Deteccin de Fitoqumicos, contenido de Vitamina C y cido flico en Chironja (Citrus sinensis x Citrus paradisi) injertada en diferentes patrones de ctricaPor Josephine Soto Vega Tesis sometida en cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de MAESTRO EN CIENCIA En Ciencia y Tecnologa de Alimentos Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Mayagez Facultad de Ciencias Agrcolas 2005Aprobado por:

_________________________ Flix M. Romn Prez, M.S. Miembro, Comit Graduado

_____________________ Fecha

_________________________ Edna Negrn de Bravo, Ph.D. Miembro, Comit Graduado

_____________________ Fecha

_________________________ Mara del C. Rodrguez, Ph.D. Presidente, Comit Graduado

_____________________ Fecha

_________________________ Wanda Almodvar, M.S. Representante de Estudios Graduados

_____________________ Fecha

_________________________ Edna Negrn de Bravo, Ph.D. Director de Departamento

_____________________ Fecha

ABSTRACT

The purpose of this research was to determine the contents of vitamin C, folic acid and the phytochemicals flavonoids in the chironja fruit grafted on four different rootstocks. A comparative analysis was conducted within the different rootstocks to determine if significant differences exist among all and between oranges (Citrus sinensis) and grapefruits (Citrus paradisi). Folates and flavonoids were determined with an HPLC method and vitamin C was detected by the Tillmans Method. Flavonoids determination revealed that naringenin, present in grapefruits, did not appear in chironja. Collected data revealed significant differences within the

rootstocks evaluated for vitamin C contents. The estimated average for vitamin C in chironjas revealed 15 % below oranges and 13 % above grapefruits. Different limitations could not make possible quantification for folates in chironja. The

findings of this study revealed part of the nutritional value of chironja which could be an important factor for marketing.

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RESUMEN

El propsito de esta investigacin fue determinar si existen diferencias significativas en contenido de Vitamina C y cido flico de la chironja injertada en cuatro patrones de ctricas y la comparacin con los existentes en la china y la toronja; as como tambin para los flavonoides presentes. Para la deteccin de flavonoides y cido flico se utiliz la tcnica de cromatografa lquida de alta ejecucin y en la determinacin de vitamina C el mtodo de Tillmans. Los resultados reflejan que existe diferencia significativa para el contenido de vitamina C entre tres de los patrones estudiados. Adems que existe un 13% ms de vitamina C en chironja versus la toronja, y un 15% menos que el de la china. En flavonoides se encontr que el Naringenin, nico encontrado en la toronja, no fue detectado en la chironja. La cuantificacin de folato no fue posible, esto por diferentes limitaciones. Los anlisis realizados a esta fruta permiten parte del contenido nutricional importante para su mercadeo.

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A mis padres, mis hermanas, mis princesas Mara Fernanda y Ma y muy en especial a ti Rafael Mendoza; mi esposo, por tu apoyo y ayuda para la realizacin de este trabajo.

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AGRADECIMIENTOSA la doctora Mara Rodrguez por aceptar este proyecto, dedicarme de su tiempo y permitirme de sus conocimientos. Al Agrnomo Flix M. Romn, de la Estacin Experimental Agrcola de Isabela, por decir siempre presente para brindar sus conocimientos y las muestras necesarias. A la doctora Edna Negrn, por su apoyo y motivacin en momentos difciles, por su inolvidable frase Welcome to graduate school. Al doctor Jos Torres, de Ponce School of Medicine; por su colaboracin con la compra de reactivos para los anlisis realizados. Al doctor Jos Dumas, del Laboratorio Central Analtico de la Estacin Experimental Agrcola de la Universidad de Puerto Rico, por permitirme un espacio en su laboratorio y el uso del HPLC. A la seora Sheila M. Soler, tcnica del Laboratorio Central Analtico de la E.E.A. de la Universidad de Puerto Rico; por brindarme de su tiempo y conocimientos para trabajar con el HPLC. Al Centro de Investigacin Cientfica de la Pontfice Universidad Catlica de Puerto Rico, donde se realiz la mayor parte de este trabajo. Doctora Lissette Santos y muy en especial a la seorita Daisy Morales, tcnica del laboratorio de bioqumica; por hacer de este laboratorio y su calor humano un ambiente agradable de trabajo. Por permitirme ser parte de su laboratorio y por su valiosa ayuda para la realizacin de este trabajo.

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A todas mis compaeras de estudio, muy en especial a Yaritza, Maridia y Diana, porque juntas fue ms llevadero volver a la Universidad. A la seora Mara L. Vega, mi madre; por sus oraciones y por cuidar de mis amores en lo que llegaba de Mayagez. A mis amores, Mara Fernanda y Mara Alejandra; por entender que Mam tiene que estudiar. A Rafael O. Mendoza, por tu amor incondicional y tu apoyo, por tus empujoncitos para que no me rindiera. Te Amo. A ti mi Padre Celestial, porque cuando ya no poda ms te entregu mi trabajo y por ti; termino.

MIL GRACIAS

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TABLA DE CONTENIDOABSTRACT.................................................................................................................. ii RESUMEN .................................................................................................................. iii AGRADECIMIENTOS ................................................................................................ v INTRODUCCIN ........................................................................................................ 1 REVISIN DE LITERATURA ................................................................................... 5 Ctricos...................................................................................................................... 5 Injertos en ctricos..................................................................................................... 5 Historia de la chironja............................................................................................... 6 Fitoqumicos ............................................................................................................. 9 Qu son?.............................................................................................................. 9 Familias de los fitoqumicos ................................................................................. 9 Anlisis para la deteccin de fitoqumicos ......................................................... 10 Caractersticas funcionales de los fitoqumicos.................................................. 11 Flavonoides en ctricos ....................................................................................... 14 Flavonoides e implicaciones con la salud........................................................... 15 Contraindicaciones de los flavonoides................................................................ 17 Recomendaciones (DRIs) para fitoqumicos..................................................... 19 Vitamina C .............................................................................................................. 19 Definicin ........................................................................................................... 19 Comportamiento qumico de la molcula ........................................................... 20 Anlisis para la deteccin de cido ascrbico..................................................... 20 Caractersticas funcionales de la vitamina C ...................................................... 22 Vitamina C como precursor de salud.................................................................. 23 Vitamina C en los alimentos ............................................................................... 24 Recomendaciones (DRIs) de vitamina C........................................................... 25 cido flico ............................................................................................................ 27 Definicin ........................................................................................................... 27 Comportamiento qumico de los compuestos de folato...................................... 28

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Anlisis para la deteccin de folato .................................................................... 30 Caractersticas funcionales del cido flico........................................................ 34 cido flico como precursor de salud ................................................................ 35 cido flico en los alimentos ............................................................................. 37 Recomendaciones (DRIs) de cido flico ......................................................... 37 MATERIALES Y MTODOS ................................................................................... 39 Muestreo de la chironja........................................................................................... 39 Seleccin de la muestra....................................................................................... 39 Preparacin de la muestra ................................................................................... 39 Anlisis de los componentes nutricionales ............................................................. 40 Deteccin de Flavonoides ................................................................................... 40 Deteccin de Vitamina C .................................................................................... 42 Deteccin de Folatos........................................................................................... 44 RESULTADOS........................................................................................................... 49 DISCUSIN ............................................................................................................... 61 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 66 RECOMENDACIONES............................................................................................. 68 BIBLIOGRAFA ........................................................................................................ 69 APNDICE................................................................................................................. 74

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LISTA DE TABLASTabla 1: Funciones de algunos Fitoqumicos en los alimentos [14]........................... 12 Tabla 2: Flavonoides en ctricos..15 Tabla 3: Contenido de Vitamina C en alimentos.25 Tabla 4: Recomendaciones (DRI's) para Vitamina C..27 Tabla 5: Contenido de cido flico en alimentos...37 Tabla 6: Recomendaciones (DRI's) para cido flico38 Tabla 7: Flavonoides detectados en los diferentes patrones de Chironja para cada uno de los bloques de cosecha..50 Tabla 8: Contenido de Vitamina C (mg) para cada una de las muestras de Chironja evaluadas de acuerdo al patrn y al bloque de cosecha.53 Tabla 9: Porcentaje de recuperacin para muestras de Chironja con 5-metiltetrahydrofolato aadido a diferentes concentraciones..57

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LISTA DE FIGURASFigura 1: Estructura comn de los Flavonoides [17]. ................................................. 13 Fiigura 2: Molcula de cido ascrbico oxidada y reducida..20 Figura 3: Reaccin de oxidacin del cido ascrbico21 Figura 4: Estructura del cido flico..28 Figura 5: Estructura de los compuestos de Folato...29 Figura 6: Etapas para el anlisis de Folato en alimentos.33 Figura 7: Cromatograma para la solucin de estndares de Flavonoides51 Figura 8: Cromatograma obtenido para muestra de Chironja..52 Figura 9: Contenido promedio de Vitamina C en Chironja por Patrn...54 Figura 10: Contenido promedio de Vitamina C en Chironja por Bloque55 Figura 11: Contenido promedio de Vitamina C en Chironja en comparacin con el contenido en China y en Toronja..56 Figura 12: Curva de calibracin para el estndar 5-metiltetrahydrofolato..58 Figura 13: Cromatograma para el estndar 5-metiltetrahydrofolato (5-MTHF)...59 Figura 14: Cromatograma para muestra de Chironja con 5-MTHF aadido..60

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LISTA DE APNDICEFigura 1 2 3 4 5 6 Pgina

Foto de la fruta de Citrus sinensis x Citrus paradisi (Chironja)..75 Foto del rbol de Chironja, (C. sinensis x C. paradisi)76 Foto del rbol de Chironja, (C. sinensis x C. paradisi)77 Foto del Equipo de Cromatogafia lquida de alta ejecucin (HPLC)..78 Foto de las columnas de filtracin79 Cromatograma para muestra de leche con estndar de flavonoides aadido80

Tabla 1 2 3 4

Pgina

Propiedades de estndares de flavonoides evaluados81 Estadsticos para el contenido de Vitamina C en Chironja por patrn..82 Estadsticos para la evaluacin de Vitamina C en patrones por bloque82 Estadsticos mediante la prueba de Bonferroni para Vitamina C..83

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INTRODUCCINPor dcadas la recomendacin por aumentar el consumo de frutas y vegetales en el patrn de alimentacin del ser humano ha ido en incremento continuamente. Anteriormente se recomendaba un consumo variado de los grupos de frutas y vegetales por da para lograr una ingesta adecuada en el rengln de vitaminas y minerales. Esto debido a la amplia gamma de estos nutrientes que posee la mayora de los alimentos pertenecientes a estos dos grupos. En la actualidad adems de promover la variedad diaria para cada uno de estos grupos tambin se ha aumentado las porciones recomendadas por da para cada persona [1]. Este aumento correlaciona con estudios realizados que demuestran que a mayor consumo de estos alimentos, mayor la prevencin contra diferentes enfermedades o condiciones de salud. Entre estas condiciones se han podido mencionar, el cncer, problemas cardiacos, inmunolgicos, entre otros [2]. La mayora de las especies de frutas especficamente aquellas pertenecientes al gnero Citrus, o mejor conocidas como ctricos han sido vinculados a un sinnmero de beneficios para la salud del ser humano. Su amplia composicin nutricional y contenido vitamnico los coloca entre uno de los ms recomendados para consumo diario en el grupo de las frutas. Entre estas vitaminas, una de las de mayor contenido en este gnero lo es la vitamina C, sta es relacionada a la absorcin del hierro y folato en el sistema sanguneo. Tambin ha sido asociada a la disminucin de riesgo de cncer, esto por su funcin como antioxidante. Adems se le reconoce por su importancia en la formacin del colgeno entre otras cosas. 1

Otra importante vitamina que se puede encontrar a travs de los ctricos lo es el cido flico o segn su nombre genrico; folato. Este es asociado a la prevencin de diferentes condiciones como enfermedades del tubo neural en fetos, cncer de seno y colorectal, enfermedad de Alzheimer, ataques al corazn, entre otros. Tambin los ctricos forman parte del tan llamado grupo de los alimentos que batallan contra enfermedades (Food that fight diseases), esto por contar con la presencia de fitoqumicos (sustancias qumicas no nutritivas, biolgicamente activas, presentes en alimentos provenientes nicamente de plantas); actualmente conocidas como la vitamina F. Estos componentes han sido altamente reconocidos como promotores de salud por su prevencin en el desarrollo o formacin de diferentes tipos de cncer, adems de otras enfermedades. Mediante este estudio se evalu una fruta perteneciente al sub-gnero Eucitrus del gnero Citrus. Esta es conocida por su nombre genrico como Chironja (Apndice Figura 1). Esta fruta es considerada un hbrido creado por la unin del Citrus sinensis (china) y el Citrus paradisi (toronja), y de aqu que surge su nombre. En Puerto Rico fue descubierta para el ao 1956, y por algunas de sus caractersticas es que se consider que haya surgido de esta unin [3]. Se seleccion esta fruta para reconocer si el que haya sido considerada como un hbrido de la china y la toronja le permiti reunir las mejores propiedades nutricionales de cada una de estas frutas, logrando as un mejor valor nutricional en el grupo de los ctricos. Los anlisis realizados a travs de este estudio para cada uno de los diferentes patrones injertados con chironja, (mandarinas Sun Chu Sha y Cleopatra; Naronja y HRS812 Sunkie-Benecke trifoliate orange) tienen como propsito el permitir conocer

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parte del valor nutricional de esta fruta. Se seleccion especficamente la determinacin de vitamina C, cido flico y algunos fitoqumicos en la fruta por las diversas caractersticas o propiedades que posee cada uno de ellos en prevencin de muchas de las condiciones o enfermedades de alto ndice de mortalidad. Al

determinar el contenido de vitamina C y folato presente en sta, se puede comparar el contenido entre cada uno de los patrones mencionados, adems de compararlos con los contenidos establecidos de acuerdo a la literatura tanto para la china como para la toronja. Tambin se logra reconocer algunos de los fitoqumicos que posee,

especficamente aquellos pertenecientes a la familia de los flavonoides, para as determinar si aquellos que son nicos de cada especie se presentan en una misma fruta, la chironja. Gran cantidad de estudios han sido realizados en diferentes ctricos de regiones extranjeras, mediante los cuales se ha podido conocer desde el contenido calrico de la fruta, hasta la presencia de los diferentes nutrientes disponibles, incluyendo cada uno de los componentes que se analizan mediante este estudio. As tambin han sido evaluados muchos otros alimentos pertenecientes a los dems grupos. Durante la revisin de literatura y bsqueda de datos sobre la chironja y otros ctricos de la produccin agrcola en Puerto Rico, se pudo determinar que no existe ninguna coleccin que especifique resultados de contenidos de nutrientes en estos productos. Por esta razn uno de los objetivos especficos de este estudio es el comenzar el anlisis nutricional de productos agrcolas producidos en Puerto Rico, con el propsito de permitir la recoleccin de datos y crear una base de datos para

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referencia. Esta base de datos podra permitir la promocin y consumo de productos locales siendo utilizada como herramienta para la educacin al pblico. El conocer la composicin de nuestros productos y la importancia de stos, puede promover el mayor uso y consumo de ellos, permitiendo as, un mayor desarrollo y crecimiento de la industria agrcola de nuestro pas.

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REVISIN DE LITERATURA

CtricosSe cree las especies pertenecientes al gnero Citrus provienen de las regiones tropicales y subtropicales de Asia y del Archipilago Malayo, y de ah se han propagado a diferentes partes del mundo. El gnero Citrus se divide en dos subgneros muy diferentes: Eucitrus y Papeda. Los criterios de clasificacin son morfolgicos, tales como caracteres de la hoja, de la flor y de la fruta. El subgnero Eucitrus incluye toda especie de Citrus cuya fruta contiene un jugo agradable, que va, desde cido, sub-cido o dulce y en el cual hay poca o ninguna gota de aceite. En el subgnero Papeda, se incluyen las frutas no comestibles, por contener densas aglomeraciones de un aceite acre que imparte al jugo un sabor amargo y spero [3].

Injertos en ctricosPor cientos de aos los rboles de ctricos eran propagados mediante el uso de semillas. Estos rboles provenientes de semillas, usualmente presentan un periodo juvenil prolongado, el cual puede convertirse indeseable por ser un proceso de crecimiento excesivo sin ninguna produccin. Tambin estos rboles provenientes de semillas presentan susceptibilidad a diferentes enfermedades y problemas relacionados al suelo, en particular el hongo Phytopthora parastica que causa la enfermedad podredumbre del tallo y la raz root or foot rot. Debido al

esparcimiento de este hongo surge la necesidad de adoptar el desarrollo de rboles

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injertados como fuente de combatir la enfermedad, adems de proveer tambin aceleracin al proceso de produccin. De aqu que surge el que la mayora de los ctricos a nivel mundial consisten actualmente de dos partes que combinan atributos favorables del injerto y del patrn. La seleccin del patrn es una consideracin principal y de gran importancia en cada crecimiento de ctricos. Esta seleccin es fundamental para el xito de la cosecha; ya que ste es la raz del rbol, quien adems de ser soporte es responsable de la absorcin de agua y de nutrientes, tambin es encargado de adaptar el injerto a condiciones particulares del suelo y de proveer tolerancia a enfermedades. No existe un patrn perfecto, para cada situacin. La seleccin de ste debe estar basado en factores como: produccin de la regin donde se encuentra, clima local y condiciones de suelo; as como el uso que se le dar a la cosecha (Ej. Fresco o procesado) [4].

Historia de la chironjaLa variedad de ctrico, chironja, objeto del presente estudio, corresponde al subgnero Eucitrus del gnero Citrus. Surge la chironja en Utuado, Puerto Rico y es descubierta para el mes de febrero de 1956, cuando se denota, entre un cultivo de chinas (naranjas) de Puerto Rico, un rbol cuya fruta y dems caracteres diferan de los otros ctricos conocidos (Apndice Fig. 3 y 4). No se ha podido precisar con certeza como surgi este tipo de ctrico, pero a juzgar por las caractersticas generales que presenta el rbol, su follaje y su fruta, puede implicarse la combinacin de propiedades de la especie Citrus sinensis, la china y de la Citrus paradisi, la toronja o

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pomelo. De ah que surge el nombre con que ha sido bautizada, chironja [3]. Aunque an no se ha podido aseverar que stos sean los padres de la chironja, ya que sta posee caractersticas propias que le distinguen de los dems ctricos. Por tanto, ha sido considerada como una nueva variedad de ctrico. Durante la revisin de literatura para conocer datos sobre el objetivo del estudio, la chironja, se pudo encontrar que es muy poco lo escrito sobre este fruto. Un estudio completo fue realizado para el mes de junio de 1976 por el horticultor Carlos G. Moscoso, entonces Director Auxiliar de la Estacin Experimental Agrcola, Recinto Universitario de Mayagez de la Universidad de Puerto Rico (UPR) [3]. En este estudio se detallan los hallazgos de la chironja y sus caracteres generales adems de un estudio botnico, qumico, citognico y biomtrico. Tambin se presentan las posibilidades comerciales e industriales para aqul entonces en trminos de venta de fruta fresca y conservas. Mediante el estudio citognico de la investigacin realizado por el Sr. Moscoso, la chironja es caracterizada como el posible resultado de una hibridacin. Segn el anlisis estadstico se demuestra que la chironja es una fruta con caractersticas propias que la distinguen de las dems frutas ctricas y que, por consiguiente, debe considerarse como un nuevo tipo de ctrico. Aunque mediante el anlisis de la comparacin de caracteres de la chironja con los de la naranja (china) y toronja (pomelo), ste se asemeja en jugos a la china y en hojas a la toronja a pesar de poseer sus propias caractersticas. Respecto al mercadeo de la chironja, el anlisis realizado por el horticultor Moscoso sugiere que los primeros estudios fueron realizados en 1959 por el Departamento de Economa Agrcola de la Estacin Experimental de la UPR; siendo el fin principal de estos estudios el determinar el

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grado de aceptacin de esa fruta por parte del pblico. Los resultados nunca se dieron a la publicidad, pero demostraron que el grado de aceptacin de la chironja fue uno excepcionalmente alto. Otro estudio similar fue realizado en 1964 presentando resultados parecidos a los del primero, esto en lo concerniente a la aceptacin y demanda de la chironja. Adems de demostrarse que la chironja, como fruta fresca, tiene buenas posibilidades de mercadeo, tambin rene las condiciones favorables de transportacin para ser exportada. Esto de acuerdo a varios embarques realizados a Espaa durante los meses de invierno de 1965, donde la fruta fue recibida en perfecto estado luego de 15 das de trnsito pasada una semana de su recoleccin. Tambin fue evaluada la fruta como conserva reflejando resultados en clasificacin de 8 para la escala Peryen, [5], lo cual corresponde a la categora de gusta mucho. Como pasta y cascos en almbar, present un resultado de aceptable y muy aceptable para la misma escala. Otro estudio fue realizado en 1997, donde se evaluaron diferentes tratamientos para prolongar el largo de vida til poscosecha de la fruta. Esto para lograr la competencia con otros ctricos importados y hasta considerar la exportacin del mismo [6]. Luego de estos estudios, al menos publicado no se encontr ningn otro. De acuerdo a la experiencia actual por agrnomos en el campo de ctricos, stos indican que actualmente la fruta no refleja el mismo mercadeo que present en sus inicios, segn refleja el estudio antes realizado. Segn sus opiniones, tal vez, el fruto

actualmente no es bien conocido por nuestra sociedad, por lo que su consumo ha disminuido [7].

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FitoqumicosQu son?Los fitoqumicos son sustancias qumicas encontradas nicamente en tejidos provenientes de plantas, los cuales se presentan en cantidades variadas en un alimento en particular siendo los responsables de impartir el color y sabor en ste. Adems de esta funcin en los alimentos, los fitoqumicos, siendo componentes naturales bioactivos encontrados, trabajan con nutrientes presentes en los alimentos para proteger el organismo contra enfermedades [8]. Unos actan como antioxidantes, otros estimulan sistemas enzimticos y otros alteran la produccin de hormonas, estimulando el sistema inmunolgico o con efecto antiviral y/o antibacterial [9]. Estudios sugieren que los fitoqumicos tambin ayudan a disminuir o retrazar el proceso de envejecimiento y a reducir el riesgo de muchas enfermedades que incluyen desde el cncer, enfermedades del corazn, infartos, presin sangunea elevada entre otros [10].

Familias de los fitoqumicosExisten cientos de fitoqumicos, muchos de ellos son similares en funcin o composicin, por lo que son agrupados por categoras o familias. Algunas de las familias ms conocidas de estos componentes lo son: carotenoides, isoflavones, isoprenoides, isothiocianatos, monoterpenos, flavonoides, fitoesteroles y cidos grasos omega-3 y 6 entre otros [11]. Al momento, en el grupo de las frutas ctricas,

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han sido detectados un sinnmero de carotenoides, monoterpenos y fenoles; en realidad se han detectado sobre 170 diferentes fitoqumicos en una china (naranja) [12]. En el grupo de los monoterpenos existen alrededor de 40 limonoides en ctricos, siendo limonn y nomiln de los principales. Estos componentes ocurren en altas concentraciones principalmente en el jugo de china y toronja, y son algunos los responsables de proveer, de cierto modo, ese sabor agrio de los ctricos. Segn la literatura, en el grupo de los ctricos tambin se pueden encontrar un sinnmero de flavonoides, siendo estos los principales fitoqumicos evaluados a travs de este estudio. Especficamente en el C. sinensis (china), se han encontrado el hesperidin, narirutin, nobiletin, tangeritin, diosmin, rutin, entre otros. En el caso del C. paradisi (toronja), adems de cada uno de los encontrados en la china tambin se han encontrado el prunin, poncerin y el naringin entre otros, con este ltimo conocido como el principal y el ms abundante encontrado en la toronja [13].

Anlisis para la deteccin de fitoqumicosDe acuerdo a la Asociacin de Qumicos Analticos por sus siglas en ingles AOAC, existe un sinnmero de tcnicas en evaluacin para la determinacin de diferentes familias de fitoqumicos. Estos varan de acuerdo al componente a ser separado, por las propiedades y el comportamiento que presente. Estas tcnicas van desde viscometra de masa por ejemplo para determinacin de cidos grasos esenciales, as como inmumoensayos, diferentes tcnicas de cromatografa de gases

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(GC) y por separacin de cromatografa lquida de alta ejecucin (HPLC), espectometra de masa, HPLC y/o GC con espectometra de masa, entre otros .

Caractersticas funcionales de los fitoqumicosSon estas sustancias qumicas, no nutritivas pero s biolgicamente activas las encargadas de impartir color, sabor y hasta proteccin a las plantas y los alimentos de donde provienen. Son las diferentes familias de fitoqumicos las encargadas de

realizar diversas reacciones qumicas llevando a cabo cambios en color en un mismo alimento o en una planta, de igual manera en sabor y hasta en aroma [14]. Algunos ejemplos de fitoqumicos encargados de estas funciones se resumen a travs de laTabla 1.

FlavonoidesEs este grupo o familia de fitoqumicos considerados como los ms abundantes en el grupo de las frutas, especialmente se consideran como una de las familias ms detectadas en las frutas ctricas. Los flavonoides, tambin conocidos como

bioflavonoides, son un grupo de sustancias polifenlicas las cuales estn presentes en la mayora de las plantas vasculares, concentrados principalmente en la semilla, corteza, flor y en la piel y pulpa de las frutas. Son principalmente reconocidos como los pigmentos responsables del color de las hojas en las plantas, especialmente durante el otoo [15]. Un sin-nmero de medicinas provenientes de plantas contienen estos componentes, los cuales han sido reportados como poseedores de accin o 11

actividad

antinflamatoria,

antioxidante,

antialergnica,

hepatoprotectora,

antitrombtica, antiviral y anticarcinognica [16].

Tabla 1: Funciones de algunos Fitoqumicos en los alimentos [14].

Funcin

Color

Fitoqumicos

Ejemplo de Alimentos

Rojo

Licopeno, Flavonoides Antocianinas

Tomate Meln de agua Fresas Uvas rojas Papaya Cantaloupe Albaricoques Melocotones

Impartir Color Anaranjado

cido elgico Carotenoides

Verde

Isotiocianatos, Indoles

Brcol Col de Bruselas Cebolla Chayotes Ajos Coliflor

Blanco

Sulfitos, Indoles

Violeta

Fenoles Isotiocianatos cido Elgico

Arndanos Blueberries Repollo rojo Ctricos

Impartir sabor Impartir proteccin

_______

Flavonoides Fenoles

_______

Fitatos Inhibidor - proteasa

_______

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Son los flavonoides compuestos de bajo peso molecular formados por una estructura de tres anillos con varias sustituciones. Son estas caractersticas

estructurales las que aparecen como necesarias para la mejor actividad de cada uno de los flavonoides, especialmente la funcin de antioxidante, y de antiproliferativos que los destaca en el sistema [17]. Los componentes estructurales comunes a estas

molculas incluyen dos anillos de benceno en cualquier lado de un anillo de tres carbonos (Figura 1). Mltiples combinaciones de grupos hidroxilos, azcares,

oxgeno, y grupos de metilo unidos a esta estructura crean las diferentes variedades o clases de flavonoides: flavonoles, flavanones, flavones, flavan-3-oles (catequizas), antocianinas, glycsidos, e isoflavones [17]. Tambin stas forman parte de las numerosas familias que componen los tan llamados fitoqumicos, recientemente conocidos como vitamina F.

Figura 1: Estructura comn de los Flavonoides [17].

En su funcin de antioxidantes los flavonoides han sido estudiados en su actividad con el cido ascrbico, esto por coexistir en un sin nmero de plantas y sus productos. Existe un acumulado de literatura respecto a la interaccin de estos dos componentes 13

en los sistemas biolgicos. Muchos flavonoides sirven como antioxidantes para el cido ascrbico. Estudios in Vitro indican que stos tienen la capacidad de retardar la conversin de ascorbato a dehydroascorbato. Uno de los mecanismos utilizados en esta reaccin envuelve la quelacin de cobre y de otros minerales trazas por los flavonoides llevando a retrazar la oxidacin del cido ascrbico por metales. Adems de estas funciones, tambin se le otorga a los flavonoides algunas funciones fisiolgicas como el aumentar la absorcin de la vitamina C, proveer la estabilizacin de la molcula de cido ascrbico, lograr la reduccin de dehydroascorbato a ascorbato para poder ser utilizado y el permitir un almacenaje metablico de la vitamina [18].

Flavonoides en ctricosDe acuerdo a la literatura, los resultados obtenidos por diferentes investigaciones en ctricos para fitoqumicos demuestran que existe una gran variedad de flavonoides para las diferentes especies. Este contenido de flavonoides se ha encontrado que puede variar entre un cultivo y otro para una misma especie; adems de que se ha detectado que puede existir un flavonoide en la hoja del rbol o en la piel de la fruta y no presentarse en el interior de la fruta y viceversa [13]. De acuerdo al Servicio de Investigacin de Agricultura del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos por sus siglas en ingls (ARS-USDA), se resume un contenido amplio de flavonoides en ctricos. A travs de la Tabla 2 se obtienen algunos de los detectados para el C. sinensis y para el C. paradisi.

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Tabla 2: Flavonoides en ctricos.

Especie Citrus sinensis

Sub-clase Flavanone glycsido Flavones Flavonoles

Flavone glycsido Citrus paradisi Flavanone glycsido

Flavones Flavonoles

Flavone glycsido

Flavonoide Eriocitin Hesperetin Apigenin Luteolin Kaempferol Myricetin Quercetin Diosmin Rutin Eriocitin Hesperedin Naringin-4-glycsido Poncerin Prunin Apigenin Luteolin Kaempferol Myricetin Quercetin Diosmin Kaempferol glycsido Rutin

Flavonoides e implicaciones con la saludEn general, los fitoqumicos han sido vinculados con la promocin de salud; principalmente se le ha atribuido su efecto contra el desarrollo y la formacin de clulas cancerosas. En trminos de flavonoides, alrededor de 4,000 diferentes han sido identificados, muchos en frutas, vegetales y bebidas como el t, caf, cerveza, vino y jugo de frutas [19]. Por su capacidad de antioxidantes, los flavonoides pueden proteger las clulas de los efectos dainos que causan especies de oxgeno reactivo.

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Un desbalance entre antioxidantes y estas especies de oxgeno resultan en estress oxidativo, altamente relacionado al cncer, envejecimiento, aterosclerosis, dao isqumico, enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas (Ej. Parkinsons y Alzheimer) [20]. Estudios indican que muchos flavonoides ayudan proveyendo

proteccin contra estas enfermedades por su contribucin junto con vitaminas antioxidantes y enzimas, para formar un sistema de defensa antioxidante al cuerpo humano. Especficamente en estas familias de flavonoides, muchos han sido

estudiados, en el caso de aquellos presentes en ctricos evidencia sugiere que pueden ayudar a disminuir los niveles de colesterol en sangre [21], control en los procesos inflamatorios [22], beneficios para personas con Diabetes Mellitus [23], reduccin en reacciones alrgicas [24], adems de la prevencin de diferentes tipos de cncer [25]. Un estudio realizado en colaboracin con el USDA y enfocado en 22 flavonoides encontrados naturalmente en chinas (naranjas) revel segn el Dr. Najla Guthrie, presidente de la investigacin que estos compuestos pueden ser efectivos en cncer del pulmn, prstata y de las clulas melanomas. Tambin se encontr efectividad de los flavonoides en la inhibicin del crecimiento de clulas de cncer del seno [26]. Otros estudios tambin conducidos por el Dr. Guthrie indican que estos componentes encontrados en jugos de ctricos demostraron reducir el crecimiento de clulas carcingenas del colon, esto en pruebas de laboratorio [26]. Otros estudios

presentados por la Sociedad Americana del Cncer, reforzaron el que los flavonoides son una importante clase de compuestos protectores beneficiosos en disminuir diferentes tipos de cncer y tambin de algunas enfermedades cardiovasculares [27]. Adems de estas importantes funciones en la prevencin del cncer; investigaciones

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sugieren tambin actividad protectora en condiciones como hemorroides [28], insuficiencia crnica de venas [29], sangrado de encas y nariz [30], y en el tratamiento de Lymfedema (arm swelling) [31]. Principalmente para estas

condiciones los flavonoides: diosmin y hesperidin combinados, han sido asociados al tratamiento de cada una de estas condiciones, al igual que el rutin; cada uno de estos encontrados en diferentes ctricos. Estudios epidemiolgicos tambin han demostrado que la ingesta de flavonoides est inversamente relacionada a la mortalidad por enfermedades coronarias y a la incidencia de ataques al corazn. Otra importante colaboracin de estos componentes se relaciona a las lipoprotenas de baja densidad, conocidas por sus siglas en ingls LDL. La oxidacin de estas lipoprotenas se reconoce que juega un rol importante en el desarrollo de la aterosclerosis. Las clulas del sistema inmunolgico llamados macrfagos reconocen y atrapan las LDL oxidadas, proceso que lleva a cabo la formacin de placa aterosclertica en las paredes arteriales. La oxidacin de las LDL puede ser inducida tanto por macrfagos y tambin catalizada por iones de metales como el cobre. Muchos estudios

demuestran que algunos de los flavonoides pueden proteger las LDL de ser oxidadas por cualquiera de estos mecanismos [32].

Contraindicaciones de los flavonoidesEfectos adversos an no han sido detectados en el ser humano por el consumo de flavonoides naturales de los alimentos, a diferencia de aquellos encapsulados en suplementos. Esto segn la literatura, ha sido explicado por la baja disponibilidad, el

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rpido metabolismo y la eliminacin de la mayora de los flavonoides mediante el sistema. Sin embargo, s se ha encontrado que existe interaccin entre algunos flavonoides y medicamentos. En el caso de los ctricos, estudios sugieren que la presencia del flavanone naringenin principalmente en la toronja (C. paradisi) por el alto contenido en esta fruta, adems de otros componentes como los furanocoumarines de esta misma fruta han sido responsables de algunas reacciones con medicamentos. Estos componentes actan en la inhibicin de dos diferentes sistemas encargados del metabolismo de diferentes drogas. El primer sistema es la Glicoprotena-p, sistema encargado de transportar medicamentos y disminuir la absorcin de stos. Algunos de estos medicamentos incluyen: agentes

antihipertensivos, antiarrtmicos, agentes quimioterapeticos, agentes antifungales, inhibidores de proteasa para el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), agentes inmunosupresores, algunos antibiticos, el Digoxin (agente anticonvulsivo) y receptores antagonistas de H2. El consumo de toronja se ha encontrado que aumenta la bio-disponibilidad de medicamentos y sustratos de la glycoproteina-p, llevando a riesgo de toxicidad de stos. El otro sistema incluye la enzima intestinal P450 (CYP), sta es encargada del metabolismo de drogas como: inhibidores de la reductasa HMG-CoA (atorvastatin, lovastatin y simvastatin), antagonistas de canales de calcio, agentes antiarrtmicos, inhibidores de proteasa del VIH, inmunosupresores, antihistamnicos, benzodiazepinas y drogas para tratar la disfuncin erctil (sildenafil). El consumo de toronja inhibe la actividad de esta enzima, permitiendo as un almacenamiento del medicamento creando un exceso del mismo en el cuerpo humano [33].

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Recomendaciones (DRIs) para fitoqumicosAn no existen recomendaciones de consumo especficas para la variedad de fitoqumicos. S se ha recomendado de manera general el aumentar el consumo de los alimentos que los puedan contener. De acuerdo al Food and Nutrition Board, Institute of Medicine encargados de determinar las recomendaciones dietarias de nutrientes Dietary Reference Intakes (DRIs), an est en desarrollo y evaluacin los reportes para compuestos bioactivos como fitoestrgenos y fitoqumicos, adems del rol del alcohol en la salud y en enfermedades.

Vitamina CDefinicin

La vitamina C es un compuesto altamente polar, entonces altamente soluble en agua, e insoluble en solventes no-polares. La vitamina C acta como agente reductor en reacciones de hidroxilacin o reacciones de oxido-reduccin (son reacciones donde ocurre transferencia de electrones entre especies, permitiendo la oxidacin de una especie y llevando la otra especie a ser reducida). Es considerada como el agente reductor ms reactivo que puede ocurrir en forma natural en el tejido viviente, tambin es considerada como nutriente esencial para el ser humano, ya que ste no puede sintetizarlo por si solo [34].

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Comportamiento qumico de la molcula

La vitamina C pura, es un slido blanco cristalino soluble en agua y en alcohol etilo. Su nombre qumico se conoce como cido ascrbico.

Figura 2: Molcula de cido ascrbico oxidada y reducida [34].

Debido a que esta vitamina es un cido, es razonablemente estable en soluciones cidas, pero en soluciones bsicas o neutrales es fcil y rpidamente oxidada por oxgeno disuelto. La oxidacin de la vitamina C, cido ascrbico, ocurre por la prdida de dos tomos de hidrgeno, segn la molcula es convertida en cido dehydroascrbico (Fig. 2).

Anlisis para la deteccin de cido ascrbico

De acuerdo a la Asociacin Oficial de Qumicos Analticos (AOAC) se establece como mtodo aprobado para la deteccin de vitamina C, el Mtodo Tillmans. ste es una titulacin de oxidacin-reduccin (Figura 3), donde se permite la oxidacin del 20

cido ascrbico presente en la materia evaluada mediante un tinte orgnico conocido como 2,6-dicloroindofenol (DCP) [35]. Las reacciones de oxidacin y de reduccin ocurren simultneamente; por lo que segn la vitamina C es oxidada, el DCP es reducido, ganando los dos tomos de hidrgeno que pierde cada molcula del cido ascrbico presente. Segn el DCP es reducido, ocurre un cambio en color en el tinte de rojo a incoloro. Debido a que la reaccin entre el DCP y el cido ascrbico es sumamente rpido, este cambio en color puede ser utilizado como ndice del punto en la titulacin; donde todo el DCP ha sido consumido o reducido por la vitamina disponible. En el procedimiento de titulacin esta observacin visual es conocida como el punto final, donde en este caso mientras haya vitamina C sin ser oxidada la solucin ser una incolora, una vez se concluyan las reacciones de xido-reduccin, la solucin presentar un color rosado translcido, dando la conclusin a la vitamina C disponible.

Figura 3: Reaccin de oxidacin del cido ascrbico [34].

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Caractersticas funcionales de la vitamina C

A diferencia de la mayora de los mamferos, los seres humanos no poseen la habilidad de fabricar su propia vitamina C. Esta vitamina debe ser obtenida a travs de la dieta, ya que es considerada como un nutriente esencial en el sistema humano; esto debido a sus importantes roles en el funcionamiento de este sistema. Dentro de los roles que posee, se encuentra la sntesis de colgeno (componente estructural importante en los vasos sanguneos, tendones, ligamentos y huesos). Tambin juega un rol importante en la sntesis de norepinefrina (crtico neurotransmisor para la funcin cerebral). Adems, la vitamina C se requiere para la sntesis de carnitina (pequea molcula esencial en el transporte de grasas a los organelos celulares llamados mitocondrias), para la conversin de energa [36]. Estudios recientes

tambin sugieren que la vitamina C est envuelta en el metabolismo de colesterol a cidos biliares, lo cual a su vez tiene implicaciones en los niveles de colesterol en sangre y la incidencia de colelitiasis (clculos o piedra en vescula) [37]. La vitamina C tambin es considerada como un antioxidante altamente efectivo. An en

cantidades pequeas, esta vitamina puede proteger molculas indispensables en el cuerpo, tales como protenas, lpidos, hidratos de carbono y cidos nucleicos (DNA y RNA). sta los protege de daos causados por radicales libres (molculas altamente reactivas con oxgeno) o por especies de oxgeno reactivo que puede ser generado por el metabolismo normal o por exposicin a toxinas y contaminantes (Ej. Fumar). La vitamina C tambin es capaz de regenerar otros antioxidantes presentes como por ejemplo la vitamina E [38].

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Vitamina C como precursor de salud

El Instituto Americano de Investigacin en Cncer recientemente revis sobre 4,500 estudios; logrando un filtrado para formar o dar parte a un solo reporte: Alimento, Nutricin y la Prevencin del Cncer: Una Perspectiva Global: El cncer es una enfermedad prevenible. Continan las recomendaciones manteniendo el mismo dato: El comer cinco o ms servicios de frutas y vegetales por da puede prevenir sobre el 20% de todos los casos de cncer, incluyendo desde cncer de colon, cncer gstrico, de pulmn, esfago, seno, vejiga, pncreas y prstata [39]. Adems de la prevencin de los diferentes tipos de cncer, tambin se ha encontrado que sirven como tratamiento y/o prevencin de muchas otras condiciones o enfermedades. Uno de los mayores combatientes del cncer lo son los antioxidantes. Estos componentes de los alimentos ayudan a estabilizar los radicales libres y logran detener el dao celular causado por el cncer. A travs de este estudio se analiza la presencia de vitamina C o cido ascrbico, considerado como el antioxidante hidrosoluble de mayor importancia. De acuerdo a esta capacidad de antioxidante tambin se logra inhibir la formacin de nitrosaminas (carcingenos), permitiendo as reducir la incidencia de los diferentes tipos de cncer antes mencionados, entre otros [40]. La vitamina C juega un importante rol en el funcionamiento del cuerpo humano, es un componente presente en todos sus rganos. Sin la vitamina C el cuerpo no sera capaz de absorber otros dos importantes componentes: hierro y cido flico. Segn

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estudios se encontr que la absorcin de hierro, ya sea de origen animal o vegetal, ocurre mejor, cuando se toma al mismo tiempo con una fuente rica en vitamina C. Un consumo de 75mg de vitamina C proveniente de alimentos, promueve un aumento de seis veces ms la absorcin del hierro heme en comparacin al consumo de hierro sin la dosis de vitamina C en la misma comida [41]. Otra importante caracterstica que se le ha encontrado a la vitamina C, es su capacidad de prevencin o disminucin de la incidencia de la enfermedad de Alzheimer. Segn un estudio realizado en 1988, [42], y luego confirmado por otro estudio, [43], al menos un consumo diario de 500mg de vitamina C o 400 IU de vitamina E promueven un beneficio razonable de proteccin contra esta enfermedad. Tambin estudios demuestran que el uso de vitamina C y E disminuyen marcadamente la progresin de la enfermedad de Parkinson. Luego se detect que la vitamina E, por si sola, no promueve este retraso de la enfermedad, sin embargo la vitamina C, por si sola, promueve este retraso del mismo modo que en unin con la vitamina E [44]. Tambin la vitamina C en su capacidad de antioxidante se encontr que inhibe la oxidacin de las lipoprotenas de alta densidad (HDL) permitiendo as que stas mantengan su capacidad cardioprotectora [45].

Vitamina C en los alimentos

Adems de sus funciones como un nutriente esencial, el cido ascrbico es ampliamente utilizado como un ingrediente/aditivo, esto por sus propiedades reductoras y de antioxidante. De esta manera provee o permite proteccin o

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preservacin a la materia a la cual se aade El cido ascrbico puede obtenerse fcilmente a travs de la fuente dietaria, siendo las frutas principalmente el grupo de alimentos de mayor contenido, figurando los ctricos como fuente excelente; tambin algunos vegetales pueden ser catalogados como buena fuente de este nutriente. Segn se puede apreciar mediante la Tabla 3 las cantidades de vitamina C varan por alimento y por porcin o servicio del mismo.

Tabla 3: Contenido de Vitamina C en alimentos [46].

Alimentos Jugo de China Jugo de Toronja China Toronja Fresas Tomate Pimienta roja dulce Brcol Papas

Porcin Taza (4oz.) Taza (4oz.) 1 mediana mediana 1 Taza 1 mediano Taza, molida cruda Taza, cocida 1 mediana, asada

Vitamina C (mg) 62 47 70 44 82 23 141.6 58 26

Recomendaciones (DRIs) de vitamina CLa deficiencia severa de vitamina C es conocida por siglos como una potencial enfermedad llamada, escorbuto. Para finales de los aos 1700s la marina britnica reconoci que el escorbuto podra ser curado por el consumo de ctricos (chinas y/o limones), an as la vitamina C no fue aislada y descubierta hasta inicio de los aos 25

1930 [47]. Los sntomas del escorbuto incluyen contusin y fcil sangrado, prdida de cabello y dientes y dolor e inflamacin en las uniones joints o coyonturas. Estos sntomas surgen por la debilidad ocasionada a los vasos sanguneos, tejido conectivo y huesos por la deficiencia en colgeno. Otros sntomas tambin pueden ocurrir como la fatiga, esto ocasionado por la disminucin en los niveles de carnitina, necesaria para la derivacin de energa proveniente de la grasa, o por la disminucin del neurotransmisor norepinefrina. El escorbuto es raro en pases desarrollados, ya que segn estudios puede ser prevenido por tan solo 10mg de vitamina C por da. Sin embargo, casos recientes han ocurrido en nios y ancianos en dietas muy restringidas [48]. En Estados Unidos, la ingesta recomendada por da (DRIs) para la vitamina C fue revisada recientemente para lo que anteriormente era 60mg/d para hombres y mujeres adultos. Los DRIs continan principalmente basados en la prevencin de Para

enfermedades por alguna deficiencia y en la promocin de ptima salud.

fumadores la ingesta recomendada es 35mg/d mayor que para los no fumadores, esto debido al estrs oxidativo que presentan los fumadores debido a las toxinas del humo del cigarrillo y porque presentan niveles bajos en vitamina C. Las recomendaciones de acuerdo a la edad y sexo de la persona se resumen a travs de la Tabla 4.

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Tabla 4: Recomendaciones (DRIs) para Vitamina C [49].

Ingesta Dietaria Recomendada (DRI) para Vitamina C Etapa de vida Infantes Infantes Nios Nios Nios Adolescentes Adultos Fumadores Embarazadas Embarazadas Lactantes Lactantes Edades 0 6 meses 7 12 meses 1 3 aos 4 8 aos 9 13 aos 14 18 aos 19 aos o ms 19 aos o ms 18 aos o menos 19 aos o ms 18 aos o menos 19 aos o ms Hombres (mg/da) 40 (IA)* 50 (IA)* 15 25 45 75 90 125 IA: Ingesta adecuada

Mujeres (mg/da) 40 (IA)* 50 (IA)* 15 25 45 65 75 110 80 85 115 120

cido flico

DefinicinEl cido flico (2-amino-4-hydroxy-6-methyleneamino benzoil-L-glutamic acid pteridine) es un compuesto pteridino heterocclico con la siguiente estructura (Fig. 4) [50]. Es una vitamina perteneciente al complejo B, por lo que es hidrosoluble.

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Figura 4: Estructura del cido flico.

Comportamiento qumico de los compuestos de folato

El cido flico, generalmente, no es encontrado de forma natural en los alimentos. Sin embargo, es la forma sinttica ms comn y estable que existe, por lo que se utiliza para la fortificacin de alimentos y para la preparacin de frmacos y suplementos. Folato es el nombre genrico que se le ha dado a los diferentes compuestos basados en la estructura del cido pteroico, conjugado con uno o ms L-glutamatos unidos a travs del grupo carboxilo del amino cido (Fig. 5) [50].

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Figura 5: Estructura de los compuestos de Folato.

Las formas naturales en que se encuentra el folato son aquellas donde el anillo pteridine es reducido con o sin sustitucin en el carbono de la posicin 5 y 10. El folato 5Me-H4 es la forma en que circula en el torrente sanguneo en los seres humanos y algunas veces es utilizado tambin para la fortificacin de alimentos. Los compuestos de folato ms importantes que surgen de forma natural en los alimentos lo son el 5 methyl tetrahydrofolato (5Me-H4 folato), 5-formyl tetrahydrofolato (5HCO-H4 folato) y el tetrahydrofolato (H4 folato). Siendo el 5methyltetrahydrofolato el principal en el torrente sanguneo de los seres humanos y el nico encontrado en ctricos segn establece la literatura [51]. Los compuestos de

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folato son considerados como la vitamina ms inestable del complejo B, esto, principalmente por calor y oxidacin. Adems de que puede surgir la interconversin entre cada una de las molculas, dependiendo del ambiente oxidativo y del pH del medio en que se encuentre. Otro compuesto de folato que puede encontrarse en alimentos o fludos biolgicos es el 10-formyltetrahydrofolato (10 HCO-H4 folato). Este compuesto puede tambin surgir o formarse como intermediario o como entidad semi-estable durante el anlisis en la deteccin de folatos, especialmente, si la extraccin utilizada es acdica. El grado en que este compuesto surge en los

alimentos an se desconoce ya que es muy inestable. Estudios previos han demostrado que el 10 HCO-H4 folato es convertido a 5HCO-H4 folato durante la extraccin con calor [51]. Es muy poca la informacin confiable en la literatura en relacin al surgir natural de este componente (10 HCO-H4 folato) en los alimentos. Debido a que este componente no est disponible en forma comercial, no pudo ser determinado a travs de este estudio. Si fuese el principal componente para

investigar, es de suma importancia que el mtodo de extraccin de folato no sea uno de calor, como el utilizado en este anlisis, esto debido a la inestabilidad que presenta este componente.

Anlisis para la deteccin de folato

La deteccin de este nutriente en un alimento es una de mucha cautela; esto a consecuencia de las cantidades tan bajas en que se encuentra en los alimentos, tambin al alto nivel de inestabilidad que posee. Por muchos aos el folato total en

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un alimento ha sido determinado con diferentes grados de precisin, principalmente mediante ensayos microbiolgicos [52]. Estos ensayos permiten conocer el contenido total de folato en un alimento mediante la utilizacin de diferentes cultivos de bacterias, este mtodo es uno de larga duracin adems de que no permite conocer cada uno de los compuestos individuales de los folatos presentes en la muestra. Adems del tiempo prolongado de anlisis, otra desventaja de este medio es la interferencia de factores en los cultivos que puedan contaminarlos. Los datos

existentes sobre las diferentes formas o compuestos de folato presentes en un alimento son resultados ms recientes y los mtodos de deteccin del mismo continan en desarrollo y optimizacin. Varias tcnicas han sido utilizadas

incluyendo bio-ensayos, ensayos microbiolgicos, ligandbinding y radio-ensayos. El ensayo microbiolgico con el microorganismo Lactobacillus casei para la determinacin de folato total en un alimento es la tcnica clsica y aprobada por la Asociacin Oficial de Qumicos Analticos, por sus siglas en ingls AOAC [52]. La deteccin mediante el sistema de cromatografa lquida de alta ejecucin (HPLC) en comparacin con la tcnica aprobada actualmente ofrece ser una tcnica avanzada y de gran precisin esto de acuerdo a estudios realizados por el Food Standard Agency para el USDA. Segn sta agencia se han realizado anlisis para diferentes alimentos simultneamente utilizando estas dos tcnicas, obteniendo resultados similares para ambas, con poca o ninguna diferencia significativa. Las tcnicas utilizando el sistema de HPLC tambin poseen grandes ventajas como el permitir mayor rapidez en la deteccin total de folatos, adems de permitir resultados individuales de los diferentes tipos de folato presentes en los alimentos, esto a diferencia del mtodo

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microbiolgico. An existe controversia respecto a la precisin existente por esta nueva tcnica, existen estudios que concluyen igual o mayor precision; y otros que reportan diferencias entre ambos mtodos [51]. Segn cientficos del Food Standard Agency cualquier mtodo que intente la determinacin de folato en alimento u otras muestras biolgicas debe considerar las siguientes reas (Fig. 6). Los folatos deben ser primero extrados de la matrz del alimento. Esto es

usualmente acompaado por tratamiento de calor con soluciones amortiguadoras que contengan antioxidantes y a un pH cercano al neutral, con variables importantes como: el tiempo de calentamiento, temperatura, tipo y concentracin de antioxidantes utilizados. Luego se aade una composicin enzimtica para llevar a cabo la

hidrlisis de estos componentes. El efecto de componentes no folatos en la muestra debe ser eliminado antes de la determinacin de folato para evitar interferencias. Esta limpieza es requerida si el mtodo de HPLC es el utilizado para la deteccin, esto para mayor claridad en los resultados obtenidos. Finalmente, es la etapa de la

determinacin. Para las formas naturales de folato se requiere el detector de luz ultravioleta (UV) adems de un detector de fluorescencia; a diferencia de la deteccin de cido flico la cual solo requiere evaluacin a travs del detector de luz UV. Tambin otros sistemas como electroqumico, diodearray y espectometra de masa estn comenzando a ser utilizados en la deteccin de folato, estos prometen ser tcnicas con alto grado de precisin y con mayor rapidez que el mtodo oficial actual.

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Extraccin

Deconjugacin enzimtica

Remocin de componentes no-folatos

DeterminacinFigura 6: Etapas para el anlisis de Folato en alimentos [51].

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Caractersticas funcionales del cido flico

La determinacin de folato o cido flico es una de mucha importancia, ya que es considerado un nutriente esencial para el desarrollo y funcionamiento del ser humano. Esto debido a su importancia en la produccin del cido deoxiribonucleico (DNA) y del cido ribonucleico (RNA), adems de su funcin de trabajar con la maduracin de las clulas rojas. La deficiencia de folato, ya sea por ingesta inadecuada o por problemas metablicos, es comn en muchas partes del mundo. Esta deficiencia puede resultar en problemas de divisin celular y de sntesis de protenas, ambos procesos crticos en el crecimiento y desarrollo de tejidos. Tambin el reemplazo de clulas rojas y de clulas del tracto gastrointestinal presenta alteraciones, por lo que puede surgir un tipo de anemia conocida como anemia megaloblstica, adems de deterioro del sistema digestivo [53]. En particular, la deficiencia presente en mujeres previo a la concepcin se ha encontrado que puede llevar a defectos en el tubo neural en el feto lo cual ha sido considerado como responsable de la fortificacin de alimentos en los Estados Unidos. Por esta razn, la fortificacin de cereales y de todo producto a base de harinas es mandatario en los Estados Unidos a una razn de 140g/100g de alimento. Niveles mayores se recomendaran para brindar mayores beneficios, pero existe el riesgo de enmascarar la deficiencia de cobalamina (vitamina B12); debido a esto la fortificacin an contina siendo un motivo de controversia [54].

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cido flico como precursor de saludAdems de las importantes caractersticas funcionales de esta vitamina del complejo B, tambin se le ha asociado a un sinnmero de condiciones las cuales puede prevenir. De acuerdo a estudios realizados, el cido flico segn antes

mencionado tiene la capacidad de prevenir defectos del tubo neural, defecto severo de nacimiento, esto por su funcin en permitir aumentar el sustrato disponible para la reductasa thermolabile (5,1.0 methylenetreta hydrofolate). Esto resultara en un

aumento en la conversin del amino cido homocistena al amino cido metionina (amino cidos encontrados en el torrente sanguneo), llevando a eliminar o a reducir el riesgo de que no cierre el tubo neural [55]. Otros estudios tambin demuestran que una dieta alta en cido flico y vitamina B6 puede ayudar a disminuir el riesgo de cncer del seno. Los resultados sugieren que las mujeres que quieran protegerse contra el cncer del seno deben tener una dieta alta en estos nutrientes, especficamente, aquellas mujeres que consumen bebidas alcohlicas deben prestar atencin especial a la ingesta de cido flico ya que tambin las protege de los efectos negativos causados por el alcohol. Esto segn el estudio presentado en el Journal of the National Cancer Institute sobre la relacin del cido flico y la vitamina B6 como modo de proteccin contra el cncer del seno [56]. Estudios recientes tambin establecen el consumo de cido flico como uno de prevencin de ataques al corazn ocasionados por niveles elevados de homocistena. Segn estudios, el consumo adecuado de alimentos ricos en folato (aproximadamente 392mg/d) est asociado con la disminucin de un 22% de los niveles de homocistena en el cuerpo [57]. Otro estudio realizado por cientficos del National Institute of 35

Aging publicado en enero de 2002 asocia la deficiencia del cido flico en el cuerpo con aumento en la susceptibilidad de la Enfermedad de Parkinson. Segn este

estudio, se detect en ratas que aquellas con niveles bajos de folato en la sangre presentaban niveles elevados de homocistena en sangre y cerebro. Este exceso de homocistena provocaba dao al DNA de las clulas nerviosas de la sustancia nigra (estructura del cerebro encargada de producir dopamina). Esta prdida en produccin de dopamina causaba disfuncin a las clulas nerviosas llevando a las ratas a la inhabilidad de dirigir o controlar sus movimientos de forma correcta [58]. Al

relacionar este estudio con seres humanos se encuentra que las personas con esta enfermedad presentaban niveles bajos de cido flico en sangre, aunque esto no puede determinarse si fue la causal de la enfermedad o si fue causado por mala alimentacin debido a la enfermedad. Pero basado en este estudio, Dr. Mattson; investigador principal del estudio especula que el consumo adecuado de cido flico, ya sea por dieta o suplemento, puede ayudar a proteger el envejecimiento cerebral y el que no haya produccin de dopamina causando as el Parkinson u otra enfermedad neuro-degenerativa [59]. Esta capacidad del cido flico para disminuir los niveles de homocistena en el cuerpo, adems de ayudar en la prevencin de las condiciones antes mencionadas, tambin se le otorga la reduccin en el riesgo de demencia y de la enfermedad de Alzheimer. Segn estudios realizados, se detect, que el amino cido homocistena en niveles elevados en sangre tambin est asociado a demencia y reduccin cognoscitiva. Los resultados sugieren que controlar los niveles de este amino cido en la edad mediana reduce grandemente el riesgo de desarrollar demencia en edad ms avanzada [60].

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cido flico en los alimentosDe acuerdo a los datos establecidos del contenido de folato en los alimentos, stos son encontrados principalmente en legumbres, vegetales de color verde, hgado, la levadura y algunos ctricos; estos ltimos considerados como buena fuente de esta vitamina [61]. Para obtener una idea sobre las cantidades en un alimento, segn la base de datos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) podemos encontrar alrededor de 74g de folato total en 8oz de jugo de china fresco y aproximadamente 25g en 8oz de jugo de toronja fresco, otros datos de alimentos pueden obtenerse mediante la tabla 5 [46].

Tabla 5: Contenido de cido flico en alimentos [46].

Alimento Brcol, Crudo Brcol, Hervido y Congelado Cereal de arroz, listo para servir China, Jugo concentrado diluido China, Jugo fresco China, Fresca Fresas, Frescas Tomate, Fresco Toronja, Jugo Fresco Toronja, Blanca Fresca Papa, Asada con Piel

Porcin 1 Taza 1 Taza Taza 1 Taza Taza 1 Taza 1 Taza 1 Taza Taza 1 Taza 1 Mediana (202g)

cido flico g 55 103 346 110 37 54 40 27 12.5 25 57

Recomendaciones (DRIs) de cido flico

De acuerdo a las recomendaciones dietarias (DRIs) de 1998 en Estados Unidos se establece una ingesta diaria de 400 g en mujeres y hombres adultos (25 aos o ms)

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saludables para satisfacer las necesidades bsicas [62]. Estos nmeros reflejan un aumento al compararse con las recomendaciones previas las cuales indicaban 180-200 g /da. Este cambio surge debido a que en las ltimas dcadas se encontr la necesidad de niveles ms altos de cido flico, 400 g/da, principalmente para mujeres en edad reproductiva, como modo de prevencin de defectos del tubo neural, esto segn el Centro de Control y Prevencin de enfermedades (CDC) para 1992. Las recomendaciones generales de acuerdo a la etapa de vida de la persona pueden ser obtenidas mediante la Tabla 6.

Tabla 6: Recomendaciones (DRIs) para cido flico [62].

Ingesta Dietaria Recomendada (DRI) para cido flico Etapa de vida Infantes Infantes Nios Nios Nios Adolescentes Adultos Embarazadas Embarazadas Lactantes Lactantes Edades 0 6 meses 7 12 meses 1 3 aos 4 8 aos 9 13 aos 14 18 aos 19 aos o ms 18 aos o menos 19 aos o ms 18 aos o menos 19 aos o ms Hombres (g/da) 65 (IA)* 80 (IA)* 150 200 300 400 400 Mujeres (g/da) 65 (IA)* 80 (IA)* 150 200 300 400 400 600 600 500 500

*IA: Ingesta Adecuada

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MATERIALES Y MTODOS

Muestreo de la chironja

Seleccin de la muestraLas chironjas evaluadas se obtuvieron de la Estacin Experimental Agrcola de Isabela, P.R. (Apndice Fig. 3 y 4). El rea provee cuatro bloques con siembras de chironjas, en un suelo de la serie Coto (Typic Hapludox, arcilloso caolintico, isohipertrmico) con un pH de 5.9 y buen drenaje; cada bloque con uno o dos rboles injertados en las cuatro combinaciones injerto-patrn (Cleopatra, Naronja, Sun Chu Sha y Hrs812 Sunki-Benecke trifoliate orange). En cada uno de los bloques se recolectaron dos frutas de cada variedad mediante un muestreo aleatorio, donde en el caso que existieran dos rboles, se seleccion al azar el que proveera la fruta. La fruta se cosech en su punto ptimo de consumo y se analiz inmediatamente.

Preparacin de la muestraUna vez cosechadas las frutas se lavaron y se rebanaron en mitades para obtener el jugo mediante un exprimidor elctrico. Se midieron los slidos solubles totales (grados Brix) del jugo de cada chironja a travs de un refractmetro, esto para determinar que estn en su punto ptimo de consumo. Los grados Brix recomendados en chironja fluctan entre (9 12 grados) [64]. De estar en su punto ptimo se procedi a evaluar la fruta inmediatamente para los diferentes metabolitos a

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determinar, de lo contrario se descart y se comenzaba a evaluar otra fruta. Para cada uno de los anlisis se utiliz el jugo de la fruta inmediatamente extrado, esto para evitar principalmente oxidacin de vitamina C, cambios en folato, as como en fitoqumicos.

Anlisis de los componentes nutricionales

Deteccin de Flavonoides

Anlisis cualitativo de flavonoides en la chironja [65]. 1. Extraccin e hidrlisis: Se obtuvieron 15ml de jugo de chironja y se le aadieron 40ml de metanol acuoso al 62.5% (conteniendo 2g/l BHA), luego se aadi 10ml de HCl (6M) cuidadosamente. Se calent la muestra en un bao de vapor hasta alcanzar temperatura de 90 C. Se coloc en sistema de reflujo por espacio de 2 horas, llevando luego a enfriar en el refrigerador. Luego se diluy la muestra con metanol hasta alcanzar volumen de 100ml y se pas a sonicar por 5 minutos para formar el extracto final. Aproximadamente 3ml del extracto final se filtraron a travs de un filtro de 0.45 micrmetros (Santorius Minisart) antes de inyectar 20l al sistema de HPLC. Cada muestra se prepar y analiz en duplicado. 2. Extraccin e hidrlisis de Flavonoides Glycsidos Se obtuvo 0.5g de muestra y se le aadieron 20ml de Metanol ac. (62.5%). Se dej en reposo por 10 minutos y luego de sedimentarse la muestra se obtuvo una

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alcuota de 2ml y se le aadi 2ml de agua (Grado HPLC). Se llev a pH de 2.5 mediante HCl y NaOH. Se filtr la muestra a travs de un filtro de 0.45 m y luego se inyect 20 l a travs del sistema de HPLC. Cada muestra se realiz en duplicado. 3. Sistema HPLC En el sistema de Cromatografa lquida de alta ejecucin por sus siglas en ingls HPLC (Apndice Fig. 5), se utiliz una columna de fase reversa Carbono 18 (250 x 4.6 micrmetros, 5 micrmetros). La fase mvil consisti de metanol-agua (30/70 v/v) con 1% de cido frmico (A) y metanol 100% (B). El gradiente fue de 25-86% (B) en 50 minutos a una razn de flujo de 1ml/min, para un largo de onda de 285 325 nm. Para la deteccin de flavonoides glycsidos; se utiliz una fase mvil de 1% cido frmico en agua HPLC (A) y 100% acetonitrlo (B). El gradiente fue de 5 60% B en 60 minutos a una razn de flujo de 1ml/min, para un largo de onda de 285 325 nm. 4. Estndares evaluados Se utiliz una solucin comercial con una mezcla de los siguientes flavonoides: naringenin, kaempferol, myricitin, quercetin y rutin (flavonoide-glycsido); siendo stos algunos de los principales flavonoides encontrados en ctricos. Se prepar el estndar a diferentes concentraciones (0.2mg/ml; 0.5mg/ml; 1.0mg/ml). Se pes el estndar y se llev a volumen con metanol hasta lograr las concentraciones mencionadas. 5. Validacin del Mtodo Se valid el mtodo mediante la tcnica de spiked, donde se realizaron cuatro rplicas para una muestra de leche ntegra en polvo. Se escogi esta muestra por ser

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una de origen animal, adems de ser una recomendada por la metodologa por su alto proceso de elaboracin, lo cual elimina muchos de sus componentes naturales que puedan interferir. Se procedi a evaluar un blanco consistiendo de leche diluida en agua (razn de 1:1), segn sus instrucciones de preparacin y se llev a cabo el procedimiento realizado a la chironja. Se obtuvo otra muestra de leche ya preparada y se le aadi el estndar evaluado logrando dos diferentes concentraciones (0.3g/ml) y (0.5g/ml) luego se continu con el mismo tratamiento que para cada una de las muestras de chironja evaluadas. Se analiz cada muestra mediante el sistema de HPLC para determinar la presencia de cada uno de los componentes aadidos. Para esto se utiliz el mismo gradiente y la razn de flujo utilizado para la deteccin de flavonoides y el de flavonoides-glycsidos.

Deteccin de Vitamina C

Determinacin de cido ascrbico mediante el Mtodo de Tillmans (Titulacin de 2,6 - Dicloroindofenol) [23]. 1. Preparacin de soluciones: a. cido metafosfrico-actico: Para 500ml, se pes 15g de cido metafosfrico y se le aadi 40ml de cido actico y 200ml de agua destilada para disolver, luego se llev a volumen de 500ml y se filtr la solucin. La solucin tiene duracin de una semana una vez preparada.

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b. Solucin de Indofenol (Tinte para titular) Para 200ml, se pes 50mg de 2,6-dicloroindofenol y se disolvieron en 50ml de agua destilada y se pes 42mg de Bicarbonato de sodio, se agita vigorosamente y luego de disolverse se lleva a volumen de 200ml y se filtra la solucin. La solucin tiene duracin de una semana una vez preparada. 2. Estandarizacin del tinte: Se colocaron 2 ml de solucin de cido ascrbico estndar (1 mg/ml) en tres diferentes matraces de 50 ml cada uno, conteniendo 5 ml de solucin de cido metafosfrico actico *(A1a). Se titul cada uno con la solucin de indofenol *(A1b) hasta obtener un color rosado que persistiera por 5 segundos. Simultneamente se titularon 3 blancos, los cuales consistan de 7 ml de la solucin de cido

metafosfrico - actico llevado a volumen de 15 ml con agua destilada. 3. Preparacin de la muestra: Se obtuvieron 2 ml de la muestra y se pesaron, se aadieron a un matraz (50ml) con 5 ml de cido metafosfrico actico. NOTA (Si la muestra permaneca con mucho color se aadan 20 ml de agua y 5 ml de metafosfrico actico). Se titul con la solucin de indofenol hasta obtener un color rosado que persista por 30 segundos.

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4. Contenido de cido ascrbico

Frmula: C * V * FD * 100 Peso de muestra (g)

Donde:

C = mg de cido ascrbico/ml tinte V = ml tinte para titular muestra FD = factor de dilucin utilizado

Deteccin de Folatos [12]1. Preparacin de soluciones: a. Amortiguador de fosfato (1/15M) Para 1 litro, se pesaron 3.6g KH2PO4 y 8.3g K2HPO4 y se disolvieron en un litro de agua (Grado HPLC), con 15 g de Ascorbato de sodio como antioxidante. b. Amortiguador de NaCl Para 1 litro, se pesaron 58g NaCl y se aadi a 1 litro del amortiguador de fosfato (1/15M) y se lleva a pH de 7.0 + 0.05. 2. Extraccin y deconjugacin enzimtica Se obtuvo 80mg de Clara-Diastasa, 80mg de Tripsina y se mezclaron con 100ml de amortiguador de fosfato 1/15M *(C1a); a esta mezcla se le aadi 10g del jugo de chironja. Se homogeniz la muestra por 5 minutos mediante un sonicador y luego se

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llev a hidrlisis por 3 hrs. en un bao de agua con temperatura de 40 C moviendo la muestra generosamente cada 30 minutos. Una vez hidrolizada se centrifug la

muestra por espacio de 20 minutos con 2000 RPM y temperatura de 15C. Luego se filtr la muestra con un filtro de doblez (d = 23cm). Se obtuvo 10ml de la solucin clara a travs de una pipeta y se coloc en un matraz de 50ml con 0.8g de DEAESephadex. Se movi la mezcla generosamente por 30 minutos y se dej en reposo a temperatura ambiente por varios minutos. 3. Limpieza de la muestra Se enjuag la solucin del matraz en una columna de filtro (Apndice Fig. 6) con amortiguador de fosfato, pH 7.0. Luego se colect la fraccin de folatos que est en la columna aadiendo de 20-25ml del amortiguador de NaCl *(C1b), permitiendo un flujo de 1ml/min aproximadamente. Se obtuvo la solucin colectada y se filtr a travs de un filtro de 0.45 m para HPLC y se proces inmediatamente. 4. Sistema de HPLC Para la deteccin de folatos se utiliz un gradiente binario en sistema de cromatografa de alta ejecucin (HPLC) con fase reversa y columna C18, mediante dos detectores (fluorescencia y luz ultravioleta). El detector de fluorescencia con largo de onda de excitacin de 300nm y emisin de 360nm (alta sensitividad). El detector de luz UV midi a un largo de onda de 280nm y 290nm. El sistema utiliz una fase mvil A (95/5 Amortiguador de Fosfato/Acetonitrilo) y B (80/20 Amortiguador de Fosfato/Acetonitrilo). El volumen de inyeccin fue de 100l con tiempo de corrida de 25 minutos. Para cada una de las muestras tambin se proces un blanco.

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5. Clculo del contenido de cada componente de Folato Se determin la concentracin de folato para cada una de las muestras mediante la interpolacin en las grficas de calibracin y se calcul la concentracin de cada componente de folato de acuerdo a la siguiente ecuacin:

C1*V*DD*DE*DC*100 W*1000 Donde: C1 V DD DE DC W = = = = = =

g/g

concentracin en ng/ml interpolados de la grfica Volumen de extraccin inicial (100 ml) Dilucin por reconjugacin Dilucin por extraccin (si se diluy) Dilucin/Concentracin por limpieza (Normalmente = 1) Peso de la muestra

6. Estndares evaluados A. Preparacin de soluciones: a. 0.05M solucin de Borato de sodio Se pes 9.54g de Tetrahydroborato de sodio en un matraz volumtrico de 500ml y se llev a volumen con agua destilada. b. 0.05M solucin de Borato con Mercaptoetanol (0.4%w/v) Se aadi 0.4ml de mercaptoetanol a una volumtrica de 100ml y se llev a volumen con la solucin de Borato de sodio (6 A1). Preparar el mismo da de su uso. c. Solucin de Amortiguador de Fosfato; 0.1M, pH 7.0 Se pes 7.02g de Dipotasio hidrogenado de fosfato y 2.62g de Potasio dihidrogenado de fosfato en un vaso de 500ml. Se la aadi 400ml de agua purificada y se mezcl hasta disolver. Mediante un metro de pH, se ajust el pH de la solucin

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hasta aproximadamente 7.0 + 0.05 a travs de HCl (1M) o KOH (1M) segn requerido. Luego se transfiri a una volumtrica de 500ml y se llev a volumen con agua purificada. B. Preparacin de estndares (500g/ml) a. 5Methyl H4 folato Se pesaron 0.0055 + 0.00005g de este estndar en una volumtrica de 10ml y se diluy a volumen con el amortiguador de Borato de sodio con Mercaptoetanol, se mezcl hasta diluido. b. 5Formyl H4folato (cido folnico) Se pesaron 0.0108 + 0.00005g del estndar en una volumtrica de 25ml y se diluy con el amortiguador de Borato de sodio con Mercaptoetanol, se mezcl hasta diluido. c. H4 folato Se pesaron 0.0125 + 0.00005g del estndar en una volumtrica de 25ml y se diluy con el amortiguador de Borato de sodio con Mercaptoetanol, se mezcl hasta ser diluido. d. cido flico Se pesaron 0.0100 + 0.00005g del estndar en una volumtrica de 25ml y se diluy con el amortiguador de Borato de sodio con Mercaptoetanol, se mezcl hasta diluido. 7. Validacin del Mtodo El mtodo fue validado mediante el anlisis de la misma fruta, la chironja. Se seleccion la misma fruta para mantener un pH igual al del alimento evaluado, para

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as poder descartar variables que estn afectando la deteccin. sta se evalu en triplicado y se analiz por dos diferentes ocasiones. A cada muestra se le aadi una cantidad especfica del estndar 5 metyl-tetrahidrofolato uno de los evaluados en la chironja. Se le aadi este estndar logrando dos diferentes concentraciones

(0.2g/ml) y (0.3g/ml) una vez presente en el volumen total de la muestra. Luego se proces cada muestra mediante el mismo mtodo utilizado para las muestras de chironja y se procedi a medir mediante el sistema de HPLC. Se determin el porcentaje del folato (5 MTHF) aadido que se recuper para ser comparado con el porcentaje que se aadi a la muestra, y se determin el porciento de recuperacin mediante la curva de calibracin realizada para ste estndar en concentraciones de 0.02g/ml hasta 0.5g/ml.

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RESULTADOSA travs de la pgina 50 a la pgina 60 se presentan los datos obtenidos mediante esta investigacin para los diferentes componentes estudiados en la Chironja. De acuerdo a la comparacin de cromatogramas obtenidos por la separacin de HPLC para la solucin del estndar de flavonoides evaluados con los obtenidos para las muestras de Chironja; se resumen los flavonoides encontrados en el jugo de esta fruta a travs de la Tabla 7 de este captulo. Cada uno de estos se identifica de acuerdo a las propiedades o comportamiento que presentan para su deteccin (Apndice Tabla 1). El mtodo utilizado fue validado a travs de una muestra de leche ntegra en polvo, a la cual se le aadi el estndar de flavonoides a diferentes concentraciones (Apndice Fig. 6)

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Tabla 7: Flavonoides detectados en los diferentes patrones de Chironja para cada uno de los bloques de cosecha.

Patrn/Bloque Cleopatra 1 2 3 4 Naronja 1 2 3 4 Sun Chu Sha 1 2 3 4 Sunkie Benecke 1 2 3 4 * * * * * * * * * * * * Myricetin * * * * Naringenin

Flavonoides Quercetin * * * * Kaempferol * * * * Rutin * * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* * * *

* Flavonoide presente en la muestra

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Figura 7: Cromatograma para la solucin de estndares de flavonoides.

Leyenda: 1 Catechin 2 Rutin 3 Myricetin 4 Naringenin glycsido 5 Quercetin 6 Kaempferol

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Figura 8: Cromatograma obtenido para muestra de Chironja.

Leyenda: 1 N/A 2 Rutin 3 Myricetin 4 N/A 5 Quercetin 6 Kaempferol

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La tcnica utilizada para la cuantificacin de vitamina C refleja los resultados obtenidos mediante la Tabla 8; as como las figuras 9 a la 11 en las prximas pginas.

Tabla 8: Contenido de Vitamina C (mg) en 100g para cada una de las muestras de Chironja evaluadas de acuerdo al patrn y al bloque de cosecha.

BLOQUE Patrn Replica 1 2 3 4 Promedio Total 1 2 Sunki Benecke 3 4 44.568 45.043 45.323 45.067 45.260 44.603 44.285 45.352 44.045 44.325 44.568 44.182 45.066 45.383 44.703 45.068 44.803

Promedio 44.735 44.839 44.720 44.917 1 2 Naronja 3 4 36.596 36.623 37.203 36.524 37.258 37.254 37.322 36.652 35.040 37.184 36.645 37.182 37.170 37.425 36.855 37.062 36.875

Promedio 36.516 37.122 37.006 36.855 1 2 Cleopatra 3 4 45.529 44.325 43.824 44.168 43.441 44.213 44.163 43.740 43.693 43.752 43.722 43.812 43.809 43.659 43.852 44.253 43.997

Promedio 44.118 43.987 43.890 43.993 1 2 Sun Chu Sha 3 4 43.809 44.253 43.585 43.489 44.411 44.163 44.235 43.687 44.616 43.715 44.312 44.306 44.163 43.699 44.183 44.352 44.061

Promedio 44.250 43.958 44.079 43.958

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Figura 9: Contenido promedio de Vitamina C en Chironja por Patrn.44b 45 40 35 Vitamina C (mg) 30 25 20 15 10 5 0 Naronja Cleopatra Sun Chu Sha Patrn Sunkie Benecke54

44.06b

44.8c

36.87a

Figura 10:Contenido promedio de Vitamina C en Chironja por Bloque.42.48 42.48 42.46 Vitamina C (mg) 42.44 42.42 42.4 42.38 42.36 I II Bloque III IV 42.43 42.42 42.4

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Figura 11: Contenido promedio de Vitamina C en Chironja en comparacin con el contenido en China y en Toronja.

140 120 93 Vitamina C (mg) 100 80 60 40 20 0 Toronja Chironja Ctricosi

124 105

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China

Durante la deteccin de folatos en chironja, se utiliz un mtodo realizado por el Food Standard Agency para el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA). ste fue utilizado para la evaluacin de los compuestos de folatos (5-metil tetrahydrofolato, 5-formyl tetrahydrofolato, tetrahydrofolato y cido flico) en diferentes alimentos, incluyendo: leche descremada en polvo, frmula infantil, pan integral, hgado de cordero, espinaca y polvo de levadura. Este mtodo fue modificado para la determinacin del 5-metiltetrahydrofolato en el jugo de Chironja. En este estudio el mtodo fue validado mediante el uso de la misma muestra evaluada; la chironja. De acuerdo a la literatura la precisin para la validacin de un mtodo es definida como la diferencia entre el valor promedio medido para un material y el valor real. Las tablas y figuras que se presentan a continuacin demuestran los resultados obtenidos para la validacin de este mtodo.

Tabla 9: Porcentaje de recuperacin para muestras de Chironja con 5-Metil-tetrahydrofolato (5- MTHF) aadido a diferentes concentraciones.

5-MTHF

Muestra nmero

% Recuperado

Promedio % Recuperado

1 (0.2g/ml) 2 3 1 (0.3g/ml) 2 3

90 89 92 92 91 92 92 90

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Figura 12: Curva de Calibracin para el estndar 5-metiltetrahydrofolato.90 80 70 rea (mAU*s) 60 50 40 30 0.05 20 10 0 0 0.1 0.2 0.3 Concentracin (g/ml) 0.4 0.5 0.6 0.02 0.125 0.25 0.5

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Figura 13: Cromatograma para el estndar 5-Metiltetrahydrofolato (5-MTHF).

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Figura 14: Cromatograma para muestra de Chironja con 5-MTHF aadido.

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DISCUSINPara la evaluacin de fitoqumicos en la chironja se estudiaron cinco diferentes flavonoides, estos conocidos como los ms abundantes en el grupo de las frutas ctricas. La solucin de estndar utilizada mediante este estudio, de acuerdo a la Figura 7 del captulo de resultados refleja la presencia de los flavonoles Quercetin, Kaempferol, Myricetin y Rutin; as como para el flavanone glycsido Naringenin. A travs de la Tabla 7 del mismo captulo se resume por patrn de chironja y por bloque de cosecha los flavonoides encontrados. Segn esta tabla se denota la ausencia del Naringenin- 4-glycsido uno de los principales que se deseaba estudiar por su alto contenido en la toronja (C. paradisi). Este flavanone glycsido adems de ser el ms abundante en la toronja, tambin es el principal responsable de la mayora de interacciones con medicamentos. Mediante la figura 8 se puede detectar la presencia de los flavonoles Quercetin, Myricetin, Rutin y Kaempferol en una de las muestras evaluadas; esto al compararse con el cromatograma obtenido para el estndar (Figura 7). Adems se denota la ausencia del flavanone Naringenin; ya que ninguno de los picos obtenidos coincide con las propiedades establecidas para este componente (Apndice Tabla 1). Estos cromatogramas coinciden para cada uno de los patrones de chironja evaluados y se detecta de igual manera en cada uno de los bloques de cosecha. A travs de la Figura 6 del Apndice se obtienen los resultados para la validacin del mtodo donde se puede apreciar que se presentan los picos caractersticos de estos componentes, dando a entender que el mtodo utilizado fue uno confiable.

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Mediante los resultados presentados en el captulo anterior, para el contenido de vitamina C de los diferentes patrones de chironja evaluados por bloque de cosecha (pginas 51 - 54); se puede estimar un promedio de 105mg de esta vitamina en 8oz del jugo de esta fruta. Segn la tabla 8 del captulo de resultados donde se resumen todos los datos obtenidos en contenido de vitamina C, se puede apreciar una diferencia significativa para el contenido en el patrn de Naronja; esto de igual manera se denota a travs del promedio total de vitamina C en todos los bloques. Segn la figura 9 del captulo anterior se refleja una diferencia de un 16 17 % aproximadamente para el patrn de Naronja, el cual se presenta por debajo del contenido encontrado para los dems patrones evaluados. Mediante esta misma

figura se denotan que letras diferentes indican diferencias significativas, por lo que resume diferencias para tres de los patrones evaluados. Para este estudio comparativo de patrones se realiz un anlisis de varianza; donde se utiliz la prueba de LSD: Fisher con un alfa de 0.05. Mediante este anlisis se comprueba que s existe

diferencia significativa entre el contenido promedio de vitamina C para los diferentes patrones. A travs de la Tabla 2 del Apndice (Prueba LSD: Fisher) se comprueban las diferencias existentes entre patrones. Segn este anlisis se demuestra que el promedio obtenido para el patrn de Naronja es diferente a los promedios en los patrones de Cleopatra, Sun Chu Sha y Sunkie Benecke. De igual manera el que el promedio de Sunkie Benecke se presenta diferente al de Naronja, Cleopatra y Sun Chu Sha. Sin embargo para los promedios encontrados en el patrn de Cleopatra y de Sun Chu Sha no se encontr diferencia significativa. Mediante este anlisis la

hiptesis de investigacin queda aceptada; donde se concluye que s existe diferencia

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significativa entre los promedios obtenidos para al menos tres de los patrones evaluados (Apndice Tabla 2). Adems de evaluarse la variabilidad existente entre los patrones de chironja estudiados; tambin se evalu el factor de bloque, de manera de descartar el que sean heterogneos y aporten otra variable al anlisis. Segn la figura 10 de los resultados obtenidos, los promedios establecidos para la chironja por bloque no demuestran diferencia significativa entre cada uno de los bloques. De igual manera se utiliz el anlisis de varianza con la prueba LSD: Fisher (Apndice Tabla 3), demostrando que existe homogeneidad en el diseo, descartando diferencia significativa entre los bloques. Estos resultados se comprueban mediante la prueba de Bonferroni para un alfa de 0.05 (Apndice Tabla 4). Esta prueba demostr o comprob las conclusiones obtenidas mediante la prueba LSD: Fisher realizada, tanto para las diferencias encontradas por patrones como para comprobar que existe homogeneidad entre los bloques de cosecha. Se utiliz la prueba de Bonferroni para confirmar los resultados obtenidos mediante LSD: Fisher por ser una ms conservadora para anlisis comparativos; esto para disminuir el Error tipo I que se acumula a travs de este tipo de anlisis. La figura 11 del captulo anterior permite una comparacin entre los valores de vitamina C para la china y la toronja, establecidos por el banco de datos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, y los encontrados para la chironja a travs de este estudio. Mediante este grfico se puede determinar que existe un contenido mayor en vitamina C para este hbrido que para la toronja; aunque algo menor que el contenido establecido para la china. Sin embargo puede

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considerarse esta fruta como fuente excelente de vitamina C, ya que en tan solo seis a ocho onzas de su jugo provee la recomendacin de consumo diario de esta vitamina. De acuerdo a la validacin del mtodo o la tcnica utilizada para la cuantificacin de los compuestos de folatos se refleja en promedio un 90% de recuperacin para la muestra con la concentracin de 0.2g/ml y un promedio de 92% de recuperacin para la muestra de 0.3g/ml (Tabla 9 del Captulo 4). Este porcentaje de recuperacin obtenido demuestra que el mtodo de extraccin y el equipo utilizado para la cuantificacin de folatos en la chironja fueron efectivos. Por lo cual puede

descartarse la tcnica utilizada como el factor responsable del no poder cuantificar los folatos en la chironja. Estos porcentajes de folato recuperados se obtienen mediante la comparacin de los cromatogramas obtenidos para las muestras evaluadas con el 5MTHF aadido versus la curva de calibracin realizada para este estndar a diferentes concentraciones (Figuras 12 - 14, Captulo 4). Segn la literatura, adems de tcnicas infructuosas en la deteccin de folatos tambin existen otros factores que interfieren o dificultan esta cuantificacin; esto debido a la alta inestabilidad de esta vitamina y a la forma en que se encuentra adherida a la matriz del alimento. Entre los posibles factores responsables de no cuantificar el folato en la chironja se encuentran: (1) contenido de folato en el alimento; en muestras con bajo contenido la extraccin se hace ms difcil para su deteccin. Segn la literatura el contenido de folato en la toronja es de slo 0.1g/ml, por lo que si este hbrido posee igual caracterstica que la toronja se puede considerar como uno de bajo contenido, dificultando entonces su extraccin. (2) pH del alimento, a pH ms cido ms difcil la cuantificacin, por problemas de extraccin del folato de la matriz del alimento; pH obtenido en la

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chironja fue de 3.8 - 4.0; alimentos ms estables aquellos con pH de 5.5 8.0, (3) antioxidantes utilizados, (4) enzimas utilizadas para la digestin e hidrlisis de la muestra, (5) tiempo y temperatura de procesamiento de las muestras, (6) sensitividad del equipo utilizado para la deteccin de cantidades bajas de folato. Al evaluar cada uno de estos factores se puede determinar que el factor de mayor influencia sea el del pH del alimento, ya que es uno sumamente bajo (3.8 - 4.0). Esto al ser comparados con el pH de los alimentos evaluados por la metodologa utilizada por el Food Standard Agency del USDA, los cuales fluctan entre 5.5 - 7.0. Es el componente de mayor variabilidad al co