TÉCNICAS DE TINCIÓN EN HISTOLOGÍATinción de Gram; Permite diferenciar entre dos grupos de bacterias: 

- Bacterias Gram positivas- Bacterias Gram negativas

Por ello se desarrollaron unas técnicas conocidas como tinciones

Para poner de manifiesto las diferentes estructuras que integran una sección histológica, es necesario crear artificialmente un contraste diferencial entre los diversos elementos del tejido.

¿Que es una tinción?Una tinción es un procedimiento para visualizar un

tejido que puede implicar el uso de uno o varios colorantes de modo simultáneo o sucesivo.

COLORANTES

Un compuesto químico es coloreado porque sus moléculas absorben cuantos de radiación electromagnética en la parte visible del espectro.

Los dobles enlaces se alternan con sencillos provocando que los electrones del enlace se muevan de un átomo al otro cambiando las posiciones de los enlaces.

Generalmente, los colorantes presentan anillos aromáticos en su estructura.

En las moléculas orgánicas

Características de los colorantesUn colorante debe ser capaz de realizar dos cosas:1.- Teñir o colorear2.- Unirse a las estructuras celulares

Naturaleza química de los colorantes

Los colorantes suelen ser moléculas orgánicas que presentan anillos aromáticos y que absorben la luz visible por efecto de los electrones asociados

a combinaciones de átomos llamados Cromóforos.

Capacidad de teñir

• Para que el colorante pueda teñir un tejido ha de ser capaz de unirse a las estructuras celulares. El elemento químico que le confiere esta capacidad se denomina grupo Auxocromo

Capacidad de unirse

Principales grupos

ClasificaciónDe los colorantes por grupo

SEGÚN EL GRUPO CROMOFORO

SEGÚN EL GRUPO AUXOCROMO

Básicos o catiónicos

Azul de metileno

Nitrados Acido pícrico

Ácidos o aniónicos

Eosina Colorantes azoicos Orange G, Sudan negro, etc

Sin carga (neutros)

IsiotiocianatosÁcido + Básico

Derivados del xanteno Eosina Y, Fluoresceína sódica

Derivados de la acridina Acriflavina

Derivados de las iminas quinónicas Orceína

Derivados de diarilmetanos y triarilmetanos

Amino-triarilmetanos

Derivados de la antraquinona Rojo nuclear rápido

Derivados de las ftalocianinas Azul alcián

Flavonoides Hematoxilina

ClasificaciónDe los colorantes por incorporación

COLORANTES VITALES COLORANTES DE EXCLUSIÓN

Aquellos que son captados únicamente por células vivas

Solo son incorporados por células muertas presentes en cultivo

Son a los que se les permite la entrada a través de la membrana.

Se basa en que la membrana de las células muertas no es capaz de funcionar como barrera de entrada

para ese colorante.

Ej. Rojo neutro y verde Janus Ej. Azul tripán

La tinciones mas habituales son:Tetraciclinas, Alizarina, Colorantes de tipo

Procion.-

Permiten estudiar el crecimiento del tejido óseo

Cuantificar la proporción de células vivas (no teñidas) o detectar mortalidad en cultivos celulares.

Naturales Artificiales

Hematoxilina Azul de metileno

Carmín Safranina

Azafrán Azul de anilina

Orceína Naranja G

ClasificaciónSe pueden clasificar, en función de su origen, en naturales y artificiales. Por ejemplo:

¿Como se unen los colorantes al tejido?¿Cuáles son los fenómenos fisicoquímicos implicados?

MECANISMOS DE UNIÓN Tinción-Sustrato

Relaciones electrostáticas Acido-Base

Enlaces coordinados, mordientes y quelantes

Aumentan la reactividad del tejido estableciendo una interacción

tejido colorante.

Enlaces covalentes Isiotiocianatos - Sustrato

Puentes de hidrógeno Colorante-sustrato en soluciones no acuosas

Interacciones hidrófobas en la disolución diferencial: coloraciones

de lípidosFuerzas de Van der Waals

Impregnaciones

El colorante forma agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la

malla molecular creada en el proceso de fijación.

Esto ocurre porque los iones del colorante unidos al sustrato cambian la longitud de onda de absorción de luz y, por lo tanto, el color observado del objeto teñido es distinto al del colorante libre.

Metacromasia Si es azul ¿Por qué tiñe de rojo?

Glosario de términos relacionados con las tinciones

Término Definición

Mordiente Reactivo que aumenta la reactividad del tejido estableciendo una interacción tejido colorante

Alumbre Modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y confiriéndole un carácter muy básico

Coloración indirecta en un tiempo Aquella en la que el tratamiento del tejido con el colorante y el mordiente se realiza simultáneamente en una misma solución

Coloración indirecta en dos tiempos Cuando colorante y mordiente actúan separadamente

Glosario de términos relacionados con las tinciones

Término Definición

Tinción progresiva Tinciones en las que los colorantes y mordientes se aplican siguiendo una secuencia definida y bajo estricto control de los tiempos para lograr una intensidad determinada.

Tinción regresiva Primero se sobre colorea y posteriormente se elimina el exceso de colorante por diferenciación

Diferenciacion Consiste en eliminar el exceso de colorante mediante agentes diferenciadores (disoluciones alcoholicas de acidos o alcalis, etanol, acetona, etc.)

TINCIONES MÁS UTILIZADAS

• Tinción general, contiene un colorante básico para las estructuras acidas como (ADN Y ARN) y otro acido para el citoplasma y estructuras extracelulares.

• Hematoxilina: es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum , conocida también con el nombre de palo de Campeche. Requiere ser oxidada para convertirse en una molécula coloreada. AZUL Eosina: Derivado halogenado del xanteno. Molécula autofluorescente por sus átomos halógenos y es soluble en agua y en alcoholes lo que le confiere mucha versatilidad para la tinción histológica. Presenta un cierto carácter ácido. ROSA

Hematoxilina-eosina

• Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas. Se observan colores distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido muscular de verde pardo, eritrocitos de rojizo, núcleos azul negro y citoplasma y fibras musculares rosa. Ejemplos de tinciones tricrómicas:

• El tricrómico de Masson• El tricrómico de Van Gieson

Tricrómicos

Es una tinción general que se emplea mucho en hematología, permite distinguir, por su coloración, los gránulos de los diferentes leucocitos polimorfonucleares. Contiene una mezcla de colorantes catiónicos (azul de metileno) y aniónicos (eosina). Extensión de sangre periférica (Tinción May Grünwald- Giemsa): eritrocitos de tamaño y contenido de hemoglobina inferior al normal característicos de la Anemia de Cooley

Giemsa

Coloración histológica empleada principalmente para extensiones citológicas, sirve para la detección precoz del carcinoma de cérvix. Contiene una mezcla de colorantes que no produce sobre coloración. Normalmente tiene 4 colorantes: uno nuclear (hematoxilina), eosina Y, que tiñe de rosa el citoplasma, verde brillante que tiñe el moco y Orange G que tiñe la queratina.

Papanicolau

TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS

Algunas tinciones nos sirven para teñir ciertos tejidos específicos, a continuación veremos los ejemplos mas relevantes.

TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS

Tejido nervioso Impregnaciones argénticas

Tejido conjuntivo Técnica de reticulina, de Wigert de resorcina-fucsina, etc.

Musculo estriado Tinción de hematoxilina fosfotúngstica ácida PTAH

Hueso Exigen descalcificación o desgaste. Coloración con tionina o tinción negativa

Higado H-E, Tinción tricrómico, reticulina, PAS y PAS-distasa, azul de Pearls.

TINCIONES APLICABLES A TEJIDOS CONCRETOS

Riñón H-E, PAS, tricrómico y técnica de metenamina de plata.

Piel PAS, Técnica de argentafinidad de Masson Fontana, Tricrómico de Gallego

Microorganismos en diversos órganosHongos – PAS o meteanina de plata de

GrocottBacterias: Gram, Ziehl Neelsen, Giemsa

TINCIONES SUBCELULARESEn microscopia óptica también podemos resaltar e identificar determinados orgánulos mediante tinciones mas o menos especificas y diferenciales. A continuación se citan ejemplos de métodos

de tinción mas utilizados:

TINCIONES SUBCELULARES

NúcleoEN CORTES. Hematoxilina férrica, safranina-light green o verde metilo.EXTENSIONES CROMOSOMICAS. Carmín acético u Orceína acética.

Nucléolo Grumos de Nissil: azul toluidina, violeta de cresilo y verde metilo-pronina

Mitocondria EN CELULAS VIVAS. Verde JanusEN CORTES. Fucsina de Altmann

Aparato de Golgi Impregnaciones argénticas

Gránulos de secreción y cuerpos de inclusión

Método de Mann, con eosina amarillenta y azul de metileno, posterior diferenciación en Orange G.

Vacuolas de los fagocitos

Se inyecta al animal una suspensión de partículas de carbón antes de obtener el tejido. Las células que fagocitan el carbón las acumulan en sus vacuolas de fagocitosis.

IMPREGNACIONES ARGÉNTICASSe le denomina así a toda coloración histológica en la que se emplean sales

metálicas para generar precipitados metálicos sobre estructuras que se pretenden destacar.

1. IMPREGANCION PRIMARIA

Los tejidos don expuestos a una solución ligeramente alcalina en la que hay una concentración no muy alta de AgNO3 que proporciona iones de plata en exceso

2. SEGUNDA FASE

Los cortes son tratados con una solución (hidroquinona y sulfito) que captura parte de los iones de plata que se han unido débilmente al tejido

• Implica 2 pasos

TINCIÓN NEGATIVANo todos los colorantes se unen a las estructuras tisulares. Algunas

tinciones se basan en la exclusión de la coloración. El contraste negativo consiste en teñir todo menos la estructura que queremos visualizar.

¿Que es un cuanto?¿Qué es la radiación electromagnética?Molécula orgánicaEspectro visibleEnlaces conjugadosResonanciaCromóforosMordienteFuerzas de Van der WaalsMetacromasiaAlumbreTinción Argéntica

Preguntas información extra

¿Que es un cuanto?

Un quantum o cuanto es la menor cantidad de energía que puede transmitirse en cualquier longitud de onda. Considerado el creador de la teoría cuántica, el físico alemán Max Planck enunció que la radiación electromagnética se emite en unidades discretas de energía denominadas quantum o quantos.

¿Qué es la radiación electromagnética?

La radiación electromagnética es un tipo de campo electromagnético variable, es decir, una combinación de campos eléctricos y magnéticos oscilantes, que se propagan a través del espacio transportando energía de un lugar a otro

Molécula orgánica

Compuesto orgánico o molécula orgánica es una sustancia química que contiene carbono, formando enlaces carbono-carbono y carbono-hidrógeno

Espectro visible

Se llama espectro visible a la región del espectro electromagnético que el ojo humano es capaz de percibir. A la radiación electromagnética en este rango de longitudes de onda se le llama luz visible o simplemente luz. No hay límites exactos en el espectro visible: un típico ojo humano responderá a longitudes de onda de 400 a 700 nm, aunque algunas personas pueden ser capaces de percibir longitudes de onda desde 380 hasta 780 nm.

Enlaces conjugados

Un sistema conjugado se da cuando en un compuesto químico con enlaces simples y dobles alternados, los electrones que forman los enlaces dobles se deslocalizan, es decir, se sitúan de manera uniforme alrededor del compuesto. Estos electrones deslocalizados no forman en realidad enlaces dobles entre dos átomos en particular, sino que pertenecen a todo el grupo de átomos, y le dan más estabilidad y fuerza al enlace simple, sin llegar a ser un doble enlace.

Resonancia

La Resonancia (denominado también Mesomería) en química es una herramienta empleada (predominantemente en química orgánica) para representar ciertos tipos de estructuras moleculares. La resonancia consiste en la combinación lineal de estructuras de una molécula (estructuras resonantes) que no coinciden con la estructura real, pero que mediante su combinación, nos acerca más a su estructura real.

Cromóforos

Un cromóforo es la parte o conjunto de átomos de una molécula responsable de su color. También se puede definir como una sustancia que tiene muchos electrones capaces de absorber energía o luz visible, y excitarse para así emitir diversos colores, dependiendo de las longitudes de onda de la energía emitida por el cambio de nivel energético de los electrones, de estado excitado a estado fundamental o basal.

Mordiente

Aquella sustancia que sirve para unir un colorante a un sustrato. // Reactivo que aumenta la reactividad del tejido estableciendo una interacción tejido-colorante// Reactivos mordientes. Son los reactivos o sustancias que preparan al tejido para la coloración

Fuerzas de Van der WaalsEn fisicoquímica, las fuerzas de Van der Waals, o interacciones de Van der Waals, es la fuerza atractiva o repulsiva entre moléculas (o entre partes de una misma molécula) distintas a aquellas debidas al enlace covalente o a la interacción electrostática de iones con otros o con moléculas neutras.

MetacromasiaOcurre porque en la reacción del colorante con determinadas estructuras las moléculas de colorante se aproximan mucho entre ellas, de modo que se produce un cambio en su rango de absorción lumínica lo que hace que eras estructuras se vean de diferente color.

AlumbreSe trata de un tipo de reactivo utilizado en los procesos de tinción. Esta constituido por una sal doble de sulfato de un metal trivalente y otro monovalente. Generalmente, los metales son aluminio y potasio o amonio (NH4). El alumbre modifica el colorante añadiéndole grupos auxocromos y confiriéndole un carácter muy básico.

Tinción Argéntica

• La tinción argéntica es el uso de plata (en latín, Argentum) para modificar selectivamente el color o la apariencia de un objeto. Es una técnica frecuente de tinción en histología donde se utiliza para revelar detalles extremadamente finos.

Tinción NegativaTinción negativa es una técnica de microscopía que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica) o a los electrones (microscopía electrónica). En el primer caso, se emplea nigrosina o tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo oscuro.1 En caso de microscopía electrónica de transmisión, se emplean sustancias de alto número atómico que, por tanto, resultan opacas a los electrones transmitidos. Típicamente, estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al electrónico, esta técnica permite visualizar virus, flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamaño.