

I)Alteraciones genéticas

Trabajos sobre estudios genéticos del modelo de Slaugther, analizando

microsatélites para la pérdida alélica de los loci cromosomales más relevantes, realizados

en lesiones pre-invasivas y benignas de cabeza y cuello de individuos consumidores de

tabaco, revelaron una pérdida cromosomal progresiva relativa a la gravedad de las

lesiones estudiadas (Califano y co|., 1996; Braakhuis y col., 2003). Se describió un

modelo para cáncer de cabeza y cuello, donde a cada paso histopatológico desde

hiperplasia a displasia, CIS y carcinoma invasivo le correspondían cambios genéticos

progresivos. Las áreas de tejido adyacente sin cambios morfológicos importantes

compartían cambios cromosomales con las lesiones severas, pero las áreas de displasia

severa o CIS exhibieron alteraciones genéticas adicionales (Califano y col., 1996). Otros

estudios clínicos apoyan el modelo de progresión genética con análisis de microsatélites y

señalan que permitirían identificar el riesgo de desarrollo de CCEB en un campo

cancerizado (Partn‘dgey co|., 2000). Recientemente se propuso al CCECC como modelo

de cancerización de campo para el estudio de este proceso a nivel general (Braakhuis y

col., 2003).

El grado de daño genético depende de la exposición al carcinógeno y de la

sensibilidad inherente de un tejido. Los cambios genómicos se acumulan,

presumiblemente en todo el tejido expuesto al carcinógeno. Las alteraciones genéticas al

azar indicadas por micro-núcleos, intercambios de cromátidas hermanas y aneuploidía

pueden ocurrir en la mucosa aero-digestiva normal, pre-maligna y maligna (Doseva y col.,

1984; Bijman y col., 1985; Lippman y col., 1990).

Se piensa que la carcinogénesis es regulada fundamentalmente por el balance

celular entre oncogenes y genes supresores. Esta relación dinámica esta bajo intenso

introducción 32

estudio en el CCECC (Lippman y col., 1995; Sidransky, 1997). La expresión aberrante

(amplificación o mutación) de familias especificas de oncogenes celulares como: myc, ras,

neu, bcl, int, ems-1, ciclina D1 y hst ha sido demostrada en la carcinogénesis del tracto

aero-digestivo (Gallick y col., 1986; Field y ool., 1989; Saranath y col., 1989; Lippman y

coI., 1995). Hasta un tercio de los casos de CCECC primarios presentan inactivación de

p16 por distintos y múltiples mecanismos que incluyen metilación, mutación y

translocación (Spandidos y col., 1985). Las familias de oncogenes: ras, neu, int-2 y myc

están amplificadas en los estadios más avanzados del CCEB, y la activación de estos

oncogenes in vitro altera la respuesta a agentes de diferenciación y promueven el

crecimiento celular descontrolado, aneuploidía y tumorigenicidad (Saranath y col., 1989).

La expresión del receptor del EGF esta amplificada en el CCECC y se ha sugerido como

un factor predictivo de comportamiento biológico agresivo (Liggett, Jr. y Sidransky, 1998).

De igual forma, se ha observado alta expresión de TGF-a en una variedad de tumores

(incluyendo cánceres bucales) y es frecuentemente acompañada por elevados niveles del

receptor del EGF particularmente (Wong, 1987; Grandis y Tweardy, 1993; Wong, 1993).

ir)Alteraciones enla diferenciación

La desregulación de la diferenciación es otro hito en el proceso de múltiples pasos

de la carcinogénesis. El epitelio bucal humano al igual que el del esófago es del tipo

escamoso estratificado. La mucosa bucal está completamente cornificada en la encia y el

dorso de Ia lengua, el resto de sectores intrabucales tienen distintos grados de

queratinización. Las citoqueratinas son una familiade al menos 19 proteínas filamentosas

de peso intermedio que van desde 40 a 68 kd y se expresan con distinto patrón, el cual se

correlaciona con los distintos grados de diferenciación epitelial (Nagle y coI., 1985;

Grandis y Tweardy, 1993). Estos patrones varian substancialmente en la carcinogénesis y

en los tumores. La distribución espacial de otras proteínas estructurales tales como la

filagn’na, las involucn'nas, transglutaminasa l y otros antígenos de diferenciación también

se observan alterados en displasias y carcinomas (ltoiz y col., 1984; Itoizy col., 1985; Itoiz

y col., 1986; Xu y col., 1995).

iii)Alteraciones en la proliferación.

La tercera fase importante de la carcinogénesis en etapas múltiples es la

desregulación de la proliferación. La transición de epitelio normal a hiperplasia y displasia

está asociada con un aumento de las células proliferantes de la capa basal que se

introducción 33

extiende a las suprabasales. Wejos ensayos histológicos han correlacionado este proceso

con el aumento en la frecuencia de figuras mitóticas; más recientemente análisis de

citometría de flujo para cuantificar cantidad de ADN y expresión de Ki-67 y del antígeno

nuclear de proliferación celular (PCNA) han revelado algunas correlaciones positivas, en

el epitelio del tracto aero-digestivo superior, para Ia proliferación anormal de Ia capa

suprabasal y distintos pasos de la carcinogénesis (displasia severa)(Carey y col., 1987;

Coltrera y col., 1990).

o Patología del cáncer bucal

Histología y prognosis

El diagnóstico histopatológico realizado por los patólogos incluye usualmente el

grado de diferenciación del tumor. Tradicionalmente la graduación tumoral se basa en un

criterio desarrollado hace mas de 50 años por Broder que indica en forma subjetiva la

mayor o menor cantidad de queratinización en los cordones tumorales (Broder, 1941;

Crissman y col., 1984). Si bien en general los tumores bien diferenciados son de mejor

pronóstico, Ia agresividad depende además de otros factores que condicionan el

comportamiento biológico (Broder, 1941; Snow y col., 1982). Esos factores incluyen el

tamaño tumoral, localización, vascularización, drenaje linfático y respuesta inmune del

individuo. La edad, sexo, y estado nutricional del paciente influyen también en el grado de

agresividad clinica.

Además del grado de diferenciación, las características consideradas en la

evaluación histológica incluyen las atipias citoplasmáticas y nucleares, el índice mitótico,

la respuesta inflamatoria.la respuesta vascular-estomal, la invasión vascular y el patrón

de invasión. Estas características tienen una correlación variable con el comportamiento

biológico tumoral. El grado de queratinización es el principal determinante en la

graduación de Broder (figura4). Con respecto al estado nuclear se analiza el pleomorflsmo

del núcleo. El aumento del tamaño y coloración nuclear probablemente refleje

anormalidades cromosomales y aumento del contenido de ADN. Numerosos estudios del

contenido de ADN han demostrado altas tasas de aneuploidía en cánceres de epitelios

escamosos y la aneuploidía ha sido asociada con una prognosis pobre (Ensley y col.,

1990; Wolf y col., 1990). El índice mitótico y otros marcadores de proliferación celular

también se utilizan para aportar más datos en la estimación del comportamiento de los

CCEB.

introducción 34

FIGURA 4

Fotomicrografía de un carcinoma de célulasescamosas bucal. H-E,magnificación200X.

LESIONES PRE-NEOPLÁSICAS DE LA CAVIDAD BUCAL

El cáncer bucal es uno de los pocos tipos de cánceres en el cual es posible la

observación clinica de los estadios iniciales de la progresión tumoral. Existe un trabajo

pionero en el estudio de la progresión tumoral que caracterizó las alteraciones genéticas

en el cáncer colo-rectal ya descripto en la página 15 (Fearon y Vogelstein, 1990). Hoy se

cree que el carcinoma de células escamosas bucal sigue un patrón de desarrollo similar al

descripto por Fearon et al. y puede estar precedido por lesiones clínicas tan variadas

como: leucoplasia, eritroplasia, quuen plano y fibrosis de la submucosa bucal (Nagpal y

Das, 2003). La naturaleza exacta de las alteraciones genéticas asociadas a estos

cuadros clinicos no esta del todo aclarada aún, si bien ya ha sido descripto un modelo

preliminar de progresión a nivel molecular para CCC (Califano y col, 1996; Nagpal y Das,

2003). Tampoco se han definido claramente los factores que determinan la transformación

de estas lesiones en un CCE. Debido a ello, se entiende particularmente por lesiones

precancerosas, a aquellas que analizadas a nivel poblacional presentan un riesgo

aumentado de malignización.

Si bien se presentan como entidades clínicas diferentes, que describiremos más

adelante, en todas ellas los cambios epiteliales hacia la transformación maligna pasan

generalmente por: hiperplasia (o acantosis), determinada por una mayor proliferación

celular que genera un aumento del volumen epitelial; displasia, en donde se agregan

atipías celulares y alteraciones en la maduración epitelial que producen cambios en la

histoarquitectura. Cuando estos cambios alcanzan cierta magnitud se catalogan como

displasia severa o carcinoma r'nsitu, en el cual las alteraciones son similares a las de un

CCE pero sin ruptura de la membrana basal. Se considera que en este estadio el epitelio,

liberado a su evolución espontánea progresa indefectiblemente, aunque en tiemposvariables hacia un tumor infiltrante.

introducción 35

o Leucoplasia

El termino leucoplasia es una denominación clínica que significa “placa blanca".

Según la Organización Mundial de la Salud se define como leucoplasia a “una placa

blanca situada sobre la mucosa bucal que no puede ser eliminada mediante raspado ni

clasificada como ninguna otra enfermedad diagnosticable" (Waldron y Shafer, 1975;

Silverman S Jr y col., 1984; Bouquot y col., 1988).

Posee una tasa de aparición de 1,5 a 12% en la población en general (Sapp y col.,

1998). Histológicamente, las alteraciones epiteliales constantes son un aumento del

espesor de Ia capa de queratina (hiperortoqueratosis o hiperparaqueratosis) lo que

condiciona el aspecto macroscópico de placa blanca y un aumento de espesor del estrato

espinoso (acantosis). A estas alteraciones pueden agregarse cambios displásicos de

intensidad van'able. Entre un 5 a 15 % de las placas blancas son clasificadas

histológicamente como displasias (Pindborg y col., 1997; Suarez y coI., 1998). De esas

leucoplasias un 15 a 20% desarrollaran carcinomas (Lumerman y col., 1995). Este

porcentaje aumentará en poblaciones de fumadores. Aunque las lesiones de leucoplasia

se pueden presentan en pacientes no fumadores, el consumo de tabaco con humo y sin

humo se considera el factor etiológico más importante de las leucoplasias. Otros factores

cuya implicanciaetiológi en algunas leucoplasias ha sido demostrada son: infecciones

virales, infección por candida albicans entre otros (Sapp y co|., 1998).

o Eritroplasia

La eritroplasia fue definida por Queyrat (también conocida como eritroplasia de

Queyrat) para describir una lesión roja, aterciopelada del glande del pene de hombres

ancianos (Sapp y col, 1998). Literalmente el termino significa “mancha o placa roja".

En la cavidad bucal se presenta con la apariencia clinica determinada (mancha o

placa roja) y a nivel histológicose caracteriza por ausencia de queratinización superficial y

alteraciones celulares correspondientes a un carcinoma in situ. No se conocen factores

etiológicos definidamente asociados a esta lesión.

o Liguen Plano

Es una lesión con manifestaciones cutáneas e intrabucales. Estas últimas se

caracterizan por estrías o lineas blancas que alternan con mucosa eritematosa.

Histológicamente se observa hiperparaqueratosis u ortoqueratosis con otros cambios

epiteliales variables que condicionan las diferentes variedades o subtipos de esta entidad.

introducción 36

Entre ellos, la forma queratósica y atrófica son consideradas pre-malignas. En la

etiopatogenia del liquen intervienen factores inmunológicos y psicosomáticos.

o Fibrosis dela submucosa bucal

La fibrosis de la submucosa bucal (OSMF) se caracteriza por presentar áreas

blanquecinas, difusas y firmes de cicatrización submucosa. La OSMF es una patología

bucal, de alta prevalencia en Ia lndia y otras poblaciones que tienen hábito de mascar

“nuez de areca" o “betel” (Pillai y coI., 1992; Jeng y col., 1994; Maher y co|., 1994). Esta

lesión, que causa pérdida de Ia elasticidad de Ia mucosa con trastornos en la masticación,

deglución y fonación, es reconocida como precancerosa dado que un alto número de

casos desarrollan posteriormente CCEB (Kaur y col., 1994; Pindborg y col., 1997; Kaur y

coI., 1998), y es la responsable de que la incidencia de cáncer bucal en la India sea muy

superior a la del resto del mundo (Pindborg y col., 1984; Pindborg, 1989).

Histológicamente, en un estadio inicialse observa inflamación crónica del tejido conectivo

submucoso, etapa que es seguida por una fibrosis progresiva difusa y atrofia del epitelio

suprayacente. El epitelio atrófico tiene una mayor tendencia a desarrollar hiperqueratosis

y displasias epiteliales que luego pueden progresar a CCEB.

MODELOS DE CÁNCER BUCAL

Los intentos por encontrar modelos animales para estudiar el cáncer bucal se

remontan a 1925 con el trabajo de Bonne (1925) quien describió un modelo poco ajustado

a Ia realidad, dado que se pincelaba la piel de los animales con el canoerígeno químico

elegido y casualmente se observaban papilomas en boca y estómago, debido a que los

animales ingerian el carcinógeno aI Iamerse la piel (Bonne, 1925). El principal

inconveniente era Ia resistencia de la mucosa bucal a Ia acción de los carcinógenos

químicos comúnmente utilizados en piel. Entre 1927 y 1930 se desarrollan protocolos

específicos de cáncer bucal en ratón y conejo que resultaron muy poco reproducibles

(Bonne, 1927; Roffo, 1930).

En 1954 Salley reporta la combinación exacta de tejido susceptible y carcinógeno

potente (DMBA)en Ia bolsa de la mejilla hamster (Cn'cetus auratus), validando el modelo

más utilizado hasta el momento para estudios de cáncer bucal.

Luego se reportaron modelos en rata también utilizando como carcinógeno al DMBA

introducción 37

(Wallenius, 1966a; Wallenius, 1966b) si bien son modelos de poca eficiencia. En 1972

aparece un modelo de cáncer de lengua con 4-nitroquinolina(4NQO) también en rata, que

es la base de muchos de los modelos actuales de cáncer de lengua (Giunta y Shklar,

1972). En 1974 se descn‘be el modelo de Heyden para paladar de rata cancerizado con

DMBAy 4NQO (Heyden, 1974) que luego sufrió algunas modificaciones y aún hoy es

también utilizado.

En las últimas décadas, se han desarrollado algunos modelos de carcinogénesis

bucal viral combinada con carcinogénesis quimica (Min y col., 1991), para estudiar el rol

de diversos virus en la etiología del cáncer bucal. Actualmente se ha reportado un nuevo

modelo en ratón SENCAR (Kimy col., 2002) aún no validado.

Con respecto a los modelos in vitro, se han desarrollado CCE inducidos en células

de la bolsa de la mejilla del hámster en cultivo (Schwartz y Shklar, 1997), y se ha

desarrollado una línea celular de un carcinoma de la bolsa de Ia mejilla del hámster

(HCPC-1) que es ampliamente utilizada en ensayos ¡n vitro (Odukoya y col., 1983).

38

OBJETIVOS GENERALES

Analizar características del modelo experimental de cancen'zación química de la

bolsa de la mejilla del hámster para evidenciar similitudes, aun no descriptas, con

los cuadros de malignizaciónespontáneos de Ia mucosa bucal humana.

Analizar algunos de los mecanismos involucrados en la alteración de las

interacciones epitelio-conectivas durante la carcinogénesis de Ia mucosa bucal,

especialmente aquellos que conducen a la producción de fibrosis y angiogénesis,

frecuentemente observadas en las lesiones pre-malignas de la mucosa bucalhumana.

Utilizar el modelo para estudiar cambios biológicos que se producen en la

cancen'zación de la mucosa bucal antes de Ia aparición de modificaciones

morfológicas. Analizar Ia posibilidad de utilizar la detección histoquímica de estos

cambios como marcadores de cancen’zaciónde campo.

SECCIÓNI-a

Reproducción del modelo de la bolsa de la mejilla del hámster. Análisis macro y

microscópico.

INTRODUCCIÓN

Como se expuso anteriormente en la página 36 este sistema es el más utilizado para

el estudio de cáncer bucal experimental, porque ofrece un ajustado paralelo con el

desarrollo de pre-malignidad y malignidad en la boca humana (Shklar y col., 1979; Jin y

Lin, 1989; Lin y Chen, 1991; Slaga y Gimenez-Conti, 1992). Además es uno de los

modelos mejor caracterizados para CCE .

El modelo desarrollado originalmente por Salley (Salley, 1954), fue luego

estandarizado por Morris (Morris, 1961; Morris y Reiskin, 1966) para garantizar la

reproducibilidadde las lesiones experimentales.

La bolsa facial del hámster anatómicamente semeja un bolsilloque se puede evertir

fácilmente posibilitando el seguimiento macroscópíco del proceso carcinogénico. Esta

comunicada con la boca solamente a la altura de las comisuras Iabiales y revestida por

una mucosa similar al resto de la cavidad bucal (Salley, 1957). Salley originalmente

enfatizó la necesidad de obtener un modelo de carcinogénesis bucal con hidrocarburos o

sus derivados (en su primer trabajo compara distintos hidrocarburos y distintos solventes

hasta concluir que el DMBAes el óptimo) para comenzar a analizar los efectos del tabaco

y derivados en la carcinogénesis (Salley, 1957). La posterior comprobación del rol del

tabaco en la carcinogénesis bucal resaltaría el valor de su trabajo.

Morris demostró que el epitelio de la bolsa de animales adultos mayores era más

resistente a la acción de DMBAy estandarizó la edad promedio de 5 a 6 semanas

(adultos jóvenes) como ideal para empezar los estudios de carcinogénesis experimental.

Con respecto a la solución del carcinógeno repitió algunas pruebas originales y reportó

otras, demostrando que la solución de DMBAal 0,5% es la óptima para obtener un buen

promedio de tumores con el menor tiempo de latencia y la mínima pérdida de animales.

Morris también reportó la no existencia de diferencias en Ia respuesta a la carcinogénesis

en el modelo en relación al sexo del animal (Morris y Reiskin, 1966).

Si bien el modelo estandarizado es el de la carcinogénesis completa con DMBA,

Sección I a 40

también se pueden inducir tumores con protocolos de 2 etapas, realizando la iniciacióny

promoción por separado (Odukoya y Shklar, 1982; Odukoya y col., 1984). Si bien se han

reportado distintos protocolos de 2 etapas aún no hay consenso para la elección de

alguno en particular y se discute la eficacia de cada uno de ellos (Slaga y Gimenez-Conti,

1992; Gimenez-Conti y Slaga, 1992; Gimenez-Conti y Slaga, 1993). Es por ello que se

sigue buscando el mejor esquema de carcinogénesis con co-carcinógenos para facilitar

los estudios de quimioprevención u otras aplicaciones del modelo (Wani y col., 2001).

En resumen, se reconocen como ventajas de este modelo:

1. Que el desarrollo de los tumores es precedido por alteraciones pre­

neoplásicas semejantes a las lesiones pre-malignas en la mucosa bucalhumana.

2. No se conocen carcinomas espontáneos en la mucosa del hámster.

3. El sistema es muy sensible a su modulación sistémica vía vitaminas,

hormonas y drogas.

No obstante algunos autores han discutido algunos aspectos negativos del modelo:

la escasa producción de metástasis o su aparición muy esporádica o tardía,

probablemente debida al casi nulo drenaje linfático de la bolsa; así como algunos

aspectos estructurales diferentes entre la mucosa del hámster y la mucosa bucal humana,

tales como la ausencia de glándulas salivales, el mayor grado de ortoqueratinización y el

menor número de estratos epiteliales con ausencia de papilas conectivas.

Diversos estudios posteriores a los trabajos iniciales de Salley y Morris validaron el

protocolo originaly demostraron que el modelo estándar de la bolsa del hámster, aún con

sus falencias, es ideal para estudiar el cáncer bucal, y un buen modelo para

carcinogénesis en general (Shklar, 1999).

La cancen’zación se realiza mediante la aplicación local de una solución al 0,5 % de

DMBA en aceite mineral, tres veces por semana, durante 14 a 16 semanas (el

procedimiento se detalla en materiales y métodos, página 43 ). En esta forma el DMBAse

comporta como cancerígeno completo con capacidades combinadas de iniciador y

promotor. La cancerización de la bolsa es paulatina, se pueden estudiar las lesiones en su

macroscopía y microscopía, a medida que se van modificando y aumentando en gravedad

hasta la instalación de los tumores. Aunque el carcinógeno es aplicado sobre toda la

superficie de la bolsa facial, el proceso de cancen'zación no es igual en toda su extensión,

sino que es siempre focal al igual de lo que sucede en la boca humana.

Luego de unas pocas aplicaciones de DMBA (aproximadamente entre las 2 y 5

Sección I a 41

semanas) se observa una respuesta hiperplásica e hiperqueratósica y leves cuadros de

inflamación. Entre las 6 y 8 semanas de tratamiento predominan las lesiones displásicas.

Estas lesiones son similares a las leucoplasias y eritroplasia humanas (Gimenez-Conti y

co|., 1990). La secuencia prosigue con la aparición de carcinoma "in situ" y zonas de

micro-invasión aproximadamente entre las semanas 8 a 10. Hacia Ia semana 12 de

tratamiento aparecen tumores exofiticos muy diferenciados, de aspecto verrugoso, y

finalmente (semana 14 a 17) se observan tumores endofiticos de mayor malignidad,

menos diferenciados, que infiltranel conectivo y el múscqu subyacente.

Si bien la gravedad de las lesiones aumenta con el tiempo, al final del proceso

coexisten formaciones tumorales con lesiones pre-neoplásicas separadas por mucosa de

aspecto normal, en forma similar a Io que ocurre en la boca humana en el proceso

conocido como “cancen'zación de campo" bucal. Uno de los objetos de nuestro trabajo

fue precisamente analizar las caracteristicas de este modelo como modelo de

cancen'zación de campo. Con respecto a esto, pusimos especial énfasis en el estudio de

las áreas de mucosa de aspecto normal, sometida al carcinógeno durante meses. En

nuestro laboratorioya se ha estudiado en estas áreas el comportamiento de un marcador

de pre-malignidad, las regiones organizadores del nucleolo (AgNOR) así como en la

mucosa bucal adyacente a CCEB humanos (Schwint y col., 1994; Schwint y col., 1996).

Se encontró que estos epitelios si bien son macro y microscópicamente normales

expresan cambios morfológicos cuantificables de los AgNOR.

También los tumores remedan macro y microscópicamente los tumores humanos

(Malament y Shklar, 1981; Slaga y Gimenez-Conti, 1992). Los carcinomas exofiticos

tienen cierta similitud con los carcinomas verrugosos si bien tienen mayor cantidad de

atipías y mitosis, y los carcinomas endofiticos son en todo similares a los carcinomas de

células escamosas humanos. Asimismo, presentan marcadores metabólicos similares

(Solt, 1981; Solt y Shklar, 1982; Shin y col., 1990) e igual expresión de oncogenes (Wong,

1987; Husain y col., 1989; Wong y col., 1989).

La mayor parte de los trabajos donde se utiliza este modelo se refieren al

comportamiento de tumores frente a las diferentes condiciones experimentales. Los

eventos iniciales y las lesiones pre-neoplásicas particularmente, han sido menos

estudiadas. Otro hecho que no ha sido analizado en este modelo es la inducción de

fibrosis en el conectivo subyacente a los epitelios en transformación. Estos cuadros se

mencionan ocasionalmente como parte de las descripciones histológicas del modelo, pero

nunca se ha realizado una descripción morfológica cuali o cuantitativa de Ia misma en

Sección I a 42

relación a la carcinogénesis. Tampoco se ha tratado de estudiar su patogenia o su

relación con la transformación epitelial

ONCOGENES Y GENES SUPRESORES DE TUMOR

El nivel de expresión de distintos proto-oncogenes se analizó en el desarrollo

tumoral del modelo. Se ha reportado el aumento en la expresión de c-Ha-ras en estadios

tempranos y también el aumento de la expresión de c-erb-B hacia las semanas 8 a 10 de

la cancerización (Husain y col., 1989). Previamente Wong había reportado la amplificación

de c-erb-B1 en los carcinomas del modelo (Wong, 1987) y en Ia tumorigénesis (Wong y

coI., 1989). También Wong reportó la expresión de Ki-ras en epitelio normal y

transformado de cultivos de la bolsa de la mejilla del hamster (Wong y col., 1989). Por

entonces se implicó al aumento de la expresión del oncogén ras con la transformación

inicial y la de c-erb-B en la proliferación y fenotipo maligno (Slaga y Gimenez-Conti, 1992).

Al haberse demostrado Ia presencia aumentada de c-erb-B1, el gen que codifica

para el EGFR se buscó la expresión de EGF en lineas celulares tumorales de hámster. Se

halló expresión de TGF-a y no se encontró expresión de EGF (Wong y col., 1988).

Otros oncogenes estudiados en el modelo han sido c-myc y c-sis, encontrados en el

epitelio normal y sin ser afectados en Ia bolsa cancerizada (Slaga y Gimenez-Conti,

1992). En el caso del gen del factor de transcripción c-fos, no se detectó actividad del

mismo en ningún estado del proceso de carcinogénesis (Slaga y Gimenez-Conti, 1992).

Finalmente en cuanto a la expresión de genes supresores, los únicos trabajos

concluyentes son sobre p53. Se encontró que la acumulación de p53 ocurre

tempranamente en el proceso de carcinogénesis en este modelo y frecuentemente como

en los CCE humanos. Las alteraciones en su expresión se deben a mutaciones en el gen

p53 (Chang y col., 1996; Gimenez-Conti y co|., 1996; Chang y col, 2000). AI analizar la

expresión de p53 en los carcinomas del modelo se confirmó que las mutaciones que

presenta son consistentes con las existentes en los tumores humanos ((Gimenez-Contiy

col., 1996).

Sección I a 43

OBJETIVOS

o Estandan‘zar el modelo de la bolsa de la mejilla del hámster según

descripciones de Ia literatura.

o Estudiar Ia morfología de las lesiones macroscópica y microscópicamente.

Compararlas con las reportadas bibliográficamente y describir aquellas en las

cuales se encontró escasa información.

o Estudiar la posibilidad de utilizar las áreas cancerizadas aún sin cambios

morfológicoscomo modelo de cancerización de campo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron en este trabajo hámsters de la especie Mesocn'cetus auratus, de

aproximadamente 6 semanas de edad, de un peso corporal entre 150-200 grs., provistos

por el bioterio central de la Comisión Nacional de Energía Atómica (CNEA). Se alojaron

en cajas de 5 hamsters cada una con agua y alimento ad Iibitumy ciclo de luz-oscuridad

de 12-12 horas.

Los animales fueron sometidos al protocolo de carcinogénesis estándar (Shklar y

co|., 1979), que implica la aplicación del cancerígeno mediante una jeringa de tuberculina

estén'l y descartable (sin aguja), en la bolsa derecha. Se vuelca en el fondo de la bolsa 1

cm 3 de una solución de DMBA(Sigma) al 0,5 % en aceite mineral (mineral oil, 400-5,

Sigma Diagnostics, INC.). AI retirar Ia jeringa se adosan las paredes de la bolsa

permitiendo la difusióndel cancerígeno sobre toda la superficie. esta operación se repite 3

veces por semana durante 17 semanas, como tiempo máximo. Se realizaron dos grupos

control: uno de animales sin tratamiento y otro con topicaciones del vehícqu (aceite

mineral), siguiendo los mismos tiempos experimentales. A la octava semana de

tratamiento se practicó un examen clínico de las bolsas anestesiando a los animales

previamente con Ketamina 50 (Holliday)en una dosis de 10 mg cada 100 gramos de peso

corporal, para controlar el estado de la bolsa y el comienzo de la aparición de las lesiones

macroscópicas. Se controló también el peso corporal de los animales.En diferentes intervalos hasta la semana 17 se sacrificaron con sobredosis de

inhalación de éter sulfúrico(analítico, Raudo) en grupos de aproximadamente 5 animales.

Sección I a 44

Treinta minutos antes al sacrificio los animales recibieron por vía intraperitoneal una

solución (5 mg/ml) de 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrDu, Sigma) en solución fisiológica

(dosis: 0.08 mg de BrDu por gr de peso corporal), para la posterior determinación de fase

S del ciclo celular por inmunohistoquimica según técnica que se describe en los

materiales y métodos de la sección l-b.

Se extrajeron las bolsas de Ia mejilla derecha; se realizó un análisis macroscópico

para constatar la presencia de lesiones, y se las fijó en formol al 10% cuando

correspondía o se las almacenó en freezer a —80° C.

En el caso de las muestras necesarias para la detección del FGF-2 por

inmunohistoquimica el material se dividió en dos, una parte se fijó en formol al 10% y se

procesó rutinariamente para su observación microscópica y Ia segunda mitad se fijó en

acetona para procesamiento inmunohistoquimico.

En todos los casos se realizó el procedimiento técnico de rutina (deshidratación e

inclusión en parafina) y posterior coloración de Hematoxilina-Eosina (H-E), con el fin de

realizar el seguimiento del proceso de cancen'zación y Ia clasificación del material.

RESULTADOS

El seguimiento macroscópico y el análisis histológico, en preparados de rutina

coloreados con H-E revelaron que el modelo fue estandarizado tal como se describe

habitualmente en la literatura.

La mucosa normal de la bolsa de Ia mejilla del hámster presenta un epitelio

escamoso estratificado de pocas hileras de células (3 o 4), de aproximadamente 30

micrones de espesor y una capa córnea ortoqueratinizada. El conectivo subepitelial es

relativamente denso sin glándulas ni otras estructuras anexas de aproximadamente 60-80

micrones de espesor (figura 5 a). Por debajo de el hay una capa muscular, ausente solo

en el fondo de la bolsa, que permite los movimientos necesarios para la introducción y

expulsión de alimento en condiciones fisiológicas normales. La capa muscular se continúa

con una adventicia sumamente laxa, donde transcurren vasos y nervios, que separan la

pared muscular de la boca hacia adentro. La Iaxitud de este tejido permite fácilmente la

eversión de Ia bolsa para su examen fuera de la mejillasin daño alguno de las estructuras

anatómicas ni de su irrigaciónsanguínea.

Figura 5

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Áreas caracteristicas de los diferentes estadios de transformación maligna en el modelo de carcinogénesis de labolsa dela mejilladel hámster.a) epitelio normal b) epitelio cancerizado de aspecto morfológiconormal (NUMF)c) hiperplasia d) displasia e) carcinoma ¡nsitu f) carcinoma diferenciado.b, c, d, e yfcorresponden a una bolsa tratada con DMBAdurante 16semanas.Tinción H-E, a, b, c, d, e magnificación final 350 X; f 100 X.

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SecciónI a 46

Cuando esa mucosa fue sometida a topicaciones con aceite mineral, el vehicqu del

cancerígeno, durante 4 meses, no presentó alteraciones morfológicas (figura6).

FIGURA 6

Fotomicrografía de una mucosa control de Iabolsa de Ia mejilla del hámster tratada durante16 semanas con el vehiculo del cancerígeno(aceite mineral).H-E, magnificación final 350X.

El proceso de cancerización se da en forma continua a medida que se va aplicando

el cancerígeno en forma constante (3 veces por semana). Los primeras modificaciones

macroscópicas aparecen hacia las 6 semanas de topicación; al evertir la bolsa se

observan lesiones blancas, hiperqueratósicas, en todo semejantes a la Ieucoplasia

(entidad pre-maligna de la boca humana). A las 12 semanas aparecen los tumores como

pequeñas masas exofíticas de 2 a 3 mm de diámetro que se van agrandando hasta

alcanzar 1 a 1.5 mm de diámetro al final de los tiempos experimentales estudiados (17

semanas) (figura7). En ese momento se observan lesiones induradas, a veces ulceradas

que aumentan el espesor de la pared y corresponden a tumores que crecen en formaendofítica.

Todas estas lesiones van aumentando en número y gravedad a medida que se

acumulan los efectos de Ia topicación con el cancerígeno, si bien las lesiones pre­

malignas y los tumores son siempre focales y coexisten con zonas de mucosa sinalteraciones evidentes.

Microscópicamente, los primeros cambios se manifiestan en el tejido conectivo, con

una desmoplasia subyacente a epitelios aún sin alteraciones histológicas (figura 8). Nos

referimos en particular al estudio de estas áreas de fibrosis en la sección l-c.

En el epitelio las primeras respuestas son de tipo hiperplásico. El epitelio aumenta

su espesor manteniendo ordenados sus estratos. Estos cuadros predominan hacia la

semana 4 de tratamiento alternando con áreas extensas de epiteliode apariencia

histológica normal. A estas zonas de epitelio cancerizado por el DMBApero de aspecto

morfológico normal las hemos llamado zonas NUMF(por sus siglas en inglés: no unusual

microscopic features) (figura 5 b). A medida que progresa el tiempo de cancerización van

SecciónI a 47

FIGURA7

a) Hamster durante el proceso de topicación. b)Bolsa de la mejilla del hamster tratada conDMBA durante 16 semanas. La bolsa se

observa evertida y presenta un tumor exofiticorodeado de mucosa cancerizada. c) Wstamacroscópica de un carcinoma de célulasescamosas correspondiente a una bolsacancerizada durante 14 semanas.

FIGURA 8

Fotomicrografía de un área desmoplásicasubyacente a un epitelio sin alteracioneshistológicas. La mucosa ha sido sometida altratamiento con DMBAdurante 5 semanas.

H-E, magnificación final 50X.

apareciendo cuadros displásicos. Los epitelios hiperplásicos pierden su ordenamiento en

estratos con diferenciación ordenada hacia la superficie, y la relación núcleo-citoplasma

se altera irregularmente, configurando cuadros semejantes a una displasia leve o

moderada. Luego se suman atipías celulares evidenciadas por núcleos de tamaños y

forma alteradas que alternan con elementos más normales configurando cuadros de

displasia severa o carcinomas “insitu” (ClS) (figura 5).

Un análisis cronodinámico del proceso de carcinogénesis reveló que a las seis

semanas de topicaciones predominaban los cuadros hiperplásicos con algunas imágenes

de displasia leve y moderada y a la semana diez se sumaban cuadros de displasia severa

y esporádicamente aparecía alguna imagen de CIS. Entre las semanas 12 y 14 aparecen

los carcinomas exofiticos, sésiles o pediculados, muy diferenciados pero con signos

variados de atipías celulares (figura 9).

SecciónI a 48

FIGURA 9

Fotomicrografia de un tumor exofiticopequeño, característico luego de 12semanas de cancerización.

H-E, magnificación final 20X.

El epitelio está hiperqueratinizado y las capas córneas acompañan las

invaginaciones del epitelio. Finalmente, entre la semana 16 y 17 aparecen carcinomas

endofiticos constituidos por cordones epiteliales de poco espesor, con escasa o nula

diferenciación córnea que infiltrany engrosan el espesor de la pared de la bolsa, invaden

las capas musculares, llegando a la adventicia. Estos tumores son en un todo similares a

los carcinomas de células escamosas de la boca humana (figura 10).t

FIGURA 10

Fotomicrografias de los distintos tipos decarcinomas de la bolsa de la mejilla delhamster.

a) Carcinoma exofltico diferenciado, H-E,magnificación final 350X.

b) Carcinoma endofitico, H-E, magnificación100X

Aún en estas últimas etapas del proceso pueden encontrarse en una misma bolsa,

uno o dos tumores endofiticos, hasta 4 ó 5 tumores exofiticos, y entre ellos, zonas pre­

neoplásicas (hiperplásicas, displásicas o CIS) y zonas NUMF (figura 5, b, c, d, e, f). La

SecciónI a 49

figura 11 muestra un corte transversal completo de una bolsa cancerizada durante 16

semanas donde se observan todas las lesiones mencionadas.

FIGURA 11

Cancerización de campoLa fotomicrografia corresponde a una bolsa de la mejilla del hamster completa cancerizada durante 4 meses. Seobservan todas las lesiones caracteristicas del modelo: A- NUMF,B- carcinoma, C- CIS.H-E, magnificación final 20X.

CONCLUSIONES

El modelo de cancerización con DMBAde la bolsa de Ia mejilla del hámster es

altamente reproducible. Las lesiones pre-neoplásicas y neoplásicas

observadas son coincidentes a las descriptas en la literatura y semejan el

proceso de cancerización de la boca humana.

Las áreas NUMF

constituyen un modelo para estudio de alteraciones sub-microscópicas

(epitelio cancerizado sin alteraciones histológicas)

propias de las etapas iniciales de la cancerización de campo.

Si bien las lesiones epiteliales se dan en forma continua y progresiva

aumentando en severidad a medida que aumenta la cantidad de cancerígeno

aplicado, pueden definirse para su estudio como: lesiones hiperplásicas y

lesiones displásicas leves, moderadas o severas. Todas ellas, según la

modalidad de análisis que se realice sobre el modelo, pueden agruparse

como “lesiones pre-neoplásicas o pre-malignas”.

Las neoplasias del modelo definen dos tipos macro y microscópicamente

Sección I a 50

distintos de tumores: los exofiticos bien diferenciados y los tumores

endofiticos mas indiferenciados, con cordones más atipicos e infiltrantes.

En las últimas etapas de la canoen'zación, los tumores coexisten con lesiones

pre-neoplásicas y zonas epiteliales de apariencia normal (NUMF)

configurando los cuadros propios de la cancen'zación de campo.

SECCION I-b

Variaciones dela ploidia epitelial en la carcinogénesis de la bolsa de la mejilladel hámster

INTRODUCCIÓN

Tanto en la boca humana como en la bolsa de la mejilla del hámster Ia clasificación

de las etapas pre-malignas y malignas se realizan con criterios histológicos. La gradación

de malignidad y pre-malignidad basada en criterios morfológicos ha sido utilizada desde

los comienzos de la patología hasta hoy. No obstante Ia reproducibilidad de la gradación

histopatológica es relativamente baja debido justamente al criterio de evaluación subjetivo

(Cutler y col., 1966; Stenkvist y col., 1979; Delides y col., 1982).

En los epitelios canoen'zados del modelo del hámster se han descripto alteraciones

en la expresión de citoqueratinas, oncogenes y genes supresores (Murase y col., 1986;

Husain y col., 1989; Gimenez-Confi y col., 1990; Chang y col., 1996). Estas alteraciones

se han estudiado en relación a los tiempos de cancen'zación y en general no se han

relacionado a las diferentes lesiones histológicas que coexisten en la bolsa en todos los

tiempos experimentales.

La cuantificación del ADN para estudios de ploidia realizada por el método de

análisis de imágenes de cortes histológicos, permite evaluar separadamente los distintos

tipos de lesiones y obtener indicadores numéricos para cada una de ellas. El análisis de

ploidia se utiliza en diagnóstico y prognosis de diversas entidades tumorales y en

particular en tumores bucales (Schimming y coI., 1998; Paes de Lima A., 1999; Abou­

Rebyeh y col., 2001; Russo y col., 2001; Lundgren y col., 2002)y actualmente es uno de

los estudios solicitados por los comites oncológicos para decisión terapéutica y

seguimiento de casos de neoplasias diversas. También se ha postulado que puede

utilizarse como elemento de predicción de transformación maligna de lesiones orales pre­

neoplásicas como la leucoplasia (AbdeI-Salam y col., 1987; Sudbo y coI., 2001; Sudbo,

2001).

Se realiza habitualmente mediante 2 técnicas diferentes: la citometría de flujo que

utiliza células en suspensión y proporciona datos sobre grandes poblaciones celulares,

muy manejables estadísticamente y la citometría estática que hace posible conservar la

morfología de la lesión en un corte histológico. La citometría de flujo ha sido

Sección I b 52

extensamente utilizada, pero puede emplearse solamente con volúmenes adecuados de

tejido tumoral disponible de piezas quirúrgicas o Iisados de preparados histológicos. La

cuantificación de ADN por análisis de imágenes es una alternativa a ese método.

Presenta la gran ventaja de ser aplicable a extendidos citológicos y a preparados

histológicos en pequeñas áreas preservando Ia arquitectura del tejido, pero requiere

severos cuidados metodológicos para evitar errores derivados de la reproducibilidadde la

tinción estequiométrica del ADN y de Ia medición citométrica. Por ello, antes de su

aplicación al modelo de cancen'zación de la bolsa de la mejilla del hamster, realizamos su

puesta a punto y las modificaciones necesarias para optimizar Ia técnica.

AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA

o Técnica de Feulgen- Curva de hidrólisis

En la puesta a punto del análisis de ploidía en el tejido a estudiar, el primer paso fue

estandarizar la técnica histoquímica de Feulgen (Feulgen y Rossenbeck, 1924). Esta

técnica es la más utilizada para teñir específicamente el ADNnuclear y luego cuantificarlo

microespectrofotométricamente. La metodología proporciona información “insitu” del ADN

nuclear, basada en una hidrólisis ácida, seguida de un revelado de los grupos aldehído

con el reactivo de Schiff.

El reactivo de Schiffes una solución de fucsina básica decolorada con metabisulfito

de sodio (804 Na) que recupera su color en contacto con grupos aldehídos, por reducción.

Cuando los cortes histológicos se someten a Ia acción hidrolítica del ácido clorhídrico

(HCI),el ADN nuclear se descompone en purinas y pentosas de forma que sobre cada

molécula de azúcar reaparece un grupo carbonilo, que reacciona con la solución de Schiff

produciendo una tinción rojo magenta cuya intensidad es proporcional al ADN hidrolizado.

Dado que Ia reacción de Feulgen es estequiométrica, puede ser cuantificada

microespectrofotométricamente (Riss, 1948; Riss y Misty, 1949).

La hidrólisis ácida del ADN puede realizarse con ácido nítrico (HNOa) o HCl 5N a

temperatura ambiente (Itikawa y Ogura, 1954) obteniéndose una hidrólisis óptima. Si la

hidrólisis no se realiza completamente, el resultado es una coloración más débil de los

núcleos, debido a una reacción de parte del contenido total de ADN. Por el contrario, si el

tiempo se prolonga, se produce una despolimerización y extracción del ADN, dando

también como resultado una coloración más débil (Deitch y Godman, 1966). Esto hace

que, después de preparados los reactivos y el material, en cada laboratorio deba

Sección I b 53

optimizarse el tiempo de hidrólisis en el material a utilizar. La adecuada preparación de los

reactivos para la técnica de Feulgen es crítica para el mantenimiento de la estequiometría.

Particularmente es importante la pureza y densidad del ácido clorhídrico utilizado tanto

para la hidrólisiscomo para Ia preparación del reactivo de Schiff .

ANÁLISIS DE PLODÍA.

a- Factores de corrección

La microfotometriaestática se realiza sobre preparaciones histológicas de dos tipos:

extendidos citológicos o cortes histológicos. En los extendidos, todos los núcleos celulares

están enteros y por ende con su contenido total de ADN. En los cortes histológicos, en

cambio, un porcentaje de núcleos no está contenido totalmente en el espesor del corte.

Cuando los núcleos seccionados no pueden identificarse y son erróneamente medidos en

menos, se produce un error metodológico, dado que se evalúa solamente una parte de

ADN. En muchos tejidos, si se aumenta el espesor de los cortes para obtener mayor

porcentaje de núcleos enteros, las células se superponen aumentando el error de medida

y disminuyendo su visualización. Esto hace que deba optarse en cada caso por un

“espesor de compromiso" donde el error se disminuya estadísticamente aumentando el

número de células medidas (Steinbeck y col., 1999). La otra posibilidad es asumir que el

producto ADN-Schiffestá homogéneamente distribuido en el núcleo, entonces como el

núcleo celular se asemeja geométricamente a una esfera, se puede estimar el contenido

de total de ADN. Por relación de volúmenes entre Ia parte del núcleo contenido en el

espesor del corte y el volumen de una esfera de igual diámetro se calcula el contenido

nuclear. Los analizadores de imágenes brindan datos morfométricos, en pixels, de las

células medidas. Con el valor del radio celular en pixels y el valor del espesor del corte se

calcula el volumen nuclear. Pero si el valor del espesor no es exacto nuevamente se

suma error a la medición, y es sabido que el espesor de corte graduado en el micrótomo

tiene variaciones entre el valor indicado y el real.

Para tratar de solucionar este problema y trabajar con mayor precisión, en nuestro

laboratorio se ha desarrollado un método basado en Ia preparación de material de

referencia, como patrón o "estándar" (Cabn‘niy col., 1998) para saber con mayor exactitud

el espesor del corte utilizado. Estos patrones son cilindros de celoidina 7 %, coloreados

con el método de ácido periódico Schiff (P.A.S.) e incluidos en parafina (ver página 59 de

materiales y métodos). Se realizan cortes de diferente espesor cada uno de los cuales se

Sección I b 54

divide en dos mitades. Una de ellos se monta para su medida microfotométrica. Los otras

mitades se apilan y se vuelven a incluirpara ser cortadas transversalmente para medir el

espesor real con un ocular micrométrico. Con ello se realiza un normograma que

relaciona densidad óptica (D. O.) con el espesor real de los cortes del cilindro de

celoidina. Se reserva un grupo de cilindros procesados simultáneamente para usarlos

como estándar. Antes de realizar los cortes de los tejidos a estudiar se adhiere al taco de

parafina un cilindrode modo de seccionarlos juntos. Se divide el corte para montarlos con

una separación que permita colorear el tejido solamente (figura 12).

A_ i FIGURA 12

Representación esquemática de los, pasos seguidos para Ia obtenciónl del cilindro de celoidina (teñido con

P.A.S.), para realizar el control delespesor del corte.Adaptado de Cabrini y ool. (1998).

e> ®® p a»?!

D

W ,Una vez terminado el preparado, el espesor del corte se determina midiendo la D.O.

del corte del cilindroy entrando con ese valor por la ordenada del normograma, se lee en

la abscisa su espesor real en micrones.

De esta manera en el caso de núcleos de diámetro mayor al espesor del corte, se

puede aplicar un factor de corrección que aproxime el contenido de ADN medido al

contenido real del núcleo completo,

Una segunda fuente de error en las mediciones de ADNen cortes de tejido puede

provenir de la lectura del fondo no especifica de núcleos teñidos con Ia reacción de

Feulgen. Esa medición errónea deriva de la existencia, en núcleos grandes, de áreas de

núcleo no ocupadas por cromatina, en particular cuando se trata de poblaciones celulares

mixtas (Iepto y paquicromáticas).

Aufferman y col. evaluaron el fondo a través de la cuantificación del área alrededor

de cada núcleo en células aisladas en extendidos celulares (Auffermanny col., 1984). Ese

tipo de corrección es muy dificil de implementar en preparados histológicos, por ello se

utiliza como blanco (100% de transmitancia) la medición de una zona del vidrio y del

medio de montaje fuera del tejido. En esos casos no se estima correctamente la lecturade fondo.

Sección I b 55

Para estimar esa corrección, nosotros calculamos el factor de error aportado por la

lectura errónea de fondo en nuestro sistema y obtuvimos un valor de fondo por unidad de

área (expresada en pixels). La metodología para este cálcqu se detalla en la página 64.

Estas modificaciones nos han permitido, con correcciones simples incorporadas a la

rutina, adaptar la medición de ADN a diferentes lesiones que coexisten en la bolsa

cancerizada y hacer mas reproducibles los datos.

b- Control del valor diploide

El análisis de ploidía requiere Ia medida precisa de un valor diploide (2C), en cada

muestra a utilizar, dado que la ploidía de las células tumorales se expresa en valores

relativos a los obtenidos en células patrón que deben ser procesadas simultáneamente.

Se comenzó con Ia medición de los valores de ADN de linfocitos, células maduras en Go,

generalmente disponibles en el mismo corte histológico, que son frecuentemente

utilizadas como estándares de valor diploide en la literatura internacional (Bocking y col.,

1984; Booking y ool., 1989). Sin embargo se sabe que por razones técnicas y de

compactación de la cromatina Ia lectura del ADN de los mismos puede dar valores

menores al valor diploide real. Bohm y colaboradores en 1968, describieron desviaciones

en los valores esperados (por la constancia del ADNde cada especie) de ADNal teñir con

Feulgen hepatocitos, linfocitos, granulocitos y esperma (Bohm y co|., 1968). Los linfocitos

y los granulocitos dieron valores menores que los hepatocitos diploides en todos los

tiempos de hidrólisis estudiados, mientras que las espermátides (haploides) dieron

valores mayores al diploide. Estas diferencias no aparecían cuando los núcleos del mismo

tipo celular, con distintas ploidias (hepatocitos diploides y tetraploides) se comparaban. La

diferencia en las mediciones entre linfocitosy hepatocitos de una misma especie también

se describen en el trabajo de Hale (Hale, 1963).

Se desarrollaron diversas teorías que explicarian esas diferencias presentes en

distintas células, una de ellas supone que los errores proporcionales se deben a

variaciones en el comportamiento de las nucleoproteínas durante la hidrólisis del Feulgen

(Bohm y col., 1968). Por lo cual desde aquellos primeros trabajos en donde se describió el

fenómeno, se sugiere probar la técnica a distintos tiempos de hidrólisis (premáximo,

máximo y postmáximo), práctica que se observa en los trabajos, sobre el tema,

rigurosamente realizados.

Pese a estas dificultades técnicas los linfocitossiguen siendo utilizados como control

diploide dada la facilidadcon que estos se encuentran en las cercanías o dentro del tejido

Sección I b 56

tumoral. Actualmente se recomienda utilizarlos pero se debe establecer un valor de

corrección de su lectura respecto al valor normal de las células del tejido a estudiar

(Bocking y col., 1984; Bocking y col, 1989). Por ello determinamos el factor de corrección

por condensación cromática (FCC)para nuestro sistema de estudio.

Luego que se obtiene el valor diploide normal se pueden estudiar las lesiones

elegidas y analizar sus desviaciones, realizando los análisis de ploidía (figura 13). Ello se

analiza sistemáticamente por medio de histogramas de ploidía. En los mismos se

relacionan los valores de ADN de los núcleos a evaluar con el de los linfocitos ya

corregidos por su FCC.

Con el valor de ploidía luego se pueden calcular diversos índices que ayudan a

aportar mas datos sobre el comportamiento del tejido.

a ' .. V . . b \\

. A0 ‘ '5 A V' . Y

Reacción de Feulgen en un carcinoma dela bolsa cdel hámster

FIGURA 13

Representación esquemática de lasecuencia de pasos necesarios para realizaranálisis de ploidía.a) Realización de la reacción de Feulgen. b)Análisis microespectrofotométrico y obtenciónde los datos digitalizados. c) Confección de —histograma de ploidía.

1o- Histograma de ploidíadel carcinoma

frecuencia

8

ploidía

En el caso de la citometría estática, si bien se puede especular que un tejido o tumor

está en plena proliferación por los valores de ploidía obtenidos, no se puede discriminar

cual etapa del ciclo celular es la afectada. Por ello suelen acompañarse los índices de

ploidía (aportando información sobre poliploidia o aneuploidia) con los datos de algún

marcador de proliferación celular, preferentemente los de incorporación de bromo­

deoxiuridina, que estima la fase S del ciclo celular (figura 14).

Sección I b 57

FIGURA 14

Esquema de la variación en la cantidad deADNdurante el ciclo celular de una célula

eucariótica típica. La replicación de ADNseproduce durante la interfase, conocida comofase S, estimada a través de la incorporaciónde BrDu.

contenldodeADN

OBJETIVOS

o Ajustar el método de evaluación de la ploidía por análisis de imágenes para ser

aplicado a las lesiones microscópicas del modelo de cancerización química de la

bolsa de la mejilladel hámster.

o Caracterizar cuantitativamente las lesiones epiteliales de las diferentes estadios

de la carcinogénesis.

o Demostrar lesiones no observables en las preparaciones microscópicas de rutina.

Sección I b 58

MATERIALES Y MÉTODOS

AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA

1) Técnica de Feulgen - Curva de hidrólisis

Como se mencionó en la introducción Ia pureza y densidad del HCI es de suma

importancia para que se cumpla la estequiometría de la reacción. Por ello junto al ajuste

del tiempo de hidrólisis se analizó la variación de los resultados trabajando con ácidos

clorhídricos de distinta marca. Realizando la hidrólisis con cada uno de los HCIy a su vez

controlando la preparación del reactivo de Schiff. Dado que existe una fórmula clásica,

Tomassi, 1936 (Pearse, 1990), y posteriores variaciones de la misma, se preparó el

reactivo de las dos formas y se probaron distintos ácidos clorhídricos. Luego se

compararon los resultados de Ia reacción de Feulgen realizada con reactivo el reactivo

preparado en ambas formas y el reactivo de Schiff comercial.

Ácido Clorhídrico

1) Berna, 6 = 1,18 gr/ml

2) Merck, 6 = 1,19 gr/ml

Reactivo de Schiff

- Fórmula Clásica (según Tomasr)

1 gr de pararosanilina (Sigma, C. l: basic red 9. 42.500)

200 ml de agua destilada hervida a 100° c

Se mezcla y se deja llegar a 50° C, se agregan 20 ml de HCl 1N.

Se deja enfriar hasta 25° C y se agregan 2 gr de metabisuifito de sodio (804 Na').

Se guarda en frasco color caramelo hasta el día siguiente (24 horas), debe tomar un color

pajizo.

Aldía siguiente se agregan 0,5 gr de carbón activado y se filtra.

oFórmula Modificada

2 gr de pararosanilina (Sigma)

250 ml de agua destilada hervida a 100° c

Se mezcla y se agregan 3,8 gr de (804 Na’).

Se agregan 4 ml de HCIpuro.

Se guarda en frasco color caramelo hasta el día siguiente (24 horas).

AIdía siguiente se agregan 0,5 gr de carbón activado, filtrar.

Sección I b 59

- Reactivo comercial

Biopurdel kit comercial para realizarla reacción de PAS.

Para las pruebas se utilizaroncortes de higado de hámster, fijados en formol 10% e

incluidos en parafina

Previo a la técnica histoquímica se prepararon los cortes, se desparafinaron y se

deshidrataron (dos pasajes de cinco minutos por inoI, dos pasajes de cinco minutos por

alcohol absoluto, dos pasajes de cinco minutos por alcohol 96% y luego 3 o 4 lavados con

agua destilada). Luego fueron sometidos a una hidrólisis de 10 minutos a temperatura

ambiente con HCI 1N (para preparar el tejido).

Reacción de Feulgen

-Hidrólisis con HCI5N a temperatura ambiente, tiempos variables y luego dos horas

en oscuridad a temperatura ambiente con el reactivo de Schiff.

-Lavados :

agua destilada

10 minutos en agua sulfurosa (HCI 1N, 5% VN, metabisulfito de K+ 10%. 5% VN)

agua corriente, bajo canilla 10 minutos.

-Deshidratado, aclarado y montaje.

Las curvas realizadas fueron las siguientes:

I) Schiff modificado, hidrólisis con HCI Berna, tiempos 30, 60, 90, 120, 240,

480 minutos.

II) Schiff comercial, hidrólisis con HCI Merck, tiempos 30, 60, 90, 120, 240, 480,

960 minutos.

lll) Schiff según Tomasi, hidrólisis con HCI Merck, tiempos 30, 60, 90, 120, 240,

480, 960, 1620 minutos.

Cada uno de los puntos de las curvas l, II, Ill corresponden a la medición de un

corte de hígado y en cada caso se midieron 50 células. Los datos se expresan como la

media :t DS.

2) Preparación del cilindro de celoidina, patrón de espesorCilindro

Tamaño: 3 mm de diámetro y 1 cm de alto.

Material: celoidina 7% en partes iguales de alcohol absoluto y éter etílico, endurecida

en alcohol 70°.

Sección I b 60

Coloración: P.A.S. (ácido periódico al 1% durante la noche, lavado en agua destilada

1 hora, solución de Schiff en oscuridad y fijación en formol al 10% 6 horas), luego lavado

de 2 horas en agua corriente, deshidratación durante 6 horas en alcoholes crecientes e

inclusión en parafina.

Se realizaron cortes en micrótomo convencional con diferentes grosores. Se

determinaron los espesores reales y las medidas microfotométricas para confección de la

curva de referencia según el método de Cabnni y col. (Cabn’niy col., 1998).

3) Determinación del valor de fondo de la tinción

Para comprobar la existencia de errores por lectura de fondo inespecífico, se

utilizaron cortes de distintos espesores (5, 10 y 15 um) de hígado de hamster y

carcinomas de la bolsa dela mejilladel hámster (8pm), fijados en formol al 10%.

Utilizando como blanco de la medida de 0.0. por fuera del tejido, medimos áreas

extra-nucleares en dos condiciones:

Fondo l) mediciones de distintos sectores de citoplasma, teniendo cuidado de evitar

el núcleo, en cortes de distinto espesor de hígado teñidos con la técnica de

Feulgen,

Fondo ll) las mismas mediciones que en I pero en cortes sin colorear.

Se relativizó la D. O. por píxel.

Se utilizaron 5 animales. Cada punto de la curva se realizó por triplicado.

Luego, para evaluar el error por lectura de fondo en nuestro material realizamos la

lectura de fondo en cortes teñidos de carcinomas de la bolsa del hámster, a 8 um

(espesor utilizado para el análisis de ploidía). Se cuantificó la densidad óptica de distintas

áreas citoplasmáticas y se estableció una correlación entre área y TOD (TOD, de la

abreviatura en inglés: total optical density).

Se utilizaron 7 animales y en cada preparado se midieron en promedio 10 áreas

extranucleares. Con esas mediciones se realizó el cálculo del factor de corrección por

lecturas de fondo FCf.

4) Determinación del valor ZCen hámster

Para la determinación del valor diploide en el modelo utilizado se trabajó sobre

bolsas normales de la mejilla facial del hámster y linfocitos medidos en el estroma de

carcinomas de la bolsa de la mejilla del hámster. Se utilizaron 10 carcinomas y 10

mucosas normales.

Sección l b 61

Estudiamos por separado las células suprabasales y basales del epitelio de lamucosa.

Calcqu del factor de corrección por condensación cromática (FCC):

FCc = TOD células epiteliales/ TOD linfocitos

Se calculó un valor para el estrato suprabasal y uno para el basal.

En nuestro material fue de FCaxsa.)= 1.29, FC(suprab¡ai)= 1.23. Esos valores se

multiplicaron por el valor que se obtiene de Ia medición de los linfocitos en cada

preparado.

ANÁLISIS DE LA PLOlDÍA

Se utilizaron 85 hámsters. Los animales fueron sometidos al protocolo estándar de

cancerización (según materiales y métodos, sección I-a).

Los tiempos de cancerización fueron: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 16 y 17 semanas de

tratamiento. El grupo control fue sometido a cada uno de los tiempos experimentales con

el vehícqu utilizado en la preparación del carcinógeno (mineral oil).

Los animales se dividieron en 2 grupos:

o Tiempos largos de cancerización (16-17 semanas) para el que se utilizaron 35

animales, divididosen 20 animales experimentales y 15 animales control.

o Tiempos intermedios (6 a 10 semanas) para el que se utilizaron 25 animales (5

por cada tiempo experimental), y 15 animales control, 3 por cada tiempo

experimental.

Además se utilizaron 10 animales sin tratamiento para cuantificar la ploidía de la

mucosa normal.

Los animales fueron sacrificados y previamente inyectados con BrdUcomo se indica

en materiales y métodos de la sección l-a.

Las bolsas fueron disecadas y procesadas rutinan’amente para Ia inclusión en

parafina. En cortes teñidos con H-E se seleccionaron áreas de: carcinoma (Ca),

carcinoma in situ (CIS), displasia (D), hiperplasia (H), y epitelio sin cambios morfológicos

(NUMF), en cada tiempo experimental correspondiente. En los animales control tratados

con el vehícqu (C) se midieron entre 5 y 8 áreas.

o Citometría

En cortes adyacentes a los teñidos con H-E (cortes entre 7y 8 pm) se realizó la

tinción de Feulgen. La hidrólisis se realizó durante 90 minutos, de acuerdo con el tiempo

Sección I b 62

obtenido en la curva de hidrólisis para este material (ver resultados) con HCI 5N a

temperatura ambiente. Las áreas previamente seleccionadas en los cortes de H-E fueron

identificadas en proyecciones de los cortes teñidos con Feulgen. El análisis de ploidía se

realizó en cada una de las áreas empleando un microscopio Zeiss MPM-800 con un

objetivo 40X (NA 0.75) un condensador con apertura 0.8 y una cámara blanco y negro

CCD, Hitachi DK 7700-SX K (Hitashi Denshi LTD.), un analizador de imágenes (IBAS­

Kontron) y el software para medición de ADN de IBAS versión 1.0, (LANAlS-MEF,

CONICET-CNEA).

Para las medidas densitométricas, las imágenes fueron almacenadas empleando un

filtropasa banda angosto con un pico de absorbancia a 560 nm.

La segmentación se realizó interactivamente. El contenido de ADN de los linfocitos

en los cortes fue tomado como valor de referencia 2C. Aproximadamente se midieron 60

células de cada área seleccionada. Se realizó un software “ad hoc" para corregir las

mediciones por el espesor del corte y las lecturas del fondo. Se corrigió además el valor

de los linfocitos (según se explicó en la página 55), se realizaron histogramas de

frecuencia para cada caso y finalmente se calculó la ploidía.

La ploidía fue tomada como el cociente entre el TOD medio de las células medidas y

el valor 2C de referencia. El software “DNA”calcula además un índice de aneuploidía

(5CER) que es el número de células con contenido de ADN mayor a SC (Bocking y col.,

1984).

PROLIFERACIÓN CELULAR

Un segundo corte adyacente de 5 micrones se utilizó para estudiar la proliferación

celular por medio de la detección inmunohistoquimica de BrDu. Se utilizaron portaobjetos

silanizados para montar los cortes para evitar que los mismos se despeguen el realizar la

recuperación antigénica.

Se realizó la desparafinación y deshidratación en xiloly etanol respectivamente, pero

antes de terminar la deshidratación se incubaron los cortes en metanol peróxido de

hidrógeno en relación 10011(peróxido de hidrógeno 100 volúmenes) durante 30 minutos

para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se realizó una recuperación

antigénica en horno de microondas con buffer Citrato a pH 6. Se realizó un bloqueo

inespecifico con lavados en buffer Tris-salino 0.5M, pH 7.6, con albúmina bovina (Gibco

BRL, bovine albumine fraction V) al 0.3%.

Los cortes fueron luego incubados con un anticuerpo anti-BrDu monoclonal de ratón

Sección I b 63

(# 247M, 1:25; Biogenex, San Ramon California, USA) durante toda la noche a 4°C.

Luego de lavados con el buffer Tris-salino-albúmina se realizó la incubación con un

segundo anticuerpo biotinilado (dilución 1:200, IgG antiratón de Biogenex, Kit Multilink)a

temperatura ambiente durante 1 hora en cámara húmeda. Finalmente se incubó en las

mismas condiciones ya mencionadas con un complejo de peroxidasa-estreptavidina

(Biogenex). Se reveló con 3,3-diaminobencidina al 0.05% (DAB, Sigma) en buffer Tn's

0.5M y 1% de peróxido de hidrógeno y se detuvo la reacción con agua destilada. Se

realizó coloración de los núcleos negativos con hematoxilina.

Como control negativo se utilizaron cortes adyacentes que fueron procesados

omitíendo Ia incubación con el anticuerpo primario.

Se calculó el índice de proliferación (Iabeling index= LI) como número de células

marcadas sobre total de células del área elegida (magnificación 40X), utilizando un

software “ad hoc" que reconoce núcleos reactantes a DABy núcleos con hematoxilina. En

promedio se utilizaron5 campos por cada área elegida.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

Los datos se expresan como la media :t el ES o media + el ES. Se utilizó el test de

ANOVA,seguido por el test Duncan, LSD o Newman-Keuls como contraste a posteriori

para el análisis de ploidia y de proliferación celular. Se realizó un ANOVAde 2 vías para

estudiar las diferencias entre el estrato basal y suprabasal para cada categoría histológica

y el estudio de las áreas NUMFy PREN entre la semana 6 a 10 de tratamiento.

Se utilizó el "test t" para estudiar las diferencias entre el epitelio normal y el tratado

con el vehiculo. Y se realizó una correlación de Pearson para determinar el valor de fondo

de Ia tinción.

Se consideró significativa una diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).

RESULTADOS

AJUSTE METODOLÓGICO DEL ANÁLISIS DE PLOIDÍA

o Determinación del tiempo de hidrólisis

El ajuste correcto de una curva de hidrólisis exige que se defina una meseta de

valores constantes. Si esta meseta es muycorta el margen de tiempo de trabajo se acorta

aumentando el error metodológico. En las curvas l, II, III (figura 15) se observan las

diferencias entre los distintos reactivos de Schiff preparados en laboratorio y el reactivo

Sección 1 b 64

comercial, con el cual la meseta de Ia curva recién se estabiliza a los 120 minutos. Este

tiempo es excesivamente largo si se lo compara con los utilizados en la literatura en otros

modelos y alarga el tiempo total de la técnica haciéndola menos manejable (figura 15b ).

En Ia curva con HCIBerna no se puede establecer claramente una meseta. El mejor

resultado fue el obtenido con el reactivo de Schiff preparado según Tomasi (1936) con

HCIMerck (figura 15c ). Se definió como tiempo de hidrólisis óptimo 90 minutos, dado que

a partir de los 60 minutos se estabiliza Ia curva con una meseta que proporciona

márgenes razonables de trabajo.

a ao c ao alTOD

8

o 1do 23° seo 4.50 560 «La 1700

tiempo (min)FIGURA15Curvas de hidrólisis. En cada uno de las casos serealizaron mediciones de TOD a distintos tiempos dehidrólisis en hepatocitos de hamster teñidos con la

v v v u n y, .n—v técnica histoquimica de Feulgen. Los datos se expresan0 100 2m seo 400 son coo 10m .

ww.» comola media1 DS.

a) Curva I, realizada con reacfivo de Schiff modificado y HCI Berna.b) Curva II,realizada con reactivo de Schiff comercial (Biopur) y HCIMerck.c) Curva III,realizada con reactivo de Schiflrsegún Tomasi (1936) y HCIMerck.

o Determinación del valor de fondo

La figura 16-a muestra valores de D.O. por píer obtenidos de cortes de hígado de

hamster de diferentes espesores (fondo Il). Se observa el error por lectura de fondo

debido exclusivamente a la D.O. del tejido cuando se hace blanco (100% de

transmitancia) fuera del corte sobre el medio de montaje. Cuando se realizaron medidas

en cortes con reacción de Feulgen (fondo I) se observaron los valores producidos por

tinción inespecífica. Habiendo determinado la existencia de error por lectura de fondo,

calculamos el factor de corrección para nuestro material en los cortes teñidos de

carcinomas de hámster sobre zonas citoplasmáticas extranucleares (figura 16-b).

Determinamos que el valor de fondo en nuestras condiciones de trabajo en cortes de 8

Sección I b 65

um de espesor fue de 0.022 j: 0.007 por píxel. Por lo tanto, incorporamos el valor de 0.022

como factor de corrección a nuestras mediciones de ADN, restándolo de los valores

crudos de TOD de la medida directa en cada caso cuantificado, antes de realizar el

análisis de ploidía.

aoa­

E ono- FIGURA16.>_<

3' ow Obtención del valor de fondo del

8 Feulgen.m' a) Valores de fondo l (4-), cortes teñidos

mi con Feulgen; valores de fondo II (-o),cortes sin tinción. Los datos se expresan

1 . , como la media i DS.5 to rs

espesor ( )b um b) Correlaciónentre TODy área estudiada.

w Las mediciones corresponden a distintas

u 37332;; “m áreas extranucleares de secciones debolsas de la mejilla del hamster, teñidas

con Feulgen. (espesor del corte 8 pm).Correlación de Pearson, p< 0.0001 F1_¿a=

8 92.848,valordefondo= 0.022/píxel.'­

o m ¿o ¿o .¿n 4., ¿o m

área (pixels)

ANÁLISIS DE LA PLOIDÍA

Se estudió si el vehículo del cancerígeno ejercía algún efecto sobre la ploidía. Los

valores de ploidía para el epitelio sin tratar (2.12 i- 0.43, n = 10) no difin'eron

significativamente del epitelio tratado con el vehículo (2.39 i 0.22, n = 6, t14=1.408, p =

0.18).

Luego se analizó si existían diferencias entre el estrato basal y suprabasal en las

categorías histológicas NUMF, H y D (Tabla 2) y no mostraron diferencias significativas.

Por Io tanto se calculó el valor promedio de los FCCde cada estrato obteniéndose un FCc

= 1.26 con el que se corrigió el valor de los linfocitos para obtener el valor diploide y se

trabajó con los valores de todo el espesor del epitelio.

Sección I b 66

C NUMF H D

Basal 2.23i0.13 2.78i0.10 3.11¿0.13 2.92i0.17

Suprabasal 2.01 i 0.17 2.58 i 0.13 2.83 i 0.21 2.96 i 0.24

TABLA 2

Valores de ploidía en áreas NUMFy pre-neoplásicas para los estratos basal y suprabasal. ANOVAde dos vias,variable estrato epitelial F1_124= 1.76 p= 0.18; variable categoria histológica F1 124= 8.18 p<0.0001; Interacción p =0.82. Los datos se expresan como la media + ES.

En Ia figura 17-a se observan los

resultados obtenidos al calcular la ploidía de a

los distintos grupos histológicos analizados.

Como se esperaba los Ca y CIS mostraron

un aumento significativo comparados con el

control. Pero en el caso de las categorías

pre-neoplásicas y la categoría NUMF los

resultados fueron de destacar. Las zonas

hiperplásicas y displásicas presentaron un

aumento significativo de Ia ploidía con

respecto al control y no difirieron entre si. En

el caso de las áreas NUMF,sus valores son

algo menores al de las categorías pre­

neoplásicas, pero significativamente mayores

que el control.

La figura 18 presenta un histograma de

ploidía representativo del epitelio control y de

Ia categoria NUMF, donde se manifiesta el

desvío en los valores de ploidía de esta última

hacia la derecha. La figura 18 presenta

histogramas de ploidía característicos de las

categorías pre-neoplásicas y neoplásicas de

la bolsa de la mejilla del hamster.

Al calcular el índice de aneuploidía se

observa claramente la diferencia entre las

Cancen'zación durante tiempos largos (desarrollo de tumores)

C NUMF H

C NUMF H D CIS Ca

FIGURA 17

Análisis de Ploidia de los distintos gruposhistológicos a las 16 semanas de cancerización.a) Valores de ploidía para las distintas categoríashistológicas, ANOVA F5155 = 7.93, p< 0.0001, ' p<0.05 vs C, comparaciones a posteriori, test Duncan.b) Indice de aneuploidía (ScER) en función de lasdistintas categorias hístológicas, ANOVA F5, 155=5.37, p< 0.0001, " p< 0.0001 para Ca vs el resto delas categorías y para CIS vs NUMF.'p< 0.05 vs Cy Ca. Comparaciones a posteriori, test Duncan.Los datos se expresan como la media + ES.

Sección I b 67

categorías pre-neoplásicas y neoplásicas. Los Ca y CIS (12.931 1.91 y 13.01;t 3.97

respectivamente) tienen un valor de 5CER muy elevado respecto de H y D (7.14i 1.6 y

7.061 1.66 respectivamente). Los tumores y Cis no difieren significativamente entre si. Ca

difiere significativamente de todas las categorías y CIS difiere significativamente de NUMF

y C. El índice de aneuploidía de H y D difiere significativamente de C y Ca . En cuanto a

las áreas NUMF su el SCER está disminuido significativamente respecto de CIS y Ca

(figura 17-b).

P=2.0410.07 25 4 P = 2.51 t0.10

P= 3.41i0.14

frecuencia

P = 4.09 :t 0.22 * P=4.4010.19

ploidía

FIGURA18

Histogramas de Ploidia representativos de cada categoria estudiada. a) Epitelio control. b) epitelio NUMF,c)hiperplasia, d) displasia, e) CIS, f) carcinoma.Jr moda

La linea punteada indica el valor 2C. P, valor medio de Ia ploidía i ES.

Sección I b 68

Al estudiar la proliferación celular (figura 19) se observa un aumento significativo del

Ll de Ca respecto del resto de las categorías y un aumento también significativo de la

proliferación celular de CIS, D y NUMFrespecto del control. Los valores de H son también

mas elevados que el control aunque en nuestra serie no alcanzaron significación.

0.3. FIGURA19

Indice de proliferación (LI) para lasdistintas categorias histológicas a las 16semanas de cancerización.ANOVA F5_53= 6.69, p<0.0001, " p< 0.0001

vs todas las categorias, 'p< 0.05 vs C.(comparaciones a posteriori, test Duncan).Losdatosseexpresanoomolamedia+ES.

0_2. ¡It

LI il

0.1'

C NUMF H D CIS Ca

o Cancerización en tiempos intermedios (lesiones pre-neoglásicas)

Se estudiaron bolsas cancerizadas entre 6 y 10 semanas. Al comienzo de este

período (6 semanas) predominan las lesiones hiperplásicas y prácticamente no se

encuentran zonas displásicas y esta relación se va invirtiendoa medida que aumenta el

tiempo de cancerización. Por ello para este estudio agrupamos las lesiones H y D en la

categoria pre-neoplásicas (PREN) separándolos de las áreas NUMF. Los carcinomas

(pequeños) aparecían hacia la semana 10.

En la figura 20-a se observa la dinámica de las áreas NUMFen etapas tempranas

de la cancerización. Si bien hay oscilaciones en la ploidía entre las distintas semanas, no

llegan a diferir del control (el control es un pool con los valores de ploidía de las bolsas

tratadas con el vehículo entre 6 a 10 semanas, no diferían entre sí los distintos tiempos) .

En el gráfico se incluyen los valores de las áreas NUMFmedidos en los tiempos largos de

cancerización (16 semanas). Es interesante notar que las zonas NUMF revelan un

aumento importante de la ploidía luego de 4 meses, al punto que difiere significativamente

de C. Ese aumento podría marcar un acúmulo de mutaciones que ya se evidencian

groseramente por análisis de ploidía y que aún no producen lesiones observables

morfológicamente.

Con respecto a las áreas PREN también observamos oscilaciones en la ploidía pero

el aumento de ploidía a los 4 meses es abrupto de manera que difiere con el resto de las

Sección I b 69

semanas y el control (figura 20-b). En este caso la ploidía podría estar reflejando la

transformación epitelial, que se evidencia morfológicamente en las displasias más severas

y CIS.

a 4i M FIGURAzo

Análisis de Ploidía de los3 - distintos grupos histológicos

para los tiempos intermedios de

5.5 cancerización.‘5 2 a) Valores de ploidía para lasTn. áreas NUMFentre la semana 6 y

10. F5_92= 4.58, p<1 ' 0.0005, comparaciones a

posteriori, test LSD, ' p< 0.0001

J u vsC.° g ; g, g, ¡o " 13 b) Valores de ploidía para las

control semanas áreas PRENentre la semana 6 y

b F5_125= p<4 - 0.00001, comparaciones a

BEN posteriori,test LSD,r p< 0.05 vsa: todas las categorias.

3 ‘ /I Losdatosse expresancomolamedia + ES.

g -Á M SereproducenenamboscasosQ 2 I Y losvalorescorrespondientesa la0- semana 16 pa'a facilitar la

1 comparación.

° g i a s 1.o " 'control semanas

En Ia figura 21 se observa el comportamiento proliferativo (LI)de NUMF y PREN en

los mismos tiempos. No existen diferencias significativas entre el LI de NUMF y PREN,

pero ambos grupos difieren de la mucosa control y solo a partir de Ia semana 7 son

significativas las diferencias.

Para NUMF a las 8 semanas los valores llegan a un punto máximo y a partir de allí

se estabilizan. Por su parte para las áreas PREN el valor máximo se observa a las 9

semanas de tratamiento y a partir de allí el índice disminuye. Ambas categorias muestran

un aumento de la proliferación celular respecto del comportamiento de Ia mucosa normal,

pero entre si la dinámica del LIes distinta.

En particular las áreas PREN disminuyen la proliferación notablemente a la semana

10 y a la semana 16 (figura 19) presentan un LI del mismo orden con leves diferencias

entre H y D. El índice de proliferación de las áreas PREN a las 10 semanas de

Sección I b 70

cancerización es mayor que el LIde las zonas NUMFa los 4 meses (figuras 19 y 21).

En la figura 22 se observan fotomicrografias de Ia reacción inmunohistoquímica para

BrDu, reflejándose la diferencia en la proliferación entre áreas control, NUMF y

carcinomas.

0'4 FIGURA 21

Índice de proliferación (LI). para las distintas categorias hrstologrcas enfunción de los tiempos intermedios0.31 . ..de cancenzacion (semana 6 a 10).ANOVA de 2 vias, factor categoriaF199: 0.85 p= 0.35, factor tiempo F539:

_-_¡02 4 4.95 p<0.0005, interacción F5,99=0.47p= 0.79. Comparaciones a posteriori,test Newman-Keuls * p< 0.05 y **p<

0.001 vs C. T tiempo en el que lasáreas NUMFllegan a un plateau.Los datos se expresan como Ia media

- Y . . . +ES0.0' r I. I I v |6 7 9

FIGURA 22

Fotomicrografias de campos representativos decortes con la reacción inmunohistoquímica paraBrDu. a) Epitelio control, se observan célulaspositivas dispersas (flecha) para BrDu en el estratobasal. Magnificación final 350X. b) Epitelio NUMF,se observó un aumento en la cantidad de células

positivas (flechas) en el estrato basal. Magnificación350X. c) Se observó numerosa cantidad de célulaspositivas (flechas) que reflejan la alta tasa deproliferación tumoral. Magnificación 350X.

Sección I b 71

CONCLUSIONES

La evaluación de Ia ploidía por análisis de imágenes, además de su uso habitual

en la evaluación diagnóstica y pronóstica de neoplasias, permite evaluar lesiones

pequeñas dentro de los cortes histológicos, para lo cual fue necesario realizar

ajustes metodológicos que aumentan la sensibilidad del método. Los ajustes que

hemos realizado fueron fundamentalmente la incorporación de factores de

corrección por el espesor de los cortes y por la lectura de fondo no específico.

Los valores muy elevados del contenido de ADN y el estado proliferativo en los

carcinomas y CIS, se correlacionan con las atipías nucleares observadas en los

preparados histológicos de rutina, teñidos con H-E.

Las alteraciones en la ploidía de las lesiones hiperplásicas y displásicas a los 4

meses de cancerización revelan que antes de la instalación de los carcinomas ya

existe una alteración importante en el contenido de ADN. La cantidad total de

ADN en los epitelios hiperplásicos y displásicos es similar y mayor que en Ia

mucosa control. Pero las áreas hiperplásicas presentaron diferencias entre el

estrato basal y suprabasal, revelando una marcada actividad del estrato basal.

Por su parte las áreas displásicas mostraron valores elevados de ADN en sus

estratos reflejando la pérdida de polaridad en esas zonas.

Las alteraciones de ploidía en las áreas NUMFdespués de tiempos largos de

cancerización revela la existencia de alteraciones de campo cancenzado antes

que se observen lesiones morfológicas. El análisis de ploidía puede por lo tanto

ser usado como marcador de cancerización de campo en nuestro modelo.

SECCIÓNI-e

Análisis de Ia fibrosis inducida en el conectivo subyacente al epitelio transformado.

INTRODUCCIÓN

La transformación maligna de los epitelios induce cambios importantes en su

interacción con el conectivo. En general todas las actividades se intensifican y en cierto

modo vuelven a asemejarse a las embrionarias (en la página 22 nos hemos refen'do al

tema de las interacciones epitelio-mesénquima). Hay mayor producción de algunos

factores de crecimiento por parte de los epitelios transformados, que generan en el

conectivo diferencias en la proporción de sus elementos constitutivos. Además, las células

cancerosas tienen sus propias regulaciones e inducen cambios importantes en el

microambiente (lngber, 2002).

En el modelo de cáncer bucal de la bolsa de la mejilla del hámster se desarrollan

cuadros desmoplásicos muy tempranamente, subyacentes al epitelio cancen'zado pero

todavía sin alteraciones morfológicas evidentes (epitelios NUMF). Se produce una

fibrohialinosis que engrosa notablemente la pared de la bolsa. Cuando aparecen las

displasias epiteliales, estos se acompañan de una marcada angiogénesis sub-epitelial,

caracterizada por una proliferaciónde células endoteliales y neo-vasos rodeados de poca

sustancia intercelular sin fibras colágenas, que desplazan Ia fibrosis hacia planos más

profundos en el espesor de la bolsa. Este tejido Iaxo constituirá finalmente el estroma de

los carcinomas. Las áreas de fibrohialinosis en cambio, quedan formando parte de Ia

pared de Ia bolsa en las áreas cubiertas por epitelio NUMFo hiperplásico.

Pueden plantearse diversas preguntas sobre la fibrosis. Podría ser que influencie la

transformación maligna del epitelio, o por el contrario, que Ia misma sea provocada por

factores liberados por las células transformadas o bien que ambos procesos fueran

expresiones independientes de alteraciones en los dos tejidos inducidas por los

carcinógenos sobre estos distintos tipos celulares. De cualquier manera, la inducción de

fibrosis en el modelo de la bolsa de la mejilladel hámster es un hecho concomitante con

los estadios pre-malignos y no con el desarrollo de los carcinomas.

Del mismo modo, la presencia de fibrosis en las lesiones pre-malignas de la

mucosa bucal humana es un hecho frecuentemente descripto, aún sin conocer su relación

con el comportamiento epitelial. La relación entre fibrosis y cáncer bucal se evidencia

Sección I c 73

fuertemente en la entidad conocida como fibrosis de la submucosa (OSMF entidad

precancerosa prevalente en la lndia, ligada al hábito de mascar betel, descn'pta en la

página 36), la cual, básicamente, es una reacción inflamatoria crónica subepitelial con

cambios fibro-elásticos en la lámina propia (Pindborg, 1989). Su patogenia aún hoy no ha

sido dilucidada ni tampoco el porqué de su naturaleza pre-neoplásica, si bien existen

diversas especulaciones al respecto. Por un lado se piensa que los cambios histológicos

tempranos (la infiltración yuxtaepitelial de células inflamatorias) serían una respuesta al

irritante local (betel, que es un cancerígeno reconocido) (Srinivasan y Jewell, 2001b). Por

otro lado existen trabajos que muestran la falla existente en la remodelación del colágeno

en la OSMF, debido a alteraciones de su síntesis normal por efectos genotóxicos sobre

los fibroblastos (Jeng y col., 1994; Reichart y co|., 1994; Tsai y col., 1999).

Actualmente han comenzado a aparecer trabajos que analizan Ia expresión de

oncogenes implicados en la tumorigénesis del CCEB en pacientes con OSMF. Así

Srinivasan y col. han reportado la expresión aumentada en biopsias de pacientes con

OSMF de: PCNA, c-myc, TGF-o. y EGFR. Estos dos últimos se destacan, ya que

presentan una expresión diferencial en los distintos estratos epiteliales (Srinivasan y

Jewell, 2001a; Srinivasan y Jewell, 2001b). Estos resultados refuerzan la evidencia de la

naturaleza pre-cancerosa dela OSMF.

Existen otras lesiones de la economía, con cuadros fibrosos, relacionadas con los

procesos de transformación o recurrencia maligna. Un ejemplo de ellos es la fibrosis

hepática, responsable del aumento en la recurrencia de carcinoma hepatocelular (Esnaola

y col., 2002). De hecho Esnaola (2002) propone que el grado de fibrosis debería ser

incluido en la estadificación de los hepatocarcinomas. La fibrosis hepática se presenta

comúnmente en respuesta a Ia injuria crónica del higado (incluyendo el abuso de alcohol

e infecciones virales persistentes, enfermedad biliar entre otras). Es sabido que el

mecanismo celular subyacente a la fibrosis hepática es similar a la respuesta del

organismo a diversas injurias. Es por ello que la fibrosis hepática es tomada como

paradigma en la respuesta de un órgano ala injuria(Scott, 1993).

Por otro lado, la cirrosis hepática se comporta como lesión pre-maligna, siendo una

de las causas de carcinoma hepatocelular (Cotran y col., 1999).

También se ha relacionado el comportamiento de otros tipos de tumores con la

naturaleza fibrosa de su estroma. Así por ejemplo el comportamiento biológico de los

carcinomas gástricos cirróticos, caracterizados por un estroma fibroso, es diferente con

respecto a los de otro tipo morfológico (Tanimoto y co|., 1991).

Sección 1 c 74

OBJETIVOS

o Analizar cuantitativamente las áreas de fibrosis inducida en el modelo de

cáncer bucal en la bolsa de la mejilla del hámster.

o Relacionar cronológicamente la evolución de la fibrosis en relación al avance

en agresividad de las lesiones epiteliales.

o Determinar en el modelo la importancia de la fibrosis como indicador

temprano de cancerización de campo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron para este estudio 67 bolsas de hámsters sometidos al protocolo

estándar de cancerización (según se describió en la Sección l-a).

Se estudiaron los siguientes tiempos de cancerización: 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16 y 17

semanas y los correspondientes controles topicados solamente con el vehículo (mineral

oil). En cada grupo se estudiaron entre 5 y 10 bolsas.

TÉCNICA DE PICRO SIRIUS-RED

Se realizaron cortes, de 7 um de espesor, adyacentes a los preparados teñidos con

H-E, utilizados para el estudio microscópico del modelo (Sección l-a). Se seleccionaron

las zonas de estudio. Se realizó la técnica histoquímica de Picro Sirius-Red para

coloración de fibras colágenas (García del Moral, 1993). Para la tinción se utilizó una

solución de rojo Sirio- ácido pícrico (Rojo sirio F3BA) al 1% en solución acuosa saturada

de ácido pícrico. La solución se preparó con 48 horas de anticipación a su utilización para

permitir la maduración de la misma y cuando no se la observó saturada se agregaron

cristales de ácido pícrico.

Los cortes se desparafinaron, hidrataron y Iavaron en agua corriente por 10 minutos.

Con la solución rojo Sirio- ácido pícn'co se colorearon durante 30 minutos a temperatura

ambiente, luego se los deshidrató rápidamente en alcohol absoluto (diferenciación) y

finalmente se aclararon y montaron con bálsamo de Canadá.

Sección I c 75

Con esta técnica se observan las fibras colágenas en color rojo intenso. Las fibras

elásticas y musculares y demás elementos del corte toman una coloración amarillo de

fondo (figura 23). Mediante luz polarizada puede observarse que el colágeno es una

estructura anisotrópica en cortes longitudinales e isotrópicas en cortes transversales. Los

diferentes colores de polarización (verde o amarillo) dependen de la orientación de las

fibras en los cortes. Cuando el colágeno es muy denso o hialinizado se produce una

característica birrefringencia roja.

WMLas áreas seleccionadas de acuerdo con el tipo de lesión epitelial suprayacente se

evaluaron en un analizador de imágenes (LANAlS-Mef., CONICET-CNEA) con un

aumento de 2.5X. Las imágenes se capturaron y digitalizaron para su análisis mediante

dos programas de computación para mediciónde longitudes y áreas.

Se cuantificaron: áreas de fibrosis y de epitelio suprayacente; longitud del epitelio

medida en aproximadamente la mitad de su espesor y la longitud de la membrana basal.

Se calculó: índice de fibrosis 1 (IF1)= área de fibrosis/longitud epitelial, e indice de fibrosis

2 (IF2)= área de fibrosis/área de epitelio, y las relaciones: longitud basal/longitud

epitelial, área de fibrosis/longitud basal.

Luego de procesar los datos se observó que la relación lF1 no discriminaba entre las

distintas categorias de lesiones epiteliales, debido a que con el grado creciente de

malignización la relación longitud basal/longitud epitelial se altera progresivamente. En

efecto la longitud de la membrana basal aumenta en relación al avance del proceso de

cancerización (figura 24). Debido a esto se decidió cuantificar la fibrosis en base al IF2.

Por otro parte el lF1 no permitía incluir en el análisis a los carcinomas dado que en ellos

es muy dificilcuantificar la longitud de las membranas basales.

r4

Sección I c 76

FIGURA 23

Fotomicrografia de una sección de labolsa de la mejilla del hamster teñidacon Picro Sirius-Red. Se observan las

fibras colágenas en color rojo intenso.Las fibras elásticas, musculares y demáselementos del corte toman unacoloración amarillo de fondo. Se

esquematiza en color rojo el áreaepitelial medida y en color celeste el áreafibrosa subyacente medida. Con losdatos de las áreas se calcula el lF2.

E FIGURA24¿13

3 Valores de Ia relación longitud de lag) membrana basal I longitud epitelial para¿9 las distintas categorias estudiadas.’33, Se observa un aumento de dicha relacióng desde NUMF hacia CIS. Los valores sec» expresan como la media + ES.5

c NUMF H D crs

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos se expresan como la media i el ES o media + el DS.

Se utilizó el test de ANOVA, seguido por el test de Newman-Keuls o LSD como

comparación a posteriori.

Se consideró significativa una diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).

Sección I c 77

RESULTADOS

La figura 25 muestra el cuadro fibroso característico del modelo CBMH,subyacente

a un epitelio NUMF(semana 7). Se observa también la imagen histológica caracteristica

del modelo entre la semana 8 y 10 cuando aparece un tejido conectivo laxo vascularizado

subyacente al epitelio cancerizado y suprayacente a la fibrosis (figura25 c y d).

FIGURA 25

Áreas desmoplásicas subyacentes al epitelio cancerizado de la bolsa de la mejilladel hámster.a) Muoosa normal. b) Epitelio NUMF con un importante cuadro desmoplásioo subyacente (7 semanas decanoerización). c) Área PREN con tejido laxo subepitelial situado inmediatamente por debajo de la membrana basal ypor encima del área de fibrosis (9 semanas de canoerización). d) Se observa con mayor magnificación el área de tejidolaxo subepitelial por encima de la fibrosis, a las 9 semanas de canoerización.Magnificación final: a, b, d 350X, c 200X

En la figura 26 se observan fotomicrografías de cortes teñidos con Picro Sirius-Red

observados con luz polarizada. En la bolsa normal el tejido conectivo muestra fibras

birrefringentes en verde amarillo. En la bolsa cancerizada, las zonas NUMF,con epitelio

igual al control, muestran la fibrosis subyacente que debido a su densidad refringe en

color rojo intenso. En cambio, el estroma tumoral mas laxo, muestra refringencia de colorverde.

Figura 26

Mucosa normal de la bolsa de la mejilla delhámsterteñida con Picro Sirius-Red

a) Las áreas en color rojo subyacentes al epiteliofueron cuantificadas por análisis de imágenesb) Fotomicrografia de la sección presentada en a),observada bajo luzpolarizadaMagnificación 80 X.

Tinción de Picro Sirius -Red en un área NUMF.

a) Las áreas en ooIor rojo subyacentes al epitelio(flechas) fueron cuantificadas por análisis deimágenes.b) Imagendela sección presentada en a), observadapor microscopía de polarización.

‘ Magnificación 80 X

» , ‘ Tinción de Picro Sirius -Red en un área de un«. 4 carcinoma.

a) Se observó una disminución en la intensidad de lap tinción.

', ‘ b) Imagen de microscopía de polarización del2,, 4 preparado presentado en a), el color verde indica Ia

‘ t}; -_ baja densidad del colágeno.' Magnificación 100 X.

Sección I c 79

AI estudiar el indice de fibrosis 2 (IF2) en cada tipo de lesión epitelial en las bolsas

cancen‘zadas 16-17 semanas, luego de la aparición de los tumores, observamos una

diferencia significativa entre las áreas NUMFy el control (figura 27). A su vez las áreas

NUMFse diferenciaron del resto delas categorías pre-neoplásicas en las que el índice es

notoriamente menor. En los carcinomas se produce una disminución significativa de la

fibrosis respecto del grupo control y del resto de las categorias histológicas (figura 27).

2.0 ­

0.5 ­

C NUMF H D CIS Ca

FlGURA 27

Valores del IF2(área de fibrosis I área epitelial) para las diferentes categorias histológicas a las 16 semanas decancen'zación. ANOVAF5.55: 14.65 p< 0.0001, 'p <0.001 vs todas las categorias. Comparaciones a posteriori, testNewman-Keuls. Los datos se expresan como la media + ES.

EIpatrón de fibrosis decreciente desde las áreas NUMFhacia Ca nos aportó un dato

biológicamente relevante puesto que al igual que en el análisis del contenido de ADNen

donde los epitelios de aspecto normal pero sometidos a la cancen'zación, presentaban

índices de ploidia diferentes, también el tejido conectivo subyacente se observaba

alterado. A partir de estos datos estudiamos la cronodinamia de la fibrosis en relación a la

transformación epitelial.

Al analizar los cuadros fibrosos entre la semana 6 a 10 en las áreas NUMF se

observa un aumento importante del IF2 en la semana 7 (figura 28-a) (el control

corresponde a los datos de un pool de bolsas tratadas con el vehicqu a los distintos

tiempos experimentales). A las 8 semanas esos valores parecen mantenerse para luego

disminuir levemente hasta casi llegar a los valores de la semana 6. Estos valores se

mantenían constantes en la semana 12 (donde comienzan cuadros de CIS y algunos

tumores incipientes) y en Ia 16.

Sección I c 80

En cuanto a las áreas con lesiones PREN (hiperplasias y displasias) (figura 28 b)

observamos claramente un pico de fibrosis a la semana 7 el cual va ir disminuyendo hasta

llegar casi al valor de Ia mucosa normal, entre las semanas 8 y 16.

a 2 5 N MF

2 * a: *

1.5 4NLL

1 J.

0.5 ­

0 ' I l I I I Ñr |s a 1o 12 16

control semanas

b 25* * PREN

2 .

1.5 ­NL_L T

1- í .L\í 1__ i0.5 ­

0 J ÑI’ ji r I I I I6 7 a 9 1o 12 16

control semanas

Figura 28

Valores del IF2 (área de fibrosis! área epitelial) para las diferentes categorias histológicas para los tiemposintermedios de cancerización.a) Valores de IF2 para las áreas NUMF entre la semana 6 y 10, 12. ANOVAF7,79: 2.23 p<0.05, comparaciones aposteriori, test LSD ‘p<0.005 vs C.b) Valores de IF2 para las áreas PREN entre Ia semana 6 y 10, 12. ANOVAF135: 2.21 p<0.05, , comparaciones aposteriori, test LSD 'p<0.005 vs C.Los datos se expresan como Ia media + ES.

Se reproducen en ambos casos los valores correspondientes a la semana 16 para facilitarla comparación.

Sección l c 81

CONCLUSIONES

La fibrohialinosis en el modelo de cáncer bucal de la mejilla de la bolsa del hámster

aparece muy precozmente, antes de que se evidencien cambios morfológicosen el

epitelio transformado.

El mayor volumen de fibrosis en el modelo se observó en Ia semana 7.

Las lesiones hiperplásicas, displásicas y las micro-invasiones se acompañan de un

tejido Iaxo subepitelial situado inmediatamente por debajo de la membrana basal y

por encima del área de fibrosis, la cual va disminuyendo en volumen a medida que

progresan las lesiones epiteliales.

El tejido Iaxo muy vasculan‘zado forma finalmente el estroma de los carcinomas.

La fibrosis junto a la ploidía de las áreas pre-neoplásicas son una manifestación

temprana de la cancerización de campo.

SECCIÓNII-a

Expresión del factor de crecimiento fibroblástico-básico.

INTRODUCCIÓN

En la sección l hemos abordado el estudio de la inducción de cuadros fibrosos en el

tejido conectivo subyacente al epitelio cancerizado desde el aspecto morfológico,

cuantitativo y su relación con la cronodinamia del proceso carcinogénico bucal

experimental. Tanto con el análisis de la fibrosis como con el de los cambios epiteliales,

estimados a través de la ploidía, hemos podido asociar los distintos cuadros histológicos

que se suceden en la cancerización de la bolsa de la mejilla del hámster con los

parámetros estudiados. A la vez esos cambios se presentaron como manifestaciones de

un campo cancerizado semejante al que se produce en la cavidad bucal humana.

Hemos descripto como los cuadros desmoplásicos originales se manifiestan en una

primera instancia como una marcada fibrohialinosis que persiste durante las etapas

tempranas para ser a su vez reemplazada por una proliferación angioblástica que

finalmente posibilitará la nutrición de las masas tumorales, las cuales en este modelo no

presentan un estroma fibroso.

Partiendo de estos resultados nos planteamos nuevas preguntas sobre la existencia

de esa fibrosis y el porqué de su dinámica de aumento y posterior disminución.

Un primer enfoque consistió en el análisis de poblaciones celulares presentes en el

tejido conectivo subyacente al epitelio cancerizado. Diversos trabajos mencionan la

presencia de distintos tipos celulares en el infiltrado celular subepitelial durante la

cancerización. En general se observa una movilización de monocitos, eosinófilos,

mastocitos y linfocitos desde las primeras etapas de la cancerización. Elovic et al han

reportado la presencia de eosinófilos en el infiltrado inflamatorio en el tejido conectivo

adyacente al epitelio transformado en Ia bolsa del hámster y demostraron que eran la

principal fuente de TGF-a (Elovic y col., 1990). Luego Ghiabi demos'tlaque esoseosinófilos productores de TGF-a se reclutaban en las zonas de desarrollo tumoral

(Ghiabi y col., 1992). El TGF- a est aumentado en el epitelio de las lesiones pre ­

neoplásicas respecto del epitelio sin tratamiento mientras que los carcinomas si bien Io

expresan, esa expresión no difiere en magnitud de la de las lesiones pre-neoplásicas odel CIS.

Sección II a 83

Con respecto a los mastocitos se ha reportado una correlación positiva entre

desarrollo de los carcinomas de la bolsa y la densidad de mastocitos (Flynny col, 1991).

Se observó hacia la semana 8 de cancen'zación un aumento en la densidad de mastocitos

y su degranulación. El máximo infiltrado se describió entre las semanas 12 y 16 (Flynn y

coI., 1991). En este caso no existen reportes que relacionen específicamente alguna

citoquina o factor de crecimiento en particular con la movilización de mastocitos.

Lógicamente los distintos tipos celulares movilizados durante el proceso carcinogénico

liberan diversos factores de crecimiento. Si bien existen reportes de aumento y

disminución en la expresión de determinados FC en la carcinogénesis de la bolsa del

hámster, en general estos cambios no han sido asociados a un determinado tipo celular.

En la sección l-a hemos mencionado los distintos oncogenes y genes supresores

asociados a este modelo. Se ha estudiado el rol del EGF y su receptor. No se ha

encontrado expresión de EGF en Ia bolsa de la mejilla del hámster pero si de TGF-a. AI

analizar la expresión del receptor para estos dos factores de crecimiento se reportó por

análisis inmunohistoquímicopresencia de EGFR en etapas tempranas (4 semanas), en

áreas de displasia y en zonas focalizadas de los carcinomas mientras que no se observó

expresión en el epitelio normal (Shin y col., 1990).

Otro tipo de FC estudiado en el modelo es el TGF-B 1. En cultivos celulares se

analizó la relación del TGF-B1 con el fenotipo angiógo. Se reportó que Ia

transformación al fenotipo angiogénico coincide con la producción elevada de TGF-B1y la

activación del oncogen H-ras (Lingen y col., 1997). Mediante análisis inmunohistoquímico

en cortes de tejido. se reportó expresión extracelular no constante de TGF-B1en el con'on

de la bolsa sin tratar; mientras que en Ia carcinogénesis se observó expresión intra y

extracelular a las 8 semanas. En el caso de los carcinomas la expresión fue solamente

extracelular (Zenklusen y col., 1994).

No existen muchos mas datos reportados sobre otros factores de crecimiento y

principalmente datos que relacionen FC con las diferentes lesiones del proceso

carcinogénico en la bolsa del hamster. En menor medida, existe información sobre FCrelacionados a la fibrosis y/o angiogénsis en el modelo estudiado. Hay reportes que

discuten un posible rol cooperativo del TGF-a con otras citoquinas o inducción de factores

angiogénicos por otros tipos celulares como por ejemplo los fibroblastos (Chang y col.,

1989) sin aventurar concretamente que otras citoquinas estarían involucradas. Por otra

parte existen antecedentes de administración de IGF y PDGF en la bolsa para estudio de

la patcgenia de la enfermedad periodontal. En ese caso no se reportó rol alguno para el

Sección Il a 84

PDGF ni para el IGF en los cuadros displásioos en la bolsa dela mejilladel hamster (Shih

y col., 1996), y ya hemos mencionado (página 21) que tanto el PDGF, como el IGF actúan

por la misma vía de transducción de señal que el EGF.

Sabiendo que el TGF-a y TGF-B habían sido analizados en el modelo, y actúan a

través de distintos tipos de receptores celulares, encaramos el estudio de la expresión de

un factor de crecimiento fibroblástico para explorar otro factor de crecimiento que pudiera

involucrar en su acción Ia interacción entre fibroblastos, angioblastos y el epitelio.

Los factores de crecimiento fibroblástico están involucrados en la transmisión de

señales entre el epitelio y el tejido conectivo e influencian el crecimiento y diferenciación

epidérmico. Ya hemos mencionado que presentan un rol importante en Ia restauración del

tejido normal luego de una injuria así como un posible rol a través de su expresión

aberrante en la tumorigénesis (Partridge y ool., 1996).

En el caso particular del CCEB existen reportes sobre la presencia del FGF básico y

ácido (b-FGF y a-FGF respectivamente) en los mismos. Los reportes son dispares.

Trabajos con biopsias de CCECC describen la expresión de b-FGF, destacando que en

un mismo tumor se observan áreas claramente positivas y otras negativas. Los autores

han interpretado que las zonas negativas para el factor mencionado serían las zonas

hipóxicas del tumor (Schultz-Hector y Haghayegh, 1993). Otros trabajos encuentran que

el nivelde b-FGF en tumores de cabeza y cuello y su mucosa adyacente es igual o menor

al de la mucosa normal; y que dentro de los tumores aquellos diferenciados presentan

una expresión más alta de b-FGF en relación a los pobremente diferenciados. En el

mismo trabajo se reportan CCC en los que no se observó expresión del factor (Janot y

co|., 1995). Otro autor reporta en biopsias de CCEB una intensa expresión

inmunohistoquímica del FGF-2 y del a-FGF en carcinomas diferenciados y no

diferenciados (Myoken y col., 1994). Este último reporte no coincide con el de Wakulich

quien encuentra marca inmunohistoquímica positiva del b-FGF en displasias y CCEB y

poca o ninguna expresión de a-FGF (Wakulich y co|., 2002). En este último trabajo

también se reporta expresión del receptor tipo 2 y 3 de FGF en áreas displásicas y CCEB

(Wakulich y col., 2002).

Con estos antecedentes y Ia hipótesis de que la fibrosis es una manifestación de la

desregulación epitelio-mesénquima en el proceso carcinogénico, decidimos analizar la

expresión inmunohistoquímica del b-FGF en el modelo de la bolsa de la mejilla del

hámster, Io que nos permitía abordar el estudio de los tejidos epitelial y conectivo en

conjunto.

Sección II a 85

EL FACTOR DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO-BÁSICO (b-FGF)

El b-FGF o FGF-2, es uno de los prototipos de la gran familia de factores de

crecimiento que unen heparina, se expresa en distintos tejidos y tiene un amplio espectro

de actividad biológica (Yoshitake y Nishikawa, 1992). Está muy relacionado con el a-FGF,

un polipéptido encontrado en un rango mas restringido de tejidos. Ambos péptidos el

ácido y el básico comparten un 55% de homología en sus secuencias aminoacídicas y

presentan las mismas funciones biológicas, aunque el b-FGF parece ser un agente mas

potente en mayor cantidad de tejidos (Mansson y col., 1990; Root y Shipley, 1991).

El b-FGF está relacionado al crecimiento, diferenciación, migración y sobrevida de

una amplia gama de tipos celulares (Bikfalviy col., 1997). Originalmente se reportó acción

del b-FGF sobre células de origen mesodérmico o neuroectodérmico (Folkman y

Klagsbrun. 1987; Gospodarowicz y col., 1987a; Gospodarowicz y col., 1987b), luego se

demostró que también presenta actividad mitogénica sobre tipos celulares den'vados del

ectodermo (Shipley y col., 1989; Takahashi y col., 1989).

El b-FGF fue originalmente identificado en la glándula pituitaria por su actividad

mitogénica sobre la línea celular BaIb/c 3T3 (Gospodarowicz y Moran, 1975;

Gospodarowicz y col., 1975a). Inicialmente se lo identificó como una proteína de 15 kd

(Gospodarowicz, 1975; Gospodarowicz y col., 1975b) luego se encontró que la forma de

15 kd representa un producto de proteólisis de la estructura primaria de la proteína que

originalmente es de 18 kd (Bikfalviy col., 1997). En el humano se han encontrado formas

de mayor peso molecular de la proteína (22, 22.5, 24 kd) que son el resultado de la

iniciación de la traducción en sitios alternativos al AUG, como el CUG. Actualmente se ha

sumado a las formas de alto peso molecular ya conocidas una de 34 kd resultante de un

mensajero con un cuarto codón de iniciación CUG (Arnaud y col., 1999). Por lo tanto las

isoformas de alto peso molecular del FGF-2 son extensiones amino-terminales colineales

de la proteína de 18kd (Delrieu, 2000).

Mientras que la proteína de 18KDa es de localización citosólica, las formas de alto

peso molecular contienen secuencia señal para localización nuclear, secuencia que

posibilita que el núcleo celular sea blanco de acción del FGF-2 en muchos casos (Delrieu,

2000).

La homología de secuencia para los b-FGF en un amplio rango de especies es muy

alta (mayor al 90%) (Nugent y lozzo, 2000). Su secuencia aminoacídica presenta

características distintivas, fue descripta originalmente (Abraham y col., 1986) en pituitaria

Sección II a 86

bovina como una proteína de 155 aminoácidos. La estructura primaria del péptido revela

la presencia de 4 residuos de cisteína, ausencia de puentes disulfuro intramoleculares y

una alta proporción de residuos de naturaleza básica, que hacen que la molécula en su

conjunto presente características alcalinas (pl = 9.6). A su vez posee 2 sitios específicos

(Ser 64 y Thr 112) que pueden ser fosforilados por la proteína kinasa C (Bikfalviy col.,

1997). (figura 29).

Distintos grupos han determinado la

estructura cristalina de la forma de 18kd de la

proteína en presencia o ausencia de fragmentos

de heparán sulfato (Faham y col., 1996). En base

a esos estudios se ha podido determinar que la

unión del FGF-2 a la heparina o al heparán sulfato

casi no modifica la estructura de la misma, pero si

que ellos facilitan que las moléculas de b-FGF se

asocien en dimeros y oligómeros de gran orden

(Conrad, 1998).

La interacción con la heparina protege al _FIGURA29 Modelo espacial de la estructura

FGF-b de la desnaturalización por calor o clivaje de| FGF.2.La estructuracristalinade rayos-Xfue determinada en presencia de heparina (en

a través de proteasas (Nugent y Iozzo, 2000) y rojo)suele almacenarse en la membrana basal unido

a la heparina. La heparina es sintetizada solamente por los mastocitos del tejido

conectivo, pero el heparán sulfato tiene una amplia distribución en la matriz extracelular

de mamíferos así como los proteoglucanos. A estos dos tipos de moléculas se une

también el b-FGF. Esta cualidad de almacenamiento en la MEC de los FGF y del b-FGF

en particular, determina el interés de su estudio en relación al análisis de la disrupción

epitelio-mesénquima.

El FGF-2 interactúa con 4 receptores específicos de superficie celular. Se ha

propuesto que el FGF-2 posee 2 sitios separados de unión a sus receptores, los cuales le

permitirían a una molécula de b-FGF unirse a dos receptores o interactuar con un receptor

en dos posiciones distintas (Kan y col., 1993). Los proteoglucanos pueden aumentar la

afinidad del FGF-2 por sus receptores (Yayon y coI., 1991) y potencialmente actuar como

un puente que facilita la dimerización de los mismos. También se ha identificado un sitio

de unión a la heparina en el FGFR1 dando lugar a conjeturas sobre la posibilidad de un

complejo terciario de unión entre FGF-2, proteoglucano y receptor (figura 30).

Sección II a 87

FIGURA 30

Modelo de la interacción del FGF-2con los

proteoglucanos de matriz extracelular.

hepafán 'V‘ 5 . .. ., ..sulfato Se esquematlza la establllzaCIonde la unIon

FGF2 / \\ del factor con sus receptores de membrana alibre través del heparán sulfato.complejo FGF­heparán sulfato

Finalmente ya hemos mencionado en Ia página 20 evidencias de presencia de los

FGF en procesos tumorigénicos. El b-FGF es un potente agente angiogénico que

contribuye al crecimiento de diversos tumores sólidos como melanomas, osteosarcomas y

hepatomas (Pusztai y col., 1996). Se ha probado que actúa en forma autócrina en gliomas

y meningiomas humanos (Takahashi y col., 1990; Takahashi y col, 1992). Se ha

observado sobre-expresado en astrocitomas y recientemente se ha reportado expresión

nuclear de FGF-2 en astrocitomas humanos (Fukui y col., 2003). En algunos tipos

tumorales como en el carcinoma de próstata, se ha observado alterada su expresión y la

de su receptor tipo 1(Giriy col., 1999).

El b-FGF contribuye al desarrollo y progresión de tumores. Se ha reportado el

aumento en la expresión del ARN mensajero del b-FGF, respecto de la mucosa normal,

en carcinomas gástricos cirróticos, caracterizados por un estroma fibroso y un rápido

crecimiento. En esa situación se ha sugerido que el FGF-2 producido por las células

tumorales podria participar en la extensa fibrosis y angiogénesis como un factor parácrino

actuando sobre fibroblastos y células endoteliales (Tanimotoy col, 1991). Otros ejemplos

relacionan al b-FGF con la regulación del crecimiento tumoral mientras que solamente el

VEGF sería el responsable de Ia angiogénesis, como en el caso de los condrosarcomas

humanos (Furumatsu y col., 2002).

Sección II a 88

RECEPTORES DE FGFs

Los receptores que unen FGF; (FGFR) y desencadenan la señal celular

correspondiente, son 4 receptores transrnembrana del tipo tirosin quinasa, y están

codificados por 4 genes independientes (FGFR 1 al 4) (Hatton' y col., 1990; Safran y col.,

1990; Yayon y col., 1991; Partanen y col., 1991). Los FGFR tienen actividad tirosin

quinasa citosólica en el dominio carboxi-terminal y poseen 3 regiones similares a

inmunoglobulina extracelular en el dominio amino-terminal (Lee y col., 1989). Distintos

ARN mensajero generados por splicing son las diversas formas que se conocen de los

FGFR, los cuales difieren en sus secuencias extracelulares y poseen propiedades únicas

de unión al ligando. Un segundo evento de splicing sobre otro exón da como resultado

una tercer variante del dominio similar a inmunoglobulina y así surgen las variantes Illa,

lllb, Illc de los receptores 1 al 3 (Johnson y col., 1991; Werner y col., 1992; Chellaiah y

col., 1994). El FGFR-4 no sufre splicing alternativo en esa región (Vainikka y col., 1992).

La interacción de los FGF; con sus receptores es de alta afinidad e induce la

dimerización del receptor y la activación de su capacidad tirosin quinasa intrínseca. Esta

activación es sucedida por la autofosforilacióndel receptor que luego se convertirá en un

blanco para la unión y activación de una variedad de moléculas señal intracelulares

(Jeffers y col., 2002). Los FGFs también se unen con baja afinidad a los proteoglucanos

presentes en la mayoría de las superficies celulares y de la MEC. Ya hemos mencionado

que la unión de los FGFs a los proteoglucanos estabiliza la interacción FGF/FGFR.

También se han identificado proteínas que unen FGF; y estimulan su actividad, y han sido

identificadas como proteinas chaperonas que liberan a los FGFs' inmóviles en los

proteoglucanos (Tassi y col., 2001; Aigner y col., 2001).

Distintos FGF presentan interacciones de alta afinidad con los 4 receptores,

dependiendo de las variantes del receptor estudiadas.

En particular se ha observado expresión del receptor tipo 2 y 3 de FGF en áreas

displásicas bucales y CCEB (Wakulichy col., 2002). Se ha estudiado también la expresión

del FGFR-1 y 2 en carcinomas de cabeza y cuello en relación al grado de diferenciación

de los mismos (Janot y col., 1995).

Sección II a 89

OBJETIVOS

Analizar la expresión del b-FGF durante el proceso de carcinogénesis de la

bolsa de Ia mejilla del hamster.

Analizar la expresión de los receptores FGFR 2 y 3.

Discn’minarla actividad de las diferentes isoformas del b-FGF en el proceso

de cancen'zación.

Relacionar la expresión del b-FGF, sus isoformas y sus receptores con la

fibrosis y la vascularización característicos del modelo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron para este estudio 108 bolsas de hámster sometidos al protocolo

estándar de cancen'zación (según sección l-a).

El material se dividióen los siguientes grupos:

Determinación inmunohistoquimica de b-FGF y FGFR-2 y 3.

Tiempos experimentales, 6 a 10 semanas, 20 animales y 16-17 semanas, 10

animales. Controles para cada uno de los tiempos experimentales, sometidos

solamente a acción del vehícqu (mineral oil), 20 animales. Bolsas normales sin

tratamiento, 5 animales.

Determinación de b-FGF por western blot (WB).

Tiempos experimentales: 6 a 10 semanas, 30 animales y 16-17 semanas, 8

animales. Controles para cada uno de los tiempos experimentales topicados

solamente con el vehículo (mineral oil), 10 animales. Bolsas sin tratamiento, 5

animales.

El material utilizado para las determinaciones inmunohistoquimicas se dividióen dos

partes. Una mitad se fijó en formol al 10% para el procesamiento de rutina y tinción con H­

E y para la detección IHQ de los FGFR. La otra mitad se fijó en acetona para el

Sección II a 90

procesamiento en parafina y posterior detección IHQdel b-FGF.

Las bolsas extraídas para su posterior determinación por WB del b-FGF, se

almacenaron en freezer a -80 °C hasta su procesamiento.

En cortes teñidos con H-Ede cada caso, se seleccionaron áreas de: carcinoma (Ca),

carcinoma in situ (ClS), displasia (D), hiperplasia (H), y epitelio sin cambios morfológicos

(NUMF),en cada tiempo experimental.

DETERMINACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL b-FGF

Se utilizaron cortes de 5 pm del material fijado en acetona, montados en

portaobjetos silanizados. Se desparafinaron en xilol y se hidrataron en etanol de

graduación decreciente. Previamente a la hidratación con etanol 96% se incubaron los

cortes en metanol peróxido de hidrógeno de 100 volúmenes (relación 100:1) durante 30

minutos para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se terminó la

hidratación y se realizó un bloqueo de sitios inespecificos en PBS-albúmina 0.3% (Gibco

BRL, bovine albumine fraction V) durante 30 minutos. Posteriormente se realizó Ia

incubación con el anticuerpo pn'mariodurante toda la noche a 4°C en cámara húmeda. El

anticuerpo utilizado fue un anti-bFGF humano realizado en cabra (147-G, sc-79,

policlonal, de concentración 200ug/ml, Santa Cruz) dilución 1:100 del vial madre en PBS.

Luego se realizaron lavados en PBS-albúmina 0.3% y los cortes se incubaron con el

anticuerpo secundario (anti-lgG de cabra, concentración 7.1g/l, Dako, Denmark) en

dilución 1:100 en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego de 3

lavados de 5 minutos cada uno en PBS-albúmina 0.3%, se incubaron los cortes con el

complejo peroxidasa - antiperoxidasa (soluble complex, horseradish peroxidase,

concentración 1.29/I. Dako, Denmark) en dilución 1:200 en cámara húmeda a temperatura

ambiente durante 1 hora y luego se realizaron lavados con PBS. Se reveló con 3,3­

diaminobenzidina (Sigma) 0.05% en PBS y 1% de peróxido de hidrógeno, bajo

microscopio y se detuvo la reacción con agua destilada. Se realizó una coloración

contraste con hematoxilina seguida de deshidratación, aclaración y montaje con bálsamo

de Canadá.

Como control de especificidad de la señal se utilizaron algunos cortes que fueron

incubados omitiendo el anticuerpo primarioo secundario (figura 31).

Sección Il a 9]

FIGURA 31

Mucosa sometida a la reacción inmunohistoquimicapara el FGF-2omitiendo el anticuerpo primario.

Debido a que los controles (tanto la mucosa normal como la tratada con el vehículo)

muestran una clara y homogénea reacción estrictamente localizada en la capa basal y la

carcinogénesis produce una alteración de éste patrón se calculó el grado de marcación

suprabasal (GMS) como: número de células positivas suprabasales normalizadas por el

número de células totales suprabasales del área elegida (magnificación40X). Para ello se

utilizóun software “ad hoc”, que permite cuantificar las células seleccionadas.

DETERMINACIÓN INMUNOHISTOOUÍMICA DE LOS FGFR- 2 Y 3.

Se utilizaron cortes de 5 um de espesor del material fijado en formol al 10%,

montados en portaobjetos silanizados.

Los cortes se desparafinaron e hidrataron (serie de graduación decreciente de

alcoholes). Previo a la hidratación con alcohol 96% se incubaron los cortes en peróxido de

hidrógeno al 2% en metanol (H202 20 volúmenes) durante 30 minutos para bloquear la

actividad de la peroxidasa endógena y se completó Ia hidratación hasta agua destilada.

Luego se realizó una recuperación antigénica incubando los cortes con HCl 1N durante 25

minutos a temperatura ambiente. Se realizaron lavados con agua y se bloquearon los

sitios inespecíficos con suero fetal bovino (SFB) al 5% en PBS, durante 30 minutos a

temperatura ambiente y posteriores lavados con PBS.

A continuación se incubaron los cortes con los anticuerpos primarios

correspondientes durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda.

Los anticuerpos utilizados fueron:

o Bek (C-17) realizado en conejo anti- la porción carboxi-terminal del FGFR-2

humano (sc-122, Santa Cruz, 200ug/ml en PBS), lgG policlonal.

o FGFR-3 (C-15) realizado en conejo anti- la porción carboxi-terminal del

FGFR-3 humano (sc-123, Santa Cruz, 200ug/ml en PBS), IgG policlonal.

La dilución utilizada en cada caso fue 1:100 del vial madre en SFB.

Sección II a 92

Luego de la incubación se realizaron nuevos lavados en PBS y se incubaron con el

anticuerpo secundario (lgG anti-conejo dilución 1:100 en SFB, Vector) en cámara húmeda

a temperatura ambiente, durante una hora. Luego de lavados con PBS, se incubó con el

sistema ABC (Vectastatin ABC,Vector) durante 30 minutos en cámara húmeda a

temperatura ambiente. Se reveló con diaminobenzidina (Sigma) 0.05% en PBS y 1% de

peróxido de hidrógeno, bajo microscopio y se detuvo la reacción con agua destilada. Se

realizó una coloración contraste con verde de metilo y deshidratación, aclaración y

montaje con medio sintético (DPX, Fluka).

Como control de especificidad de la señal se utilizaron cortes incubados omitiendo el

anticuerpo primario o secundario (figura 32).

a FIGURA32

a) Muoosa sometida a Ia reacción inmunohistoquimicapara el FGFR-2 omitiendo el anticuerpo primario.

‘ b) Mucosa sometida a Ia reacción inmunohistoquimica1.}, b para el FGFR-3 omitiendo el anticuerpo pn'man'o.

DETERMINACIÓN DEL b-FGF POR WESTERN BLOTS.

o Preparación de Homogenatos

1-El tejido se cortó con tijera para obtener piezas de menor tamaño y posteriormente

fue disgregado manualmente.

2-EI tejido disgregado se homogenizó en buffer de extracción celular, en la siguiente

composición: Tris 0.5M (ICN, Ultra Pure) pH= 6.8, glicerol (Sigma) al 10% y laurilsulfato de

sodio (SDS) (Sigma) al 20 %. Inmediatamente antes de la utilización del buffer se

agregaron inhibidores de proteasas (Sigma): fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 10 mM,

leupeptina 1mg/ml, y apoprotinina 1mg/ml. Se utilizaron aproximadamente 5 pl de buffer

por mg de muestra y se continuó la disgregación mecánicamente.

3- Se sonicaron los homogenatos hasta obtener una suspensión homogénea.

4-Se centrifugaron los homogenatos durante 10 minutos a 140009 en ultracentrífuga

refrigerada (4°C).

5- Finalmente se recuperó el sobrenadante. El mismo se almacenó a -80°C hasta su

Sección II a 93

posterior utilización, separándose una alícuota para realizar la determinación de

proteínas.

Cada extracto celular correspondió a una sola bolsa tratada o control.

Determinación de proteinas

Se utilizó el ensayo comercial de Bio-Rad basado en el método de Lowry (Lowry y

col., 1951) para determinación de concentración de proteínas en extractos celulares

obtenidos con detergente (Bio-Rad DC Protein Assay Kit II, Richmond). Luego de la

reacción colorimétrica se realizó Ia lectura dela D.O. en espectrofotómetro a 750 nm.

Se realizaron curvas Standard de albúmina por duplicado en cada determinación

(curva de calibración con BSA del kit Bio-Rad: img/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.1mg/ml,

0.01mg/ml y blanco con agua destilada).

Western blots

Reactivos utilizados

Archilamida 30% (Sigma)

Buffer Tn's 1.5M, pH 6.8 (se lleva a pH con HCI), para el gel separador (resolving gel).

Buffer Tn's 1M, pH 8.8 (se lleva a pH con HCI), para el gel concentrador (stacking gel).

SDS 10% (Sigma)

Persulfato de amonio, APS 10% (Sigma).

N'N' N... N.. A A

Buffer desnaturalizante (2x, se diluye a 1X con la muestra): SDS 5%, B-mercaptoetanol

(Sigma) 15%, glicerol 60%, Tn's 0.3M, pH 6.8, Azul de Bromo fenol (Sigma) 0.05%.

Buffer de corrida: Tris-Glicina-SDS (10X, Sigma), se diluye en agua destilada antes de

LILIl .edíamiua, TEMED, (Sigma, 99% para electroforesis)

usan

Buffer de transferencia: buffer de corrida 1X (800ml) y metanol (Merck, pro analysi, 200ml).

Marcadores de peso molecular. Kaleidoscope prestained standards, Bio-Rad.

PBST (PBS-Tween 20 al 0.05%), PBS pH 7.4 (Sigma).

Membrana de nitrocelulosa, hybond C (0,2 um) Amersham; PVDF Millipore.

Solución de bloqueo: leche descremada al 5% en PBST.

Sustrato quimioluminiscente: ECL Plus Western Blotting detection reagent, RPN 2132,

Amersham LifeScience.

Pelicula fotográfica, Kodak.

Sección II a 94

Procedimiento

Se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones

desnaturalizantes (SDS-PAGE), usando el sistema de buffers disoontinuos-de Laemmli

(Laemmli, 1970). Se utilizó un gel concentrador al 5% y un gel separador al 15%.

Los extractos proteicos (70 ug de proteínas totales por calle), se separaron

previamente a Ia siembra en el gel, disolviéndolos en buffer desnaturalizante y se

hirvieron durante 5 minutos. La electroforesis se realizó durante aproximadamente 60

minutos a 50 mNgel hasta observar la resolución del gel, durante los primeros 20 minutos

de la electroforesis se aplicó una corriente de 30 mApara resolver el gel concentrador.

Luego se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 100Vdurante una hora.

Para la determinación inmunológica de la proteína en estudio, se realizó un bloqueo

de sitios inespecíficos en las membranas, durante 30 minutos en agitador a temperatura

ambiente (20-22 oC). Luego se incubaron las membranas con un anticuerpo policlonal

anti-bFGF (FGF-2-147- sc79, rabbit lgG de Santa Cruz), dilución 1:1000 en PBST durante

toda la noche a 4 oCen agitación. Luego se realizaron 3 lavados de 10 minutos cada uno

con buffer PBST, y posterior incubación de las membranas con el anticuerpo secundario,

anti-lgG de conejo realizado en cabra conjugado con peroxidasa (ICN, Cappel, molécula

entera) en dilución 1210000 en PBST, durante 30 minutos en agitación a temperatura

ambiente. Finalmente se realizaron lavados en PBST y se revelaron las bandas positivas

por químioluminiscencia, incubando durante 5 minutos en agitación con el sustrato. Para

visualizar la señal se expusieron las membranas a una placa radiográfica en cuarto

oscuro durante 20 a 25 minutos dependiendo de la señal desarrollada.

En cada gel se separó un conjuntode marcadores de peso molecular.

Como control de carga de las calles, cada membrana fue incubada con un

anticuerpo anti-actína policlonal (actin, C-11, lgG de cabra, sc-1615, Santa Cruz) en

dilución 1:1000 en PBST, durante 30 minutos a temperatura ambiente y posteriores

lavados con PBST. Se utilizó un anticuerpo secundario anti lgG de cabra (ICN, Cappel,

molécula entera) en dilución 1210000en PBST.

Se repitieron los experimentos con 4 a 6 bolsas de cada tiempo experimental.

SecciónII a 95

Controles

Se utilizaron como controles específicos del anticuerpo primario:

1- Una proteina fusión del FGF-2 de 41 kd, producida en E. Coli, correspondiente

a la secuencia aminoacídica del FGF-2 humano entre los aminoácidos 10-140

(FGF-2-10-140, 50-4305 WB, Santa Cruz) sembrada a 10ng por calle.

2- FGF-básico purificado de glándula pituitaria bovina (Sigma F-3133) sembrado

a 5 ng por calle.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos se expresan como la media i ES. Para analizar el GMS se utilizóel test

de ANOVAde dos vias seguido por el test de Newman-Keuls como contraste a posteriori.

Se consideró significativauna diferencia con una significancia del 5% (ps0.05).

RESULTADOS

En la mucosa normal observamos inmunomarcación para FGF-2 solamente en el

estrato basal (figura 34-a). La marcación fue de localización citoplasmática y el patrón de

expresión a Io largo de toda la mucosa se presentó en parches. Importantes zonas de la

mucosa fueron positivas mientras que otras áreas se observaron negativas. El mismo

patrón de expresión se observó en la mucosa tratada con aceite mineral (figura 34- b y c).

Al estudiar las bolsas cancerizadas durante 4 meses encontramos que la expresión

de b-FGF en los carcinomas era baja y que en muchos carcinomas no había expresión

del factor. Por el contrario la mucosa adyacente a los tumores era positiva (figura 33), y su

patrón de marcación dependía del tipo de lesión pre-neoplásica que presentaba.

FIGURA 33

Reacción inmunohistoquimica del FGF-2 en uncarcinoma de la bolsa de la mejilla del hamster y sumucosa adyacente.No se observó inmunomarcación para el factor en elcarcinoma, mientras que la mucosa adyacente revelóexpresión del factor (flechas).Magnificación final 50X.

w

Figura 34 \

Sección II a 97

FIGURA 34

Expresión Inmunohlstoquímlca del FGF-2en el epitelio normal, control y carcinomas de la bolsa de la mejilladel hamster.a) Se observó expresión del FGF-2 en el estrato basal de la mucosa normal, marcación citoplasrnáfica, la marcación nofue homogénea a lo largo de todo el epitelio (detalle).b) y c) Mrcosa control, topicada durante 16 semanas con aceite mineral.d) y e) Ejemplos de carcinomas negativos para Ia IHQdel FGF-2.f) y g) Distintas áreas de carcinomas, con expresión del factor, clasificados como positivos.h) Detalle de un área positivade un carcinoma, se observan algunos núcleos positivos.l) Zona hiperplásica de la mucosa adyacente al tumor. Se observó marcación basal y suprabasal para el factor.

Magnificaciónfinaka,b,c130X;dye30X;fyg100X;hei300X.

Sección II a 98

AI analizar solamente los tumores observamos que aquellos que expresaban el

FGF-2 lo hacían por zonas. En un mismo tumor existían áreas positivas y otras negativas.

Las áreas positivas eran en su mayoria zonas diferenciadas del carcinoma, y dentro de

esas áreas la marca tendía a ser basal, de localización citoplasmática y en muy pocos

casos nuclear (figura 34, f- g-h).

Para clasificar los carcinomas en positivos y negativos, definimos como positivos a

aquellos que presentaban alguna zona positiva y como negativos a los que no

presentaron ningún tipo de reacción (tabla 3).

porcentaje TABLA3

negativos 64-3 (n = 9) Expresióndel FGF-2en carcinomas dela bolsa deI ¡l ' _

positivos 357 (n ___5) a me] la del hamster

Los datos de la tabla 3 revelan que un 65% de los tumores fueron negativos. El 35%

restante de los carcinomas presentó algún tipo de expresión de FGF-2. La mucosa

adyacente a los carcinomas expresa el FGF-2, pero no Io hace en forma homogénea. Las

áreas positivas de la mucosa se corresponden histológicamente con imágenes de

hiperplasia, displasia y hasta CIS, asi como también se observó una gran cantidad de

áreas NUMFpositivas. Tanto en las zonas NUMFcomo en las áreas pre-neoplásicas la

marcación fue basal y suprabasal. La cantidad de marcación suprabasal era mayor en las

lesiones de mayor gravedad (figura 34-i).

En las etapas mas tempranas, entre las semanas 6 y 10 del proceso carcinogénico,

el patrón de expresión fue similar al observado en la mucosa adyacente a los tumores y el

grado de marcación suprabasal difería entre las distintas semanas del tratamiento. En la

figura 35 se observa el grado de marcación suprabasal (GMS) para las áreas NUMFy

PREN, las cuales difieren significativamente entre si y con respecto a los epitelios control.

El GMS de las áreas PREN es notoriamente mayor que el de las áreas NUMF.A su vez

éstas presentaron un aumento significativodesde la sexta semana de tratamiento (figura

36), con un pico en Ia marcación a la semana 7, valor que luego vuelve al dela semana 6

y se mantiene así hasta Ia semana 10. Estas variaciones coinciden en tiempo con el

aumento de los cuadros de fibrosis subyacentes a las áreas NUMF descriptos en Ia

sección l-c. Esto indicaría una acción de este factor más preponderante en el desarrollo

de la fibrosis pre-tumoral que en el desarrollo de los tumores.

Sección I] a 99

0.6

l + NUMF—e— PREN

0.4 '

GMS

0.2 ­

o.“ icontrol semanas

FIGURA 35

Cuantificación de la expresión inmunohistoquímica del FGF-2 a través del GMS en los tiempos intermedios decanoen'zación (semana 6 a 10) para áreas NUMFy PREN.ANOVA de dos vias, factor categoria F1143:26.8 p< 0.0001 ("), factor tiempo F5143: 6.25 p< 0.0001 , interacción F5.143:1.92 p = 0.09. Comparaciones post-hoc Nevwnan-Keuls ' p< 0.05 vs. control.

T máximo valor de GMS para NUMF.

Los datos se expresan como la media i ES.

Las zonas PREN presentaron un aumento de la expresión suprabasal del FGF-2

muy importante respecto de C y áreas NUMFdesde la semana 6 y con un patrón distinto

al de NUMF (figura 36- c-f-g). El GMS de las zonas PREN es elevado con oscilaciones

entre la semana 8 y 9 para disminuir hasta casi alcanzar el valor de las áreas NUMFa la

semana 10. El notable aumento en el GMS refleja Io observado en áreas H y D entre las

semanas 6 y 9 donde en muchos casos (semana 9 en general) se observó todo el

espesor epitelial positivo para la expresión de FGF-2 (figura 36). Nuevamente estos

resultados recuerdan a la dinámica de los cuadros fibrosos subyacentes a las zonas

PREN analizados en la sección I-c. A su vez en los carcinomas tanto la expresión de b­

FGF como la fibrosis disminuyen hasta casi desaparecer.

ósemanas7semanas

8semanas9semanas

\

10semanas

Figura 36

SecciónII alOl

FIGURA 36

Expresión lnmunohlstoquímica del FGF-2en áreas NUMFy PRENentre la semana 6 y 10 de cancerizaclón.

AreasNUMF:a)yb),alas6semanasdecancenzaciónseobservómarcación basalysuprabasal.d)ye)Alas7semanasdetratanüentoseobsewómarcaciónentodoelespesorepitelial.h)AIas8semanasseobserva marcación basal y suprabasal.j) y k) A las 9 semanas se observa marcación basal y suprabasal y algunas zonas NUMFpresentan solo marcaciónbasal.

m) A las 10 semanas algunas zonas presentan solo marca basal.

Áreas PREN: c) 6 semanas, se observó expresión del FGF-2 en el estrato basal y suprabasal con localizaciónde lamarca citoplasmática.f) y g) A las 7 semanas la marcación es basal y suprabasal. Se observa en algunos casos marcación nuclear (flechas).i) 8 semanas, patrón similaral de las 6 semanas.l) 9 semanas, se observa marcación en todo el espesor epitelial.n) y o), 10 semanas, n) CIS, con marcación supraba'sal y estratos superiores negativos, o) área displásica negativa.

Nagnificación final: a, b, d, h, j, m 120X; g 600X; resto 500X

SecciónII al 02

Los WB confirmaron la expresión de b-FGF en la mucosa normal y en la tratada con

el vehículo. Se observó la expresión de 2 bandas de 18 y 24 kd respectivamente para la

proteína estudiada. En algunos casos se observó una banda de menor peso molecular

(16 kd), en muy baja intensidad (figura 37b-c).

Los extractos celulares de las bolsas tratadas por 6, 9 y 10 semanas revelaron en

todos los casos las mismas bandas observadas en la mucosa normal, con un aumento

importante en la intensidad de la banda de 18 kd respecto de la mucosa control. Las

bandas de 24kd y 16 kd presentaron intensidad disparar entre los distintos casos. Algunos

homogenatos correspondientes a bolsas tratadas durante 6 y 9 semanas presentaron las

bandas de 16 y 24 kd respectivamente mientras que otros extractos de 6, 9 y 10 semanas

no expresan la banda de 16 kd, pero si expresaron la banda de 24 kd (figura 37 c-d).

FC-Ïvl:n FGF, Ca Ca

FIGURA 37

Detección de b-FGFpor análisis de Western Blot.

Los extractos de bolsas normales, control, cancerizadas en distintostiempos y carcinomas con su mucosa adyacente fueron sometidos a SDS­PAGE 15% y transferidos a membrana de nitrocelulosa. Las membranas

aK“ fueron incubadas con anti-FGF-2.7rd

o <0 6‘ <0 <0 6‘MC 956 oa 09 MN MC 696 gafas?“ MC 656958 «056 (P o'ó

12‘“ ‘ ‘ , tskd V.

V ¿a “gd ,,»

a) Controles positivos: calle 1, FGF-2 de pituitaria bovina, calle 2, FGF-2 proteina fusión (santa Cruz); calles 3 y 4carcinomas de la bolsa de la mejilladel hamster. b) calle 1, mucosa control; calle 2 extracto de una bolsa tratadadurante 9 semanas con DMBA;calles 3 y 4 extractos de bolsas cancerizadas durante 16 semanas quepresentaban tumores. c) calle 1, mucosa normal; calle 2 mucosa control; calles 3, 4 y 5 mucosas cancerizadasdurante 6, 9 y 10 semanas respectivamente con DMBA. d) calle 1, mucosa normal; calle 2, 3 y 4 bolsascancerizadas durante 6, 9 y 10 semanas respectivamente con DMBA; calles 5 y 6 extractos de bolsascancerizadas durante 16 semanas que presentaban carcinomas. Se destacan las bandas corespondientes al FGF­2 de 18 y 24 kd y en los detalles inferiores el control interno de cada gel (actina). En cada calle se sembró elextracto proveniente de un animal experimental del tratamiento mencionado.

Sección II a103

Alestudiar las bolsas canoerizadas durante 4 meses observamos en todos los casos

la disminución en la expresión de la banda de 18kd respecto de las semanas 6, 9, 10 y del

control. La banda de 24 kd presentó una expresión variada (algunas bolsas no la

expresaron y otras si) y la banda de menor peso molecular (16 kd) no se observó en

ninguno de los casos.

Estos resultados además de definir el comportamiento de las diferentes isoformas,

globalmente coinciden con el patrón e intensidad del b-FGF observados por IHQ. En el

caso de los WB debe tenerse en cuenta que las bandas observadas en las calles

indicadas como carcinoma son la resultante de la expresión de la proteína en el tumor y la

mucosa adyacente.

EXPRESIÓN DEL FGFR-2 Y DEL FGFR3.

FGFR-2

En la mucosa normal observamos inmunomarcación para el receptor en todo el

espesor epitelial (figura 38-a). En el tejido conectivo subyacente la expresión del receptor

se observó en endotelios vasculares y fibroblastos. La marcación fue de localización

citoplasmática (aspecto puntillado)o de membrana y el patrón de expresión a lo largo de

toda la mucosa no fue homogéneo, con algunas zonas que no presentaron expresión del

receptor. El mismo patrón de expresión se observó en la mucosa tratada con aceite

mineral (figura 38-b).

AI analizar los carcinomas y la mucosa adyacente a los mismos observamos un

patrón de marcación similar al de la mucosa normal, con leves cambios. AI estudiar solo

los carcinomas se puede observar que la marca epitelial es importante con tendencia a

predominar en zonas basales en algunas zonas del tumor y en otras áreas se observa

marca en todo el cordón epitelial independientemente de su grado de diferenciación

(figura 38-f y g). En cuanto al estroma tumoral claramente se observa una disminución de

la marca, hasta encontrar áreas negativas. En Ia mucosa adyacente al tumor se observa

el mismo patrón de expresión que en la mucosa normal. En algunas áreas

(independientemente de su histología)se encontró una tendencia a la marca suprabasal.

Al analizar la expresión del FGFR-2 en las etapas tempranas de la cancerización

tampoco observamos diferencias ostensibles con la expresión del receptor en la mucosa

control. Al analizar detenidamente los casos correspondientes a la semana 6 y 7 también

observamos algunas áreas que independientemente del cuadro histológicopresentaban

una tendencia a la marca suprabasal, pero este patrón no era uniforme a lo largo de la

mucosa (figura 38-c y d). En algunos cuadros, se pudo observar marcación epitelial

Sección II a104

nuclear, sin encontrarse en cantidad, ni poder correlacionarse claramente con el cuadro

histológico o la etapa del proceso de canoerización. En cuanto al tejido conectivo se

evidenció la marca en endotelios y fibroblastos. En los casos de cuadros desmoplásicos la

marcación conectiva podía desaparecer u observarse por debajo del cuadro fibroso (figura

38).

v

Figura 38

Expresión inmunohistoquímica del FGFR-2enla carcinogénesis dela bolsa de la mejilladel hámster.a) Mucosa normal representativa que presentó expresión del receptor en todo el espesor epitelial y en el tejido conectivo.b) Mucosa control (16 semanas de topicación con aceite mineral) que presentó el mismo patrón de expresión que la mucosanormal. c) Epitelio cancerizado durante 6 semanas, se observó una tendencia a la marcación suprabasal y la misma fue delocalización citoplasmátioa. Se observó marcación en fibroblastos y endotelios. cl)A las 7 semanas de tratamiento se observó elmismo patrón de marcación que el observado alas 6 semanas. e) Ejemplode un área displásica a las 7 semanas de tratamiento,se observó igualpatrón de marcación que en d), evidenciándose marcación nuclear (flecha). f) Carcinoma con expresión estromaldel receptor con una tendencia ala marcación basal. g) Detallede un cordón tumoralcon marcación en todo el espesor epitelial.Magnificación final: a, 55X; b, c, d, 150X; e, 600X; f, iOOXy g 300X.

Sección II a106

FGFR-3

La mucosa normal también presentó expresión de FGFR-3. La marcación epitelial

fue de gran intensidad, mayor en Ia zona suprabasal y de localización citoplasmática. Los

fibroblastos y endotelios vasculares también presentaron una marca intensa (figura 39-a).

La marca fue homogénea a lo largo de toda la mucosa. La mucosa tratada con vehicqu

presentó el mismo tipo de marcación (figura 39-b).

Los carcinomas también presentaron una marca importante para el receptor y en

este caso el estroma tumoral fue claramente positivo tanto en fibroblastos como

endotelios vasculares (figura 39-f y g). La mucosa adyacente a los tumores presentó un

patrón similar al de los controles, con una acentuación en la tendencia de la marca

suprabasal.

En las etapas tempranas de cancen’zación (semana 6 a 10), no se observaron

diferencias ostensibles con la mucosa normal ni con lo observado a los cuatro meses de

cancen'zación (figura 39 c, d, e).

Figura 39

Expresión inmunohistoquímica del FGFR-3enla carcinogénesis dela bolsa de la mejilladel hámster.a) La mucosa normal presentó expresión del receptor 3 en todo el espesor epitelial, Ia marcación fue de localizacióncitoplasmática. Se evidenció intensa marcación de endotelios y fibroblastos. b) El epitelio control presentó las mismascaracteristicas que la mucosa normal. c) A las 6 semanas de tratamiento se observó el mismo patrón de expresión que elcontrol. d) y e) A las 7 semanas de tratamiento no se encontraron diferencias en Ia marcación respecto de c. f) Ejemplo de uncarcinoma, se observó expresión de FGFR-3 en estroma y parenquima. g) Detalle de un cordón tumoral con marcación en todoel espesordel mismo.

Magnificación final: f, 80X; b y g 200X; resto 160X.

Sección II a108

CONCLUSIONES

o El b-FGF se expresa en el epitelio de la mucosa normal de Ia bolsa de la

mejilla del hámster exclusivamente en la capa basal. Durante la

carcinogénesis aumenta su intensidad y su actividad se extiende a las células

suprabasales.

o En los carcinomas la expresión del b-FGF disminuye hasta casi desaparecer.

La isoforma que deja de expresarse es la de 18kd.

o Las variaciones del b-FGF coinciden con la evolución de la fibrosis

subepitelial.

o Los receptores FGFR-2 y 3 se expresan en el epitelio y en los fibroblastos y

endotelios de la mucosa normal. Su actividad aumenta en las lesiones pre­

malignas y se mantiene algo mas irregularmente en los tumores.

o Se interpreta que el b-FGF en el modelo de la bolsa de la mejilla del hámster

cumple un rol autócn'no-parácn'no en la interfase epitelio-conectivo con un

papel predominante en el desarrollo de la fibrosis temprana y en menor grado

en la angiogénesis tumoral, papel este último comprobado en muchas

neoplasias experimentales y humanas.

o La isoforma de 18kd del b-FGF sería Ia más involucrada en el desarrollo dela

fibrosis. Las otras isoformas podrian interactuar con los receptores que

mantienen su expresión, durante todo el proceso, en los fibroblastos,

endotelios vasculares y epitelios, incluyendo el epitelio tumoral.

SECCIONll-b

Estudio del factor de crecimiento de endotelios vasculares y la actividad proteolítica

INTRODUCCIÓN

En distintos tipos de neoplasias y especificamente en carcinomas bucales humanos

se ha estudiado la actividad angiogénica de los factores de crecimiento b-FGF y VEGF.

Como ya hemos comentado el b-FGF es un potente factor mitogénico de fibroblastos y

endotelios. En nuestro modelo de CBMH hemos encontrado (sección l-c) que el b-FGF

está primordialmente asociado a la producción de fibrosis pre-neoplásica y en mucho

menor grado a la neovasculan’zación de los tumores. En base a estos hallazgos

encaramos el estudio de la expresión del VEGF como una aproximación al estudio de Ia

angiogénesis en nuestro modelo.

Además, dado que se ha reportado (Miyagi y col., 1998; Un'a y col., 1998; Lo y

Hurta, 2002) regulación de actividad de proteasas por parte del b-FGF en distintos tipos

tumorales estudiamos actividad proteolíticade bolsas control y bolsas en distintas etapas

de cancerización.

El VEGF es el único factor angiogénico específico, dado que actúa selectivamente

sobre las células endoteliales que expresan sus receptores (Senger y col., 1983; Dvorak

y col., 1991). Bioquímicamente el VEGF es una glicoproteína que se une a heparina. Se

conocen 4 formas moleculares generadas por splicing alternativo, de 121, 165, 189 y 205

aminoácidos respectivamente (Ferrara y col., 1992; Ferrara, 1996). Las tres variantes de

menor peso molecular son producidas por células y de ellas la de 21 kd es soluble (Park

y col., 1993). Las formas de alto peso molecular se asocian a las células en la matriz

extracelular (Neufeld y coI., 1999). El VEGF induce permeabilidad vascular, regula la

producción de proteasas y promueve la diferenciación, movimiento y sobrevida de células

endoteliales, propiedades que determinan su actividad angiogénica.

Existen diversos reportes sobre la expresión y rol del VEGF en el CCEB. Muchos

trabajos relacionan Ia expresión del VEGF en el CCEB con la agresividad tumoral (Sauter

y col., 1999) o como un indicador pronóstico de sobrevida, dado que se encontró que

pacientes con tumores positivos para la expresión del VEGF presentaron menor

sobrevida que aquellos negativos para el factor (Sauter y col._ 1999). Sin embargo estos

Sección II b 110

resultados son controversiales debido a que otros reportes presentan evidencia de

disminución de expresión inmunohistoquímica del VEGF a medida que avanza la

tumorigénesis del CCECC (Tae y coI., 2000). Así mismo Carlile y col. reportan un rol

fisiológico del VEGF en la mucosa bucal pero no logran asociarlo a la angiogénesis en la

carcinogénesis bucal (Carliley col., 2001). En líneas celulares de CCEB se ha observado

promoción de angiogénesis con expresión del VEGF y aumento de la expresión de sus

receptores, KDR/fltk-1,en células endoteliales (Michiy coI., 2000).

El proceso angiogénico, la formación de nuevos capilares provenientes de vasos

sanguíneos ya existentes, es un evento fundamental en procesos biológicos como el

desarrollo embrionario, la reparación de heridas y la proliferación del endometrio y en

condiciones patológicas como las enfermedades neoplásicas o la artritis reumatoidea

(Folkman, 1995). Se ha calculado que una lesión en crecimiento de tamaño mayor 1-2

mm3 necesita la formación de nuevos vasos para su nutrición (Folkman, 1986; Folkman,

1990a; Folkman, 1990b).

Datos experimentales obtenidos en modelos de carcinogénesis química y animales

transgénicos demuestran que la angiogénesis precede a la formación tumoral, sugiriendo

que la progresión depende de un cambio de una etapa pre-vascular a una fase

angiogénica (Hanahan y Folkman, 1996). El proceso angiogénico tumoral involucra

distintos pasos secuenciales, que incluyen la degradación de la membrana basal y la

matriz extracelular de los vasos parentales, el movimiento de las células endoteliales

hacia la masa tumoral a nutrir, mitosis, formación de un lumen, formación de los nuevos

brotes vasculares, la formación de una nueva membrana basal y finalmente el

reclutamiento de los pericitos (Ausprunk y Folkman, 1977; Folkman, 1995). Cada uno de

estos pasos es regulado delicadamente (Kumar y coI., 1998). La inducción del proceso

angiogénico es mediada por liberación de moléculas por parte del tumor y las células del

huesped, que regulan positiva y negativamente el proceso y su evolución depende del

balance neto entre los factores angiogénioos estimulatorios e inhibitorios (Liottay Stetler­

Stevenson, 1991; Hanahan y col., 1996).

Se han identificado muchos factores angiogénioos como: interluekinae8, PDGF, el

factor de crecimiento de los hepatocitos y el VEGF asi como el b-FGF entre otros

(Folkman y Klagsbrun, 1987a; Folkman y Klagsbrun, 1987b; Folkman, 1995). Se han

identificado diversos agentes inhibitorios de la angiogénesis como trombospondina-l,

angiostatina, endostatina, interferon-a e inhibidores de metaloproteasas entre otros

(Folkman, 1995). Entre los agentes pro-angiogénicos los mas importantes son el VEGF,

Sección II b 111

el b-FGF y algunos autores incluyen al TGF-B (Rifl<iny col., 1993; Ferrara y Keyt, 1997;

Bikfalviy col., 1997). Nosotros hemos analizado la expresión del b-FGF en este modelo y

se ha reportado un aumento del TGF-B en lneas celulares de Ia bolsa de la mejilla del

hámster en el pasaje a fenotipo angiogénico de esas líneas celulares (Lingen y col.,

1997). El VEGF no ha sido estudiado en este modelo.

OBJETIVOS

o Estudiar la actividad de un factor de crecimiento angiogénico específico como el

VEGF a través de su expresión inmunohistoquímica en el proceso carcinogénico y en

los carcinomas del modelo de cáncer bucal de Ia bolsa de la mejilladel hámster.

o Analizar preliminarmente Ia existencia de actividad proteolítica en la carcinogénesis

de este modelo a través de zimogramas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la realización de zimogramas se utilizaron20 bolsas de hamsters, sometidos al

protocolo estándar de cancerización (según sección I-a) correspondiente a 4, 6, 9 y 10

semanas de cancerización (12 bolsas) y 16-17 semanas (3 bolsas) y sus

correspondientes controles con el vehícqu del canoerígeno (1 bolsa por cada tiempo) y 3

bolsas de animales sin ningún tratamiento.

Las bolsas se almacenaron en freezer a -80° C hasta su utilización.

Para determinar VEGF por IHQ se utilizómaterial fijado en formol neutro 24 horas e

incluidoen parafina. Se trabajo con el mismo material que se utilizópara la determinación

IHQ de los FGFR 2 y 3.

DETERMINACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL VEGF

Se utilizaroncortes de 5 um de espesor montados en portaobjetos silanizados, para

evitar su desprendimiento durante la recuperación antigénica.

Los cortes se desparafinaron e hidrataron en xiloI y etanol de graduacióndecreciente. Previo a Ia hidratación con etanol 96% se incubaron en alcohol metílico­

Sección II b l 12

peróxido de hidrógeno en relación 10021 (H202100 volúmenes) durante 30 minutos para

inhibir la actividad de la peroxidasa endógena. Luego se terminó la hidratación y se

realizó una recuperación antigénica incubando los cortes en buffer citrato (pH 4), en olla

a presión en horno de microondas a potencia máxima durante 5 minutos. Se dejaron los

cortes durante 20 minutos a temperatura ambiente, para luego continuar con el bloqueo

de sitios inespecíficos en PBS-albúmina 0.2% (Gibco BRL, bovine aibumine fraction V)

durante 10 minutos. Posteriormente se realizó la incubación con el anticuerpo primario

correspondiente durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda.

El anticuerpo utilizado fue un anti-VEGF humano realizado en cabra (VEGF-147,

200uglml, Santa Cruz) dilución 1:20 del vial madre en PBS.

Luego de la incubación se realizaron lavados en PBS-albúmina 0.3% y los cortes se

incubaron con el segundo anticuerpo biotinilado (dilución 12200, IgG Biogenex, Kit

Multilink)a temperatura ambiente durante 1 hora en cámara húmeda. Luego de nuevos

lavados con PBS-0.2% albúmina, se incubó con el complejo de peroxidasa­

estreptoavidina (Biogenex). Se reveló con 3,3-diaminobencidina (Sigma) al 0.05% en

PBS y 1% de peróxido de hidrógeno bajo microscopio y se detuvo la reacción con agua

destilada. Se realizó una coloración de contraste con hematoxilina y se realizó la

deshidratación, aclaración y montaje con bálsamo de Canadá.

Como control de especificidad de la señal se utilizaron algunos cortes que fueron

incubados omitiendo el anticuerpo primario o secundario.

Como control positivo se utilizaron cortes de riñón humano normal (Maeda y col.,

1998) (figura 40).

FIGURA 40

Control positivo para la reaccióninmunohistoquímica del VEGF.Corte histológico de riñón humano con reaccióninmunopositiva para el VEGF en los túbulosrenales.

Sección II b 113

ZIMOGRAMAS

MMArchilamida 40% (Sigma)

SDS 20%

Persulfato (APS) 10%

TEMED

Gelatina (solución stock 30mg/10ml).

Buffer Tris 1.5M, pH 8.8 (se lleva a pH con HCI), 0.4% SDS, para el gel separador.

Buffer Tn's 0.5M, pH 6.8 (se lleva a pH con HCI), 0.4% SDS, para el gel concentrador .

Buffer desnaturalizante: 0.25M Tn's, SDS 10%, sucrosa 4%, Azul de Bromo fenol

(Sigma) 1mg/ml.

Buffer de com'da: glicina 0.25M, Tris 25 mM, SDS 1%, pH 8.3 (solución stock 10X), se

diluye en agua destilada antes de usar.

Solución para activación enzimática: 2.5% Tn'tónX-100 (Sigma).

Buffer enzimático: 100mM Tn‘s, 15 mM C8CI2, pH 7.4.

Comassie: 0.1% Comassie R-250 (Sigma), 10% ácido acético, 30% metanol.

Homogenatos y Zimograma

Los bolsas se homogenizaron en buffer RIPA (50mM Tris, pH 8.0 con 150 mM

NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycolato y 1% NP40) y los homogenatos resultantes se

centrifugaron durante 15 minutos a 4°C. Se fraccionó el sobrenadante y congeló a -80°C

hasta ser utilizado.Los pellets se descartaron. Las muestras (70ug/calle) se sembraron y

corrieron en geles de poliacrilamida (8,7%) conteniendo un 1,5% de gelatina (Sigma)

hasta su resolución. Una vez finalizada la electroforesis, los geles fueron incubados

durante media hora en 2,5% tritonX-100 y luego durante 18 horas en el buffer para la

actividad enzimática a 37°C. Los geles fueron teñidos con Coomasie Blue R-250 y

desteñidos con agua, con la aparición de bandas claras (indicativas de actividad

proteolítica) en un fondo azul.

Sección II b l 14

RESULTADOS

EXPRESIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DEL VEGF.

La mucosa normal de la bolsa de la mejilla del hámster presentó expresión del

VEGF en el epitelio en todo su espesor, con escasa reacción en los fibroblastos

conectivos (figura 41-a). La marcación fue claramente citoplasmática. Los controles

tratados con aceite mineral presentaron el mismo tipo de inmunomarcación (figura 41- b).

Al estudiar las bolsas cancerizadas durante 4 meses (luego de la aparición de

tumores) observamos expresión de VEGF tanto en los carcinomas como en la mucosa

adyacente (figura 42). El patrón de expresión en el epitelio de la mucosa adyacente fue

similar al del control, pero la marcación fue de mayor intensidad. El tejido conectivo

subyacente presento marcación fibroblástica y endotelial, la intensidad y cantidad de

marca parecía depender de la magnitud los cuadros de fibrosis. Los carcinomas

presentaron una marcación citoplasmática intensa en el parénquima tumoral con mayor

intensidad en los estratos suprabasales. Algunos carcinomas presentaron una débil

reacción en vasos y fibroblastos del estroma (figura 41c, d, e, f).

FIGURA 42

Reacción inmunohistoquímica para el VEGF enun carcinoma de la bolsa de la mejilla delhamster y su mucosa adyacente.Se observó inmunomarcación para el factor en elcarcinoma (flechas azules) asi como en la mucosaadyacente (flechas rojas).

Magnificación final 1OOX.

En las etapas tempranas de la cancerización, la expresión del VEGF muestra

patrones muy similares al descripto. A las 6 semanas de tratamiento también

observamos marcación epitelial, de mayor intensidad que la mucosa normal y de

tendencia suprabasal. No encontramos diferencias relacionadas con el tipo de lesión pre­

neoplásica que presentaba el epitelio, pero si en relación al cuadro observado en el tejidoconectivo.

Figura 41

Expresión inmunohistoquímica del VEGFen el epitelio normal, control y carcinomas de la bolsa de la mejilla delhamster.a) Muoosa normal, se observó expresión del VEGFen todo el espesor epitelialy escasa marcación en eI tejido oonectivo. b) Lamucosa control (16 semanas de tratamiento con aceite mineral)presenta el mismo patrón de marcación que Iamucosa normal.c, d y e) Ejemplos de carcinomas que expresaron eIVEGFen el estroma tumoral.f)Detalle del carcinoma presentado en e), seobserva localizacióncitoplasmática dela marcación.

Magnificación final: b y e 100X; f 350X; resto 300X.

Sección II b 116

El tejido conectivo subyacente presentó marcación fibroblástica y de endotelios

vasculares (figura 43-a, b). Cuando existían importantes cuadros desmoplásicos se

observó marcación de tendencia suprabasal y las áreas fibrosas eran positivas (Figura43

c, d).

EI mismo patrón de expresión epitelial y conectiva se repitió avanzada la

carcinogénesis. Donde existían cuadros fibrosos se observó expresión del VEGF. Donde

el tejido conectivo era menos denso o laxo igualmente se encontró expresión fibroblástica

o endotelial del VEGF (figura 43 g y h).

En algunas bolsas con importantes cuadros fibrosis (6 y 7 semanas de tratamiento)

se observó infiltrado celular positivo para el VEGF.

FIGURA 43

Expresión lnmunohistoquimica del VEGFentre la semana 6 y 10 de cancerización.a) Epiteliotratado durante 6 semanas, área NUMF,se observó marcación epitelial de gran intensidad pa'a el VEGF aligualqueeneltejidoconeclivo. b)AlasGsemanasdelIalamiento,en unejemplodeárea PREN,seobservaelmisrnopatrón que en la mucosa normal. c) 7 semanas de tratamiento, área NUMF con un importante cuadro fibrososubyacente, se encontró marcación epitelialde tendencia suprabasal y también en el área librosa. d) 7 semanas, áreaPREN, se observó el mismo patrón que en c. e y f) 8 sermnas, zonas NUMF (e) y PREN (f), se observa el mismopatrón que en las semanas anteriores.g y h) 10 semanas, se encontró marcación en el tejidoepitelialy conectivo con los patrones observados previamente;h, detalle de Ia marcación con tendencia suprabasal y marcación vascular.

Magnificación final: g 150X; c, d,f 200X; resto 350X

Inca3

Sección II b 118

RESULTADOS PRELIMINARES SOBRE ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.

El zimograma reveló actividad proteolitica muy baja para la mucosa normal, que se

corresponde con el patrón de la metaloproteasa-2 (MMP-2)en su forma latente (LMMP­

2) (figura 44).

A las 4 semanas de tratamiento encontramos un aumento de la actividad

proteolitica para la forma latente de la MMP-2 y actividad de la forma activa (AMMP-2)de

la enzima, respecto del control. AI mismo tiempo experimental aparece una banda

correspondiente al patrón de actividad de la metaloproteasa-9 en su forma latente

(LMMP-9),no observado en la mucosa normal (figura 44, calle 1 y 2-3).

A las 6 semanas de caroinogénesis se repite el resultado de las 4 semanas pero la

actividad de la LMMP-2y AMMP-2es ostensiblemente mayor. Para la MMP-9se observa

el mismo patrón que a las cuatro semanas (figura 44, calles 4- 5). A las 9 semanas la

actividad de MMP-2 disminuye hasta casi desaparecer en los carcinomas (figura 44

calles 6 a 9). La actividad de la MMP-9es muy baja a las 9 semanas e indetectable en

los carcinomas.

MN 5‘46“ 629“ (¿995° o'ó

FIGURA 44

Actividad proteolitica en las etapas tempranas de cancerización del modelo de la bolsa de la mejilladel hamster y carcinomas. Los extractos de bolsas individuales normales, cancerizadas en distintostiempos y carcinomas con su mucosa adyacente fueron sometidos a electroforesis 8.7%—gelatina1.5%.

calle 1, mucosa normal.calles 2 y 3 extractos de bolsas cancerizadas durante 4 semanas.calles 4 y 5 extractos de bolsas cancerizadas durante 6 semanas.calles 6 y 7 extractos de bolsas cancerizadas durante 9 semanas.calles 8 y 9 extractos de bolsas cancerizadas durante 16 semanas.

Sección II b 119

CONCLUSIONES

o El análisis IHQ reveló la expresión de VEGF en el epitelio y los endotelios

vasculares de la mucosa normal de la bolsa de la mejilla del hámster. Su

expresión no fue alterada por el tratamiento con el solvente del cancerígeno.

o Durante el proceso carcinogénico se observó un aumento de la expresión del

VEGF, pero no se observaron diferencias ostensibles en el patrón de expresión y

no se puedo relacionar el aumento a ningún tipo histológico de lesión en

particular.

o El cambio en el patrón de expresión epitelial se relacionó con la existencia

subyacente de cuadros fibrosos. Ante esa situación Ia expresión en el epitelio

trasfonnado tiende a observarse en los estratos suprabasales. Los cuadros de

fibrosis expresaron el VEGF.

o El tejido conectivo subyacente al epitelio transformado presentó un aumento de

la marcación en endotelios vasculares y fibroblastos .

o Los carcinomas presentaron intensa expresión del VEGF en el parénquima, en

sus capas suprabasales.

o No observamos relación entre la expresión del VEGF y la cronodinamia de

expresión del b-FGF.

o El zimograma realizado reveló un claro aumento de la actividad proteolitica a la

sexta semana de cancerización, respecto del control, las semanas 4 a 9 y de los

carcinomas. El patrón de actividad se corresponde con el de Ia MMP-2y MMP-9.

DISCUSIÓN

Siendo el modelo de cancerización de Ia bolsa de la mejilla del hamster el más

aceptado y más utilizado para estudios de cáncer bucal, se han analizado extensamente

las características de los tumores producidos en cuanto a número, tamaño y tipos

histológicos. Se ha prestado menos atención, en cambio, al estudio de las etapas previas

a la aparición de tumores. Sin embargo, el modelo reproduce no solamente los

carcinomas que se dan espontáneamente en la boca humana, sino que, también en

similitudcon Ia carcinogénesis humana, las neoplasias se dan en forma focal, precedidas

por lesiones pre-malignas multifocales, en una clara manifestación de la instalación de un

campo cancerizado. Dado que el carcinoma de la mucosa bucal, a pesar de los avances

logrados en metodologías diagnósticas y terapéuticas, ha mantenido su incidencia y sus

bajos índices de sobrevida (50% a 5 años) durante los últimos 20 años (Vokes y col.,

1993; Nagpal y Das, 2003), parece importante disponer de un modelo experimental bien

caracterizado que pudiera ser aplicado a estudios en el área de la detección precoz y la

prevención.

Durante la utilización del modelo en distintos protocolos experimentales en nuestro

Iaboraton’o (Schwint y col., 1996; Kreimann y col., 2001a; Kreimann y col., 2001b;

Kreimann y col., 2003) se han observado dos características de interés, hasta ahora no

analizadas en la literatura. Una de ellas es la inducción de alteraciones en el conectivo

subyacente al epitelio cancerizado. con la aparición muy precoz de una intensa fibrosis.

Estos cuadros semejan a las áreas de fibrosis que a veces se detectan en Ia base de

lesiones pre-malignas humanas y en particular, las manifestaciones más avanzadas

guardan estrecha similitudcon la fibrosis dela submucosa, entidad pre-cancerosa de gran

incidencia en los países en donde, como en nuestro modelo, los carcinógenos

permanecen durante tiempos largos sobre la superficie de Ia mucosa, debido al hábito de

mascar compuestos con componentes quimicos carcinogénicos.

La segunda caracteristica de notar en este modelo es la persistencia, aún en las

últimas etapas de aparición de múltiples tumores, de áreas de mucosa

macroscópicarnente sanas y microscópicamente cubiertas por un epitelio de

características morfológicas normales. Estas áreas, que obviamente, se dan también en la

cancerización humana, han sido denominadas en las primeras publicaciones (Schwint y

col., 1996) como zonas NUMF (no unusual microscopic features) y son un excelente

modelo para estudios de cancerización de campo.

Discusión 121

En base a estas observaciones, hemos dado especial énfasis en el presente trabajo

a la caracterización objetiva de algunos de los cambios que subyacen en la

transformación maligna del epitelio y en la desregulación de la interacción epitelio­

conectivo en un intento de aportar datos que pudieran ser trasladados a la biologíade las

lesiones pre-malignas humanas y a la búsqueda de marcadores de cancen'zación de

campo.

El análisis de ploidía, método utilizado en oncología para la gradación y pronóstico

de neoplasias, mostró en nuestro modelo, como era de esperar la aneuploidía de los

carcinomas, con datos coincidentes con lo reportado en CCE humanos (Kinoshita y col.,

1992; Schimming y col., 1998; Remmerbach y col., 2001).

El método resultó útilademás en la objetivación de las lesiones pre-neoplásicas. Los

núcleos de las áreas hiperplásicas y displásicas mostraron un aumento en la cantidad de

ADN de magnitud similar en promedio. Sin embargo al analizar separadamente los

estratos epiteliales se observa en las áreas hiperplásicas que el estrato basal presentó

mayor cantidad de ADN que el suprabasal, reflejando su preponderante actividad

proliferativa. En zonas displásicas en cambio, el aumento es homogéneo reflejando la

pérdida de polaridad del epitelio.

Esos datos junto a los de proliferacióncelular de las categorías preneoplásicas (H y

D presentaron valores de LIaumentados pero solo D difiere significativamente del control)

ponen nuevamente de manifiesto las diferencias entre áreas H y D. Las hiperplasias si

bien son un paso en la transformación del epitelial, también pueden ser cuadros reactivos

que se presentar en la bolsa frente a agresiones mínimas durante su uso fisiológico,de

modo que alguna de ellas pueden no corresponder a células transformadas

irreversiblemente (de allí su variabilidad en ploidía y proliferación) no así las zonas

displásicas. Estas últimas también son variables en contenido de ADN, pues presentan

distintos grados (leve, moderado y severo) al igual que en la boca humana, pero no son

compatibles con cuadros reactivos, sino de transformación epitelial.

La alteración en el contenido de ADN en lesiones displásicas de la cavidad bucal

humana han sido reportadas en un estudio sobre biopsias de leucoplasias (Sudbo y col.,

2001a); entre un 5 y 15% se clasifican histológicamente como displasias, y de ellas, un

15 a 20% avanzan hacia carcinoma (Sudbo y col., 2001a; Sudbo y col., 2001c). De

acuerdo al mencionado estudio, sus autores proponen que las leucoplasias con contenido

de ADN normal o diploide deben ser controladas; las leucoplasias con contenido de ADN

Discusión 122

intermedio a tetraploide son cuadros de muy dificil manejo clinico y evolución incierta,

debiendo también ser controladas y los cuadros con contenido de ADN aneuploide son

frecuentes y deben ser tratados como carcinomas. Hay un pequeño porcentaje de

lesiones Ieucoplásicas no displásicas. que se cree presentan un mínimo riesgo de

transformación a carcinoma, si bien el análisis de ploidía reveló un cierto grado de

aneuploidía (Sudbo y col., 2001b).

Nuestro modelo estaría poniendo de manifiesto esta situación y demostrando a la

vez el comportamiento de las lesiones no displásicas.

El dato mas relevante obtenido a partir del análisis de ploidía fue el relativo a las

áreas NUMF luego de 4 meses de cancerización, los cuales revelan un aumento

significativo en el contenido de ADN y del índice de proliferación celular respecto de la

mucosa control. Al analizar las etapas tempranas de la cancenzación, las zonas NUMF

presentaron un índice de proliferación aumentado pero no así el contenido de ADN,

reflejando probablemente la inestabilidad del tejido desafiado por el carcinógeno, pero que

aún no a sufn'do alteraciones suficientes para ser detectadas por el análisis de ploidía. A

los 4 meses, en cambio, este análisis se revela como un marcador de canoen’zaciónde

campo.

Al estudiar la inducción de fibrosis en el conectivo subyacxante al epitelio

transformado, encontramos que esos cuadros eran otra manifestación temprana de un

campo cancerizado.

El conectivo relativamente laxo subyacente a epitelios morfológicamente normales

(áreas NUMF) es tempranamente reemplazado por áreas desmoplásicas densas

aumentadas en volumen, que engrosan la pared de la bolsa. Esta reacción persiste

debajo de los epitelios NUMF hasta las últimas etapas, cuando este epitelio presenta

alteraciones de la ploidía, Pero la fibrosis de la bolsa tomada en su conjunto va

disminuyendo a lo largo del proceso dado que la aparición de hiperplasias, displasias y

tumores se acompaña de la generación de un conectivo laxo, de proliferación

predominantemente endotelial que aleja la fibrosis de la superficie epitelial y al mismo

tiempo provoca su reabsorción.

Esa alteración del tejido conectivo podría ser una manifestación temprana de la

alteración en la interacción epitelio-conjuntivo, inducida por el epitelio cancerizado. O por

el contran'o, podría ser simplemente un intento de respuesta defensiva ante la agresión

del carcinógeno filtrado a través del epitelio. En ese sentido, la fibrosis es una respuesta

Discusión 123

clásica del organismo ante diversas agresiones como se observa en patologías

inflamatorias crónicas como la gingivitis o en órganos viscerales como el apéndice, la

vesícula o la próstata entre otros (Choi y Claman, 1987). También se presentan

respuestas fibrosas asociadas a infecciones en patologías como la filan’asis o la

esquistosomiasis (Choi y Claman, 1987) en todas ellas la hiperplasia conectiva contribuye

a vehiculizar Ia respuesta inmune y detener la infección si bien puede tomarse en un

factor de disfunción. Ya hemos mencionado (sección l-c) ejemplos de cuadros fibrosos

asociados al cáncer pero en ellos la fibrosis se asocia al tumor, en general salvo en el

caso de la cirrosis hepática, la fibrosis no precede al tumor sino que aparece como

componente de su estroma. La otra excepción ya mencionada y estrechamente vinculada

a nuestra temática es la fibrosis de la submucosa bucal. En esa patología el cuadro

fibroso es muy extendido, los fibroblastos han sufrido alteraciones genotóxicas (Tsai y

col., 1999), y se presenta expresión aumentada TGF-a y EGFR. Estas alteraciones se

vinculan a la naturaleza precancerosa de la OSMF (Srinivasan y Jewell, 2001a; Srinivasan

y Jewell, 2001b). Sin embargo, aún hoy no esta claro cual es el rol de Ia fibrosis en esta

carcinogénesis, si bien es aceptado que el infiltrado inflamatorio yuxtaepitelial que se

observa tempranamente y luego cede paso a los cuadros de fibrosis, se debe a una

respuesta defensiva ante la agresión del canoerígeno (Srinivasan y JeweII, 2001b).

Una característica importante en el contexto tisural normal es la generación y

mantenimiento de la polaridad epitelial. Las células epiteliales reciben una gran variedad

de claves orientacionales que las ayudan a establecer sus superficies apical y basal y a

mantener su estado diferenciado. Se ha demostrado que la pérdida de polaridad conduce

al aumento de proliferación y a la turnorigénesis (Bissell y Radisky, 2001; Radisky y co|.,

2001). En nuestro modelo, el epitelio NUMF no posee un contexto normal, dado que el

tejido subyacente está fibrosado, cambiando así la estructura fisica del tejido conectivo y

por Io tanto su relación mecánica con el epitelio.

Esa sobreproducción de fibras colágenas por parte de los fibroblastos además de

ser una manifestación de Ia estimulación de los mismos, es una clave más de la alteración

en la relación epitelio-conectivo. Es por ello que se ha postulado a la conservación de un

contexto normal para el epitelio como mecanismo anticancerígeno innato (Bissell y

Radisky, 2001).

La superficie basal de una célula epitelial esta unida a la membrana basal que le da

soporte estructural y señales de polarización aI epitelio. La membrana basal es una

estructura dinámica. Los cambios en su composición llevan a cambios en la forma y

Discusión 124

comportamiento epitelial (Roskelley y col., 1995; Roskelley y Bissell, 1995) asi como en la

afinidad de unión celular debido a la alteración en la distribución receptores de membrana

(Schwartz y Baron, 1999). En la CBMHlos cuadros de fibrosis estrictamente subepitelial

desaparecen cuando la alteración epitelial es evidente morfológicamente y comienza a

alterarse la membrana basal como paso previo a la microinvasión.

Un aspecto de interés en nuestro trabajo ha sido el de poder relacionar el desarrollo

de la fibrosis con Ia expresión del b-FGF.

El b-FGF ha sido estudiado en diversos tipos tumorales por su potencial rol en la

angiogénesis y en la estimulación autócn'na en el crecimiento tumoral. Su rol se ha

documentado en tumores de cerebro (Morrison y col., 1990; Takahashi y coI., 1992;

Morrison y col., 1993) asi como en otros tipos de tumores sólidos (Luqmani y col., 1992;

Nanus y col., 1993; Yamanaka y col., 1993). Aún hoy no existen datos contundentes

sobre el rol del b-FGF en la iniciación y progresión tumoral de los CCECC (Janot y coI._

1995).

Nuestro análisis inmunohistoquímico reveló que el b-FGF es producido por las

células del estrato basal del epitelio de la mucosa normal de la bolsa del hamster. La

marcación es citoplasmática, en concordancia con Io reportado por Myoken (Myoken y

col., 1994). A las seis semanas de cancen'zación tanto en áreas NUMFcomo PREN esa

expresión ya es anómala, en cuanto a que tanto las células basales como las

suprabasales producen el factor, y cuanto más severa es la lesión epitelial, más células

producen el factor. En las áreas NUMFesa alteración llega a su máxima expresión a las 7

semanas de tratamiento, coincidentemente con la mayor producción de fibrosis. A su vez

las áreas pre-neoplásicas presentan un nivelmuy alto de expresión suprabasal de b-FGF

desde la semana 6 a la 9 para luego disminuir hasta casi el nivel de expresión de las

áreas NUMF.Los carcinomas, que en el modelo no producen fibrosis del estroma, en su

mayoria no expresan el b-FGF y si lo hacen es en zonas diferenciadas del tumor.

Estos datos coinciden en general con los reportados en carcinomas bucales

humanos. Varios trabajos han tratado de relacionar la expresión del factor con el grado de

diferenciación histológico de los carcinomas. Asi por ejemplo Partridge (Partn'dge y col.,

1996) ha reportado la expresión de b-FGF en las células atípicas de CCEB y la presencia

del ARN mensajero del b-FGF en esos mismos tumores. Ese mismo autor al describir la

localización de la marcación inmunohistoquímica remarca que la misma no fue

homogénea, que dentro de los tumores positivos existían zonas negativas y que del total

Discusión 125

de carcinomas analizados solamente el 40% realmente presentaba una expresión

definida. Finalmente concluye que no se puede relacionar la expresión del b-FGF en los

CCEB con parámetros clínico-patológicos incluyendo histología tumoral y velocidad de

crecimiento tumoral.

Sin embargo, Janot (Janot y col., 1995) observó expresión del FGF-2 en CCECC

bien diferenciados mientras que en los carcinomas no diferenciados reportó muy baja o

ninguna expresión del factor .

En cuanto al análisis de las isoformas del FGF-2 en biopsias humanas, se ha

reportado la presencia de las tres isoformasconocidas (18, 22 y 24 kd) en la mucosa

normal y solo la isoforma de 18 kd en los carcinomas (Janot y col., 1995). Esta regulación

en la expresión del FGF-2 a través de la isoforma de 18 kd se revela también en nuestro

modelo con una mayor tendencia a la desaparición de la isoforma de 18 kd en los

carcinomas, mientras que en las primeras etapas de la carcinogénesis se presenta

aumentada con respecto a los controles. Los reportes sobre las isoformas del factor en los

carcinomas bucales humanos son muy escasos y la informaciónrelevante es sobre lineas

celulares, en donde los datos son dispares.

Finalmente algunos autores concluyen que la expresión del b-FGF en los CCEB se

correlaciona con el crecimiento tumoral in vitro (Myoken y col., 1994). Mientras Janot

quien encuentra bajos niveles de expresión de b-FGF en los tumores no tiene evidencia

suficiente para adjudicar un rol concreto al b-FGF, pero tampoco puede negarle un rol

debido a que encuentra expresión de los receptores para FGF en los tumores (Janot y

col., 1995).

Para profundizar en Ia interpretación del rol biológico del b-FGF en el modelo

estudiamos la expresión de sus receptores 2 y 3. En los carcinomas el FGFR-3 se

expresó tanto en el estroma como el parénquima tumoral, mientras que el FGFR-2 Io hizo

en el parénquima de los carcinomas, en algunos de ellos a veces en todo el espesor de

los cordones epiteliales y en otros en la zona basal. En carcinomas bucales humanos se

ha reportado la expresión de los receptor 2 y 3 y se ha estudiado la expresión del FGFR-1

con resultados dispares. Se ha reportado expresión IHQ del FGFR-1 en el parénquima

tumoral (Dellacono y col., 1997), mientras que en otros trabajos no se detecta la expresión

ni del gen ni del mensajero del FGFR-1 en CCEB (Janot y coI., 1995; Partridge y col.,

1996). Los reportes coinciden en cuanto a la expresión del FGFR-2 y 3 para los

carcinomas bucales. Para el receptor 2 algunos autores analizan las distintas variantes

Discusión 126

que se expresan en los tumores, llegando a la conclusión que predomina la variante del

FGFR-2 que une KGF (Janot y col., 1995; Partn'dge y col., 1996), y el balance hacia la

expresión de esa isoforma explicaría la disminución en la marcación de b-FGF en los

carcinomas bucales. Pero esa hipótesis no coincide con los datos de otros autores que

analizaron la variante del receptor 2 especifica para b-FGF. Wakulich reporta expresión

del FGFR-2 en todos los estratos epiteliales de displasias bucales humanas así como en

los carcinomas, datos que coinciden con la expresión del FGF-2. También reporta

expresión del FGFR-3 en esos mismos casos observando una localizaciónde Ia marca en

los estratos epiteliales superiores y en los carcinomas la marca tiende a observarse en las

zonas diferenciadas de los tumores. Por Io tanto concluye que la co-Iocalización del FGF­

2 y sus receptores de alta afinidad en tejidos neoplásicos revelan un mecanismo autócrino

que influye en el proceso carcinogénico (Wakulich y col., 2002). Si bien nosotros no

hemos observado una co-localización importante para los FGFR-2 y 3 en los carcinomas

si encontramos aumento en la expresión de los 2 receptores estudiados en el tejido

conectivo durante la carcinogénesis (semana 6 a 10), datos que se correlacionan con la

alteración en la expresión del b-FGF en las etapas tempranas de inducción tumoral.

Nuestros resultados podrían reflejar una acción autócrina del b-FGF con los receptores 2

y 3 en las etapas pre-neoplásicas, mientras que en los carcinomas la presencia de los 2

receptores pero fundamentalmente la del R 3 tanto en estroma como parénquima tumoral

podrían indicar la interacción con algún otro péptido de la familia FGF.

A pesar de las observaciones realizadas en nuestro modelo y los datos reportados

en la literatura a partir de carcinomas humanos, no tenemos evidencia suficiente para

descartar directamente un rol angiogénico del b-FGF, tal como ha sido acabadamente

demostrado en diversos tipos tumorales. Es por ello que hemos analizado Ia expresión del

VEGF como factor angiogénico de mayor especificidad.

Hemos encontrado expresión del VEGF en el epitelio normal de la bolsa del

hámster. Esa expresión aumenta en intensidad con la carcinogénesis. Entre Ia semana 7

y 9 de tratamiento los epitelios que presentan cuadros de fibrosis subyacentes

presentaron una más intensa expresión del VEGFen las capas suprabasales. También el

tejido conectivo presentó un aumento en la cantidad de Ia marca localizado en endotelios

y fibroblastos. Los carcinomas expresan el VEGF en su parénquima y no hemos

encontrado diferencias en el patrón de expresión en relación al grado de diferenciación.

Discusión 127

En general podemos concluir que el VEGF se expresa con muy pocas van'antes en

la bolsa normal y durante todo el proceso de la carcinogénesis, con un aumento en

intensidad en las etapas tempranas que se mantiene hasta constituirse el parénquima

tumoral. No podemos atribuir al VEGF un rol preponderante en la angiogénesis en alguna

etapa en particular, sino que mas bien pareciera ejercer una función continua y

colaborativa con otros péptidos inductores de vasculanzación.

Existe evidencia de que el b-FGF y el VEGF pueden actuar en forma sinérgica en

procesos carcinogénicos. Se ha reportado en carcinomas de pulmón un rol sinérgico de

los dos factores en la angiogénesis y metástasis (Slodkowska y co|., 2000). También se

ha reportado inducción dela expresión del VEGF en respuesta al TGFB1en fibroblastos y

células epiteliales (Pertovaara y col., 1994). No hemos encontrado en la bibliografiadatos

concluyentes sobre actividad de factores inductores de angiogénesis en el modelo CBMH.

Lindgen y col. (Lingen y col., 1997) estudiaron inducción de angiogénesis en líneas

celulares provenientes de mucosa de hámster sometida a tratamiento con DMBA,con

distintos péptidos, entre ellos b-FGF, VEGF, PDGF, TGF-B1. Encontraron que el TGF-B1

es el factor angiogénico más potente para los cultivos celulares y definieron un cambio de

fenotipo no angiogénico a angiogénico a la quinta semana de tratamiento. Esta

interpretación podría corresponderse con nuestras observaciones morfológicas, con

algunas diferencias en los tiempos de canoerización seguramente debidos a diferencias

de respuestas que existen entre los modelos in vitro e in vivo. Tomados en conjunto

nuestros resultados parecen indicar que ni el b-FGF ni el VEGF tendrían un rol

preponderante en el proceso angiogénico general y especialmente en Ia vascularización

de los tumores. Según Lindgen ese rol Io cumpliría el TGF-B1 (Lingen y col., 1997). Si

bien el b-FGF contribuiría a la angiogénesis tendría en este modelo, como ya hemos

comentado, un rol preponderante en la producción de fibrosis, de gran magnitud en las

etapas tempranas. Tanto el factor como los cuadros desmoplásicos disminuyen desde las

etapas intermedias en adelante.

Hemos tratado preliminarrnente de analizar un probable mecanismo para esta

disminución buscando la posibilidad de existencia de actividad proteolítica. En los tiempos

intermedios del proceso, encontramos un aumento distinguible de actividad proteolítica

respecto de la mucosa normal y los carcinomas. La actividad proteolítica observada

corresponde claramente al patrón zimográfico de la MMP-2, y no tan claramente se

observa algo de actividad de la forma latente de la MMP-9. Esa actividad proteolítica

podría estar contribuyendo a la disminución de la relación fibrosa y a mantener las

Discusión 128

características del estroma Iaxo propio de los carcinomas de este modelo. Son datos

realmente preliminaresy habría que constatar la actividad de esas metaloproteasas.

En relación a ello, se reportado aumento de la expresión del b-FGF y el FGF-7 en

células NIH-3T3en las cuales provoca expresión alterada de las metaloproteasas de

matriz, MMP-2 y MMP-9 (Lo y Hurta, 2002). También se ha visto que la colagenasa 3

(MMP-13) es regulada por el b-FGF en los condrosarcomas (Uria y col., 1998). Y se ha

reportado Ia regulación de la producción de MMPs a través del FGF-2 y 9 en gliomas

humanos (Miyagi y coI., 1998).

Con respecto a las proteasas y su rol en la carcinogénesis la bibliografiaes extensa

(Coussens y Werb, 1996; Coussens y Werb, 2002). Así la sobre-expresión de

estromelisina-1 en glándula mamaria de ratón lleva a la formación de lesiones

preneoplásicas y tumores (Sympson y col., 1995). En animales que no expresan la

estromelisina -3 (ratones knock-out para esa MMP)se encontró aumentada la incidencia

de tumores luego de someterlos a carcinogénesis química (Masson y col., 1998).

Se ha reportado producción de MMP-2 y 9 por los mastocitos (Coussens y col.,

1999; Coussens y Werb, 2002) y se sabe también que en Ia bolsa del hamster

cancen'zada existe gran movilizaciónde mastocitos en la carcinogénesis temprana (Flynny col., 1991). Iamaroon y col. trabajando sobre carcinomas bucales humanos han

reportado movilización de mastocitos y han relacionado su actividad a la angiogénesis

(Iamaroon y coI., 2003). Ranien’ demuestra que no hay relación entre el infiltrado de

mastocitos y las evidencias de angiogénesis (Ranieri y col., 2002). Parecería que la

movilización de ese tipo celular esta indicando su participación en la regulación del

proceso carcinogénico de una manera aún no bien conocida.

Los mastocitos producen una gran cantidad de mediadores de la inflamación que

incluyendesde heparina, heparanasa, rnetaloy serin-proteasas hasta diversos factores de

crecimiento polipeptídicos que incluyen al b-FGF y el VEGF (Coussens y col., 1999).

También proveen mitógenos para los fibroblastos, células endoteliales y epiteliales, así

como actividad enzimática involucrada en el remodelado dela matriz extracelular, además

de su conocido rol en las alergias, el aumento de mastocitos se asocia a respuestas

fibrosas, en muchas enfermedades inflamatorias crónicas (Choi y co|., 1987; Choi y

Claman, 1987), tales como la fibrosis pulmonar, la aterosclerosis y los procesos

carcinogénicos (Choi y Claman, 1987).

Hemos mencionada Ia existencia de un infiltrado celular con predominancia de

mastocitos y eosinófilos durante las etapas tempranas de la carcinogénesis en la bolsa

Discusión 129

del hámster. Se ha demostrado que los eosinófilos producen TGF-d (Elovicy col., 1990),

pero, en el caso de los mastocitos, ninguna de sus múltiples citoquinas se ha podido

vincular directamente con el proceso de malignización en la cavidad bucal. En algunos

modelos se ha asociado a los mastocitos con un posible rol en la angiogénesis debido a

su infiltraciónen zonas de neo-vasculan'zación, conjuntamente a la expresión de VEGF

(Aoki y col., 2003).

Aún siendo preliminares en algunos aspecto, nuestros datos son los primeros en

abordar un conjunto de interacciones epitelio-conectivo en el modelo CBMH. Dada Ia

comprobada eficacia del modelo en la reproducción de los cuadros de cancerización de la

boca humana, parece de interés continuar estos estudios. Seria importante por ejemplo

constatar la actividad de Ia MMP-2,en cada uno de los tiempos experimentales, confirmar

in vivo, la existencia de la expresión de TGF-[31y correlacionarla morfobgicamente con

los distintos cuadros de neo-angiogénesis y caracterizar la infiltración de células

productoras de citoquinas relacionadas con el proceso. Sería también de interés evaluar

la cronodinamia y la magnitud de la angiogénesis, hecho cuyo estudio ¡n vivo requeriría la

elaboración de anticuerpos utilizables en la marcación de endotelios en el hámster, que

actualmente no se disponen.

CONCLUSIONES

- El modelo de cancerización química de la bolsa de la mejilla del hámster (CBMH)

reproduce eficazmente Ia secuencia de lesiones pre-malignas y malignas de la boca

humana, no solamente en cuanto a las alteraciones epiteliales, ya bien descriptas en la

literatura, sino también en cuanto a cambios en el conectivo, especialmente Ia inducción

de fibrosis y angiogénesis como cuadros característicos de la pre-malignidad.

Las lesiones avanzan en malignidad histológica a medida que se prolonga el tiempo

de cancerización, pero en todas las etapas del proceso, aun después de la aparición de

los carcinomas, las lesiones pre-malignas coexisten con áreas de epitelio de aspecto

histológico normal, configurando los cuadros propios de la “cancerización de campo" de Ia

mucosa bucal humana. Estas áreas (NUMF: “no unusual microscopic features")

constituyen un buen modelo para el estudio de las alteraciones tempranas de la relación

epitelio-conectivo y para la búsqueda de marcadores de campo cancerizado, de

aplicación diagnóstica.

Discusión 130

-La evaluación de la ploidía por análisis de imágenes, si se realizan determinados

ajustes metodológicos, además de su uso habitual en el diagnóstico de malignidad,

permite evaluar lesiones epiteliales en áreas pequeñas de cortes histológicos. Con esta

metodología se pudieron caracterizar numéricarnente las distintas lesiones epiteliales del

modelo. Especialmente, se pudieron detectar alteraciones de los valores de ploidíaen las

áreas NUMF, como evidencia de cancerización de campo antes de la aparición de

cambios morfológicos.

- La fibrosis se desarrolla muy tempranamente con localización subepitelial En

estrecha relación con el aumento de la gravedad de las lesiones, la fibrosis es luego

desplazada hacia la profundidad por la proliferación angioblástica, y posteriormente

reabsorbida. En las etapas finales, el estroma de los tumores es un tejido Iaxo, muy

vasculan'zado y la fibrosis persiste solamente debajo de los epitelios NUMFo con lesiones

pre-malignas leves.

- El b-FGF aumenta su expresión en el epitelio desde las etapas iniciales y luego

disminuye hasta casi desaparecer en los parénquimas tumorales. La isoformaque deja de

expresarse es Ia de 18 kd. Estas variaciones del b-FGF coinciden con la evolución de la

fibrosis subepitelial.

Los receptores FGFR 2 y 3 se expresan en el epitelio y en fibroblastos y endotelios.

Este patrón es constante desde el iniciode la carcinogénesis y algo más irregular en los

parénquimas tumorales.

A diferencia de lo demostrado en otros tipos de neoplasias experimentales y

humanas, en las cuales el FGF-2 tiene actividad principalmente angiogénica, en el modelo

CBMH este factor tendría un rol autócrino-parácn'no en la desregulación de las

interacciones epitelio-conectivo con preponderancia en el desarrollo dela fibrosis a través

de la isoforma de 18 kd, y en menor grado en Ia angiogénesis tumoral.

- El VEGF también aumenta su actividad en el epitelio al iniciarse el proceso

carcinogénico. Se expresa además en los endotelios vasculares y en áreas de fibrosis.

Este aumento es sostenido y de comportamiento homogéneo, sin que existan cambios

ostensibles de actividad en relación a las diferentes lesiones pre-malignas y tumorales. El

VEGF, lo mismo que el b-FGF estarían involucrados solo parcialmente en la angiogénesis

Discusión 131

de este modelo y actuarían en colaboración con otros péptidos inductores devasculan’zación.

- Se observó actividad proteolítica con un patrón correspondiente con el de la MMP­

2 y MMP-9. La etapa de mayor actividad parecería corresponder a tiempos

experimentales que se solapan con los de máxima expresión de la fibrosis y luego Ia

disminución paulatina de la actividad proteolítica parece disminuir con la disminución de

las áreas de fibrosis.

- Los datos arn'ba resumidos indican que durante el proceso de carcinogénesis de la

mucosa bucal, se producen importantes modificaciones en las interacciones normales del

epitelio y el conectivo subyacente. Profundizar su conocimiento contribuye a un mejor

entendimiento del proceso y podría tener implicancias en la búsqueda de instrumentos de

ayuda en el diagnóstico y la prevención. Así por ejemplo, si se lograra la transferencia a la

clínica de los datos encontrados en el presente trabajo, Ia detección precoz de un campo

cancen'zado sin modificaciones morfológicas,en situaciones de riesgo, podría basarse en

la conjunción de un epitelio con ploidía alterada, fibrosis subyacente y expresión

aumentada de b-FGF. El análisis de esta posibilidad cobra mayor interés si se considera

que estas detecciones pueden realizarse sobre el mismo material biópsico utilizado para

diagnostico histopatológico de rutina.,fiTesista: Lic. Ana R. Raimondi

QDirector: Dra. . E. ltoiz

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