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Universidad de Oviedo

Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias

Máster en Biomedicina y Oncología Molecular

Marcadores en cáncer: estrategias

de análisis de expresión múltiple

Ana Cotarelo Fernández

Julio 2016

Trabajo Fin de Máster

MÁSTER EN BIOMEDICINA Y ONCOLOGÍA MOLECULAR | ANA COTARELO FERNÁNDEZ


RESUMEN

La RT-qPCR es, actualmente, la técnica de referencia para el análisis de la expresión

génica, debido a sus múltiples ventajas como la sensibilidad, la rapidez o el amplio rango

de cuantificación. Sin embargo, su elevado coste y la dificultad para realizar reacciones

múltiples suponen importantes inconvenientes. Debido a esto, se ha intentado explorar

la posibilidad de utilizar PCR múltiple a tiempo final combinada con espectrometría de

masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS) y acoplada a electroforesis en gel

(GE), en estudios de expresión génica múltiple.

Para ello, en este trabajo, se ha llevado a cabo la optimización de las condiciones

de RT-PCR para la amplificación múltiple de cuatro genes, tres de ellos relacionados con

la respuesta a tratamientos con cisplatino (BAX, CTR1 y ERCC1), y uno, ACTB, como gen

de referencia. Una vez conseguido esto, se ha aplicado el análisis de la expresión de

dichos genes en las líneas celulares humanas de cáncer de ovario A2780 y A2780cis,

sensible y resistente a cisplatino, respectivamente, en células sin tratar y en células

tratadas con 40 μM de cisplatino, tanto inmediatamente después del tratamiento como

24 horas después de la finalización del mismo.

Los resultados muestran que es posible realizar la separación, detección y

cuantificación de los cuatro fragmentos génicos amplificados mediante GE-ICP-MS, y

que la relación entre cada uno de los genes analizados y el gen de referencia permite

cuantificar las diferencias en la expresión de los tres genes implicados en la respuesta a

cisplatino. Aunque se han encontrado algunas discrepancias en los cambios de expresión

respecto a la información disponible, y aunque serían necesarias más medidas y mejoras

en el método, los resultados obtenidos sugieren que la técnica GE-ICP-MS podría

aplicarse satisfactoriamente al estudio de la expresión génica.


ABREVIATURAS

Ar Argón

ATP7A/B ATPasa transportadora de cobre alfa/beta (ATPase opper transporting

alpha/beta)

BAD Proteína de muerte agonista de Bcl-2 (Bcl-2-antagonist of cell death)

BAX Proteína X asociada a Bcl-2 (Bcl-2-associated X protein)

BCL-2 Proteína 2 de linfoma de células B (B-cell lymphoma 2)

BID Agonista del dominio de muerte que interactúa con BH3 (BH3 interacting

domain death agonist)

BIM Proteína mediadora de muerte celular que interacciona con Bcl-2 (Bcl-2-

interacting mediator of cell death)

cDNA ADN complementario

C Carbono

Ct Ciclo umbral (Cicle threshold)

cDDP cis-Diaminodicloroplatino(II)

CE Electroforesis capilar

Ctr1 Transportador de cobre 1 (Copper transporter receptor 1)

dNTP Desoxirribonucleótido trifosfato

ERCC1 Proteína de reparación por escisión del grupo de complementación cruzada

1 (Excision Repair Cross-Complementing 1)

GE Electroforesis en gel

GSH Glutatión

GST Glutatión-s-transferasa

H Hidrógeno

HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia

ICP-MS Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo

JNK c-Jun N-terminal Kinases

mRNA RNA mensajero

MRP2 Proteína transportadora asociada a la resistencia a múltiples fármacos

(Multidrug Resistance Associated Transporter Protein)

MT Metalotioneína

m/z Masa / Carga


N Nitrógeno

NER Reparación por escisión de nucleótido (Nucleotide Excision Repair)

NSCLC Cáncer pulmonar de células no pequeñas

O Oxígeno

OCT2 Transportador de cationes orgánicos 2 (Organic cation transporter 2)

P Fósforo

pb Pares de bases

POLH Polimerasa η

Pt Platino

RF Radiofrecuencias

RT-qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa reversa

SEM Multiplicador de electrones secundarios

SNP Polimorfismo de nucleótido simple (Single Nucleotide Polymorphism)

SP1 Proteína de especificidad 1 (Specificity protein 1)

TLS Síntesis translesión


1

ÍNDICE

1 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 2

1.1 ICP-MS ................................................................................................................... 4

1.1.1 Cuantificación de ácidos nucleicos mediante ICP-MS .................................... 5

1.1.2 GE-ICP-MS ...................................................................................................... 6

1.2 CISPLATINO ............................................................................................................... 6

1.2.1 Características ............................................................................................... 6

1.2.2 Mecanismo de acción .................................................................................... 7

1.2.3 Resistencias al tratamiento con cisplatino .................................................... 9

2 OBJETIVO ............................................................................................................. 12

3 MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 13

3.1 REACTIVOS ................................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.2 CULTIVO CELULAR ....................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.3 TRATAMIENTO CON CISPLATINO ..................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.4 EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE CDNA ...................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.5 DISEÑO DE CEBADORES ................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.6 PCR A TIEMPO FINAL INDIVIDUAL Y MÚLTIPLE ................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

3.7 ESPECTROMETRÍA DE MASAS CON PLASMA DE ACOPLAMIENTO INDUCTIVO (ICP-MS) .... ¡ERROR!

MARCADOR NO DEFINIDO.

3.8 ANÁLISIS DE LOS DATOS ................................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

4 RESULTADOS ......................................................................................................... 13

4.1 EXTRACCIÓN DE RNA Y SÍNTESIS DE CDNA ...................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

4.2 VERIFICACIÓN DE CEBADORES ........................................ ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

4.3 OPTIMIZACIÓN DE REACCIONES MÚLTIPLES E INDIVIDUALES .. ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

4.4 CUANTIFICACIÓN DE FÓSFORO MEDIANTE GE-ICP-MS ...... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

5 DISCUSIÓN ............................................................................................................ 13

6 CONCLUSIONES ...................................................................................................... 13

7 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................ 14


2

1 INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la técnica más precisa, fiable y rápida disponible para el estudio de

los perfiles de expresión génica es la PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR), que se

ha establecido como método de referencia superando a otros métodos como el Nothern

blot o los microarrays de cDNA (VanGuilder et al. 2008; Derveaux et al. 2010; Kozera &

Rapacz 2013). Ésta técnica permite recoger los datos de la PCR a medida que se van

generando, combinando la amplificación y la detección de los fragmentos génicos en un

solo paso (Wong & Medrano 2005). Antes de realizar la medida de la expresión génica,

se debe copiar el mRNA a cDNA mediante transcripción reversa (RT-qPCR), un paso

crítico para conseguir una buena sensibilidad y precisión en la cuantificación (Kubista

et al. 2006).

La cuantificación en tiempo real es posible gracias a la incorporación de compuestos

fluorescentes que generan una señal que representa la cantidad de producto que se está

formando (Kubista et al. 2006). Durante los primeros ciclos la señal es débil y no se

distingue del fondo, ya que la cantidad de material de partida es pequeña. A medida que

se acumulan los productos, la señal se incrementa exponencialmente. El ciclo en el que

la fluorescencia detectada supera el nivel del fondo se denomina ciclo umbral (cicle

threshold, Ct), y es esta información la que se utiliza en la cuantificación. Llegado un

determinado momento, la señal se satura debido a la escasez de alguno de los

componentes y alcanza una fase de meseta (Kubista et al. 2006; Kozera & Rapacz 2013).

Los compuestos fluorescentes utilizados pueden ser tanto marcadores

inespecíficos como sondas secuencia-específicas. Uno de los más utilizados es el

compuesto intercalante SYBR Green, que se une al DNA de doble cadena de forma

inespecífica (VanGuilder et al. 2008; Kozera & Rapacz 2013). Estos marcadores no

emiten fluorescencia cuando están libres en solución, pero si lo hacen cuando se unen

al DNA (Kubista et al. 2006). Otro tipo de sondas más avanzadas consisten en

oligonucleótidos que generan fluorescencia cuando hibridan con la región

complementaria en el DNA. Estos incluyen sondas de hibridación como las TaqMan, o

sondas estructurales como las molecular beacons, y permiten incrementar la

especificidad de la reacción (Kozera & Rapacz 2013).


3

Esta técnica posee múltiples ventajas como son la sensibilidad, la detección en

tiempo real del progreso de la reacción, el amplio rango de cuantificación, la rapidez del

análisis y que no requiere manipulación post-amplificación (Wong & Medrano 2005;

Derveaux et al. 2010; Kozera & Rapacz 2013). Además, cuando la expresión de un gen

es muy pequeña, la qPCR es la única técnica hasta el momento que permite detectar el

bajo número de copias de mRNA (VanGuilder et al. 2008; Kozera & Rapacz 2013).

La principal desventaja de la qPCR es el elevado coste de los equipos y reactivos.

(Wong & Medrano 2005). El compuesto fluorescente más utilizado debido a su menor

coste, SYBR Green, tiene una serie de inconvenientes ya que su unión al DNA de doble

cadena puede llevar a la generación de fluorescencia inespecífica, debido a la formación

de dímeros de cebadores y de productos de PCR no deseados (Soltany-Rezaee-Rad et al.

2015). Además, no admite la realización de reacciones múltiples que permitan

cuantificar varios genes en una única reacción, lo que sí se podría llevar a cabo con las

sondas TaqMan, utilizando un fluoróforo diferente para cada sonda, pero con un coste

muy considerable (Wong & Medrano 2005; Kubista et al. 2006; VanGuilder et al. 2008).

La PCR múltiple consiste en la amplificación simultánea de varias dianas de DNA o

cDNA en una misma reacción, lo que permite un ahorro tanto de tiempo como de

dinero, así como un uso más eficiente de las muestras. Mientras que la PCR a tiempo

final puede abarcar un número muy elevado de amplicones, esa capacidad en qPCR

basada en sondas se limita a un número restringido de reacciones. Esto se debe, por una

parte, a que la mayoría de termocicladores utilizados en qPCR sólo pueden detectar un

número máximo de cuatro fluoróforos diferentes, y por otra, a que la combinación de

cebadores y sondas para reacciones múltiples requiere una gran optimización (Persson

et al. 2005; Zhong et al. 2011).

Por ello, a pesar del uso extendido de la qPCR, se han buscado métodos alternativos

para estudios de cuantificación múltiple. Recientemente, se ha demostrado que la PCR

clásica o a tiempo final combinada con espectrometría de masas con plasma de

acoplamiento inductivo (ICP-MS) y acoplado a una electroforesis en gel (GE) puede tener

utilidad en estudios de cuantificación, en este caso del número de copias génicas

(Iglesias et al. 2014).


4

1.1 ICP-MS

La espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas analíticas más utilizadas en

la actualidad para el estudio de macromoléculas biológicas, debido a su capacidad de

proporcionar información cualitativa y cuantitativa de la composición y estructura de las

mismas con gran sensibilidad y selectividad. Es una técnica basada en la formación de

iones gaseosos a partir de la muestra, y su posterior separación, detección y medida en

función de su relación masa/carga (m/z). Los iones generados pueden ser especies

moleculares, denominándose MS molecular; o atómicas, en cuyo caso se conoce como

MS elemental (López 2015).

La ICP-MS es la espectrometría de masas elemental que utiliza como fuente de

ionización un plasma de acoplamiento inductivo (Inductively Coupled Plasma, ICP), y es

la técnica más utilizada para la determinación del contenido total de elementos traza y

ultratraza en muestras biológicas. Esto es debido a una serie de características como son

su gran sensibilidad (límites de detección de 0,001-0,1 ng·L-1); gran especificidad

elemental e isotópica; capacidad para introducir de forma continua muestras gaseosas

o líquidas; amplios intervalos lineales y capacidad multi-elemental y multi-isotópica

(Łobiński et al. 2006; García 2011; Pröfrock & Prange 2012; López 2015).

En esta técnica, la muestra líquida se introduce en un nebulizador donde se

transforma en un aerosol líquido, que es arrastrado al interior del plasma mediante un

flujo de gas portador (Ar), como se puede ver en la Figura 1. El plasma se genera en una

antorcha de cuarzo que consiste en tres tubos concéntricos a través de los cuales fluyen

corrientes de argón, mediante la aplicación de energía de radiofrecuencias (RF). Por el

tubo central de la antorcha penetra el aerosol de la muestra, que, debido a las altas

temperaturas alcanzadas por el plasma (5000-10000 K), es desolvatado, vaporizado,

atomizado e ionizado, formándose principalmente iones monoatómicos y

monopositivos (Montaser et al. 1998; García 2011; López 2015).

A continuación, es necesario que esos iones sean transferidos desde el plasma al

analizador de masas. Este proceso se realiza mediante una interfase formada por dos

conos metálicos, generalmente de níquel, que se encuentra a vacío moderado (~1-2

Torr). El primero de estos conos de extracción se denomina sampler y el segundo cono


5

skimmer. De ahí pasan a un sistema de lentes electrostáticas (zona de alto vacío), que

enfoca el haz de iones hacia un analizador de masas, que puede ser de varios tipos,

aunque generalmente es de tipo cuadrupolo, y en él tiene lugar la separación de los

iones en función de su relación m/z. A la salida del analizador de masas, los iones chocan

con la superficie del detector, normalmente un multiplicador de electrones secundarios

(SEM), en el que cada ion genera un pulso eléctrico (García 2011; López 2015).

Figura 1. Esquema de una fuente de plasma ICP. Tomado de (García 2011).

1.1.1 Cuantificación de ácidos nucleicos mediante ICP-MS

En los últimos años, se ha empleado esta técnica para llevar a cabo estudios de

cuantificación de biomoléculas que contengan, o tengan asociado, uno o varios

heteroátomos, es decir, cualquier elemento distinto de C, O, H y N (García 2011;

Pröfrock & Prange 2012; López 2015). El contenido de fósforo y azufre, ambos

susceptibles a ser medidos mediante ICP-MS, sirve para detectar biomoléculas que

contengan ácidos nucleicos y aminoácidos, respectivamente. Además, la medida del

contenido en fósforo es la técnica más sensible para la determinación de biomoléculas

fosforiladas, como DNA, RNA y proteínas (Leclerc et al. 2013). El fósforo puede ser

medido mediante ICP-MS y está presente en una estequiometría fija y conocida; sin

embargo, la medida de este elemento cuenta con una serie de dificultades. Es un

elemento que se ioniza mal en el plasma y que posee numerosas interferencias

poliatómicas, que están causadas por iones moleculares que tienen los mismos valores

de m/z y están presentes en el plasma de acoplamiento inductivo. Estas interferencias

se pueden solucionar utilizando equipos de alta resolución o doble enfoque, por lo que


6

la medida del fósforo total se está realizando cada vez más para la cuantificación de

biomoléculas (Becker et al. 2003; López 2015).

La cuantificación de la cantidad de DNA presente en una muestra mediante ICP-MS

se llevó a cabo por primera vez en 2003 (Becker et al. 2003), y, más recientemente, se

ha aplicado ésta técnica para la cuantificación de Legionella (Leclerc et al. 2013).

También se ha utilizado para la cuantificación de RNA (Fujii et al. 2014), demostrando

que es un método de gran exactitud y precisión para la determinación de fósforo en

pequeñas cantidades en muestras biológicas.

1.1.2 GE-ICP-MS

El ICP-MS posee unas características que lo hacen adecuado para su acoplamiento

a técnicas de separación como HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia) o CE

(electroforesis capilar), lo que permite llevar a cabo de forma simultánea la separación,

detección y cuantificación de las biomoléculas (Pröfrock & Prange 2012; López 2015).

Además, en algunos estudios se ha utilizado el acoplamiento de la electroforesis en

gel en tubo con la detección por ICP-MS (GE-ICP-MS). Esta técnica fue desarrollada por

primera vez para la determinación de fragmentos de DNA de doble cadena

comprendidos entre los 100 y los 1000 pb mediante la medida de fósforo (Brüchert &

Bettmer 2005). Desde entonces, se ha utilizado para diferentes aplicaciones como la

determinación de hierro en metaloproteínas, la determinación del grado de

fosforilación de la caseína, la detección de fósforo en fosfoproteínas o el estudio de las

interacciones cisplatino-oligonucleótido, entre otras (Haider et al. 2011).

1.2 CISPLATINO

1.2.1 Características

El cisplatino (cis-diaminodicloroplatino (II), cDDP) ha constituido durante las cuatro

últimas décadas el principal tratamiento en determinados tumores sólidos, y es un

componente esencial en quimioterapias tanto curativas como paliativas (Kilari et al.

2016). Se utiliza frente a una gran variedad de tumores que incluyen el de testículo,

ovario, vejiga, células pequeñas de pulmón (NSCLC) y cabeza y cuello, entre otros

(Amable 2016; Kilari et al. 2016). Este compuesto fue descrito por primera vez en 1845,


7

pero sus propiedades anticancerígenas no fueron descubiertas hasta 1964 (Rosenberg

et al. 1965). Los ensayos clínicos comenzaron en 1971, y fue aprobado por la FDA en

1978 con el nombre de Platinol (Reedijk 2003).

El cisplatino es un agente basado en platino que entra en las células mediante

difusión pasiva o por transporte activo a través del transportador de cobre CTR1 o del

transportador de cationes OCT2. Una vez en el interior se une al DNA y produce enlaces

cruzados intra e intercatenarios, que interfieren con la división celular. Estas lesiones en

el DNA impiden que tenga lugar la correcta transcripción y replicación del mismo, lo que

provoca la apoptosis de la célula (Roos & Kaina 2013; Kilari et al. 2016).

La estructura del cisplatino, a diferencia de la de otros fármacos antineoplásicos, es

muy simple. Se trata de una molécula inorgánica con un átomo central de platino (II),

unido a dos átomos de cloro y dos moléculas de amoniaco en posición cis. Las uniones

con los ligandos cloruro, en medio acuoso y bajo determinadas condiciones de pH y

temperatura, son extremadamente lábiles, por lo que se producen reacciones de

hidrólisis con formación de derivados acuo (hidroxi). Estos complejos son muy reactivos

y tienen una fuerte tendencia a sustituir las moléculas de agua por otros ligandos

nucleofílicos con átomos de azufre o nitrógeno donadores de electrones, por los que el

Pt(II) tiene gran afinidad (Reedijk 2003; García 2011).

1.2.2 Mecanismo de acción

En la sangre, el cisplatino está protegido por la alta concentración de iones cloruro,

lo que impide que tenga lugar su hidrólisis y permite que alcance la membrana externa

de las células en su forma neutra. Sin embargo, una vez en el interior celular la

concentración de cloruro es mucho menor, por lo que el cisplatino sufre hidrólisis

perdiendo un ligando de cloruro y formando principalmente un derivado

monoclorohidratado ([Pt(NH3)2Cl(H2O)]+), que puede reaccionar con el DNA y con otras

moléculas en la célula (Jamieson & Lippard 1999; Reedijk 2003). La unión se da

preferentemente con el nitrógeno en posición 7 (N7) de las bases púricas, especialmente

de la guanina, siendo desplazada la molécula de agua y formando así un aducto

monofuncional (Figura 2) (Eastman 1983; Jamieson & Lippard 1999). La pérdida del

segundo ligando de cloruro mediante hidrólisis permite la formación de aductos


8

bifuncionales, mediante una nueva unión a N7 de una guanina o adenina adyacente, o

bien de una guanina no adyacente. Estos aductos bifuncionales pueden ser

intracatenarios, cuando se dan entre las bases de una misma cadena de DNA, o

intercatenarios, cuando tienen lugar entre bases de distinta cadena (Eastman 1987;

Jamieson & Lippard 1999).

Figura 2. Aductos inducidos por el cisplatino en el DNA: monofuncionales de guanina, enlaces cruzados intracatenarios G-G, G-A o G-X-G, y enlaces cruzados intercatenarios G-G. Todos ellos pueden llevar a un bloqueo en la replicación o en la transcripción del DNA que finalmente desencadene la apoptosis celular. Modificado de Roos & Kaina (2013).

Los principales aductos que se forman son los enlaces cruzados intracatenarios

guanina-guanina, con una proporción de alrededor del 65%, mientras que los aductos

guanina-adenina suponen un 25%; menos frecuentes son los aductos intracatenarios

entre guaninas no adyacentes y los intercatenarios guanina-guanina, que constituyen

un 5-10%, y los aductos monofuncionales, que suponen aproximadamente el 2% del

total (Kartalou & Essigmann 2001b).

Los aductos formados provocan una modificación de la estructura tridimensional

del DNA, lo que impide que tenga lugar su replicación y transcripción. Si la cantidad de


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lesiones es limitada, pueden ser reconocidas y eliminadas correctamente por varios

sistemas de reparación, gracias a una detención temporal del ciclo celular. Sin embargo,

cuando el daño inducido en el DNA es irreparable, esta detención se vuelve permanente

y las células entran un proceso de muerte celular, en la mayor parte de los casos

apoptosis por vía mitocondrial (Galluzzi et al. 2014).

1.2.3 Resistencias al tratamiento con cisplatino

Existen dos problemas principales asociados al uso del cisplatino en la clínica: la

toxicidad y la resistencia. Este compuesto tiene una serie de toxicidades asociadas, como

daño renal, sordera o neuropatía periférica (Amable 2016). Por otra parte, la utilidad del

cisplatino está limitada por la aparición de resistencia tanto intrínseca como adquirida

(Amable 2016; Kilari et al. 2016). Esta resistencia es compleja y está regulada por una

cascada de eventos que interfieren con alguno de los pasos de su acción citotóxica,

desde la entrada del fármaco en la célula hasta las etapas finales de apoptosis, tal y

como se representa en la Figura 3 (Kilari et al. 2016).

Figura 3. Diferentes mecanismos relacionados con la resistencia al cisplatino. El cisplatino atraviesa la membrana por difusión pasiva o a través de transportadores transmembrana (CTR1, CTR2, OCT2). Una vez en la célula, se puede unir al DNA causando daños que son reparados por el sistema NER, en el cual interviene ERCC1. También se inactiva uniéndose a glutatión (GSH) mediante glutatión-s-transferasas (GST), o a metalotioneínas (MT). Por último, puede ser exportado a través de transportadores como ATP7A y ATP7B o MRP2. Modificado de Amable (2016).


10

Así, los siguientes mecanismos están implicados en el desarrollo de dicha

resistencia: reducción de la entrada de cisplatino en la célula, aumento de su excreción,

incremento de las vías de reparación del DNA y de tolerancia, aumento de la inactivación

intracelular del cisplatino y desregulación de la apoptosis (Köberle et al. 2010; Kilari

et al. 2016).

Dentro de los mecanismos de resistencia, uno de ellos está relacionado con los

diferentes niveles de expresión de los mecanismos que controlan la concentración

intracelular de cisplatino, que determina la cantidad de lesiones formadas y por lo tanto

la efectividad de la activación de la apoptosis (Roos & Kaina 2013). Estos cambios

pueden ser debidos a una disminución del flujo de entrada, en el que intervienen

transportadores como CTR1 y OCT2, o a un aumento del flujo de salida, debido a la

sobreexpresión de otros transportadores como MRP2 o ATP7A y ATP7B (Kilari et al.

2016).

CTR1 es una proteína de 190 aminoácidos con tres dominios transmembrana, y es

el transportador de platino más estudiado (Kilari et al. 2016). Diferentes estudios in vitro

han demostrado que la disminución en la expresión de CTR1 conlleva un descenso en

los niveles de platino intracelulares y una mayor resistencia, mientras que una mayor

expresión se asocia a mayor sensibilidad al cisplatino (Kilari et al. 2016). Se han realizado

también estudios en la clínica sobre el papel de CTR1 en la resistencia al cisplatino, en

los que se han evaluado dos tipos de cáncer, el de ovario y el de pulmón. En pacientes

con NSCLC, una expresión indetectable de CTR1 se corresponde con una reducción del

platino intracelular y de la respuesta tumoral (Kim et al. 2014), mientras que en

pacientes con cáncer de ovario, altos niveles de expresión del transportador se

correlacionan con un aumento de la supervivencia libre de enfermedad (Ishida et al.

2010).

La expresión de CTR1 está regulada tanto a nivel transcripcional como post-

transcripcional. El factor de transcripción SP1 (Specificity protein 1) funciona como un

sensor de cobre que regula la expresión de CTR1 en respuesta a variaciones en la

concentración de cobre. Además, en varias líneas celulares la exposición a platino lleva

consigo una disminución de la expresión de CTR1 (Kilari et al. 2016). Por todo ello, CTR1


11

tiene gran potencial para ser utilizado como biomarcador predictivo de la sensibilidad al

cisplatino, y además la modulación de su expresión puede constituir una nueva

estrategia terapéutica para aumentar la eficacia de la quimioterapia con agentes de

platino (Kim et al. 2014; Kilari et al. 2016).

En cuanto a la reparación del DNA, los aductos intracatenarios formados debido a

la acción del cisplatino son reconocidos y reparados principalmente por el sistema NER

(Nucleotide Excision Repair). Algunos daños no son reparados, pero las células pueden

tolerarlos mediante el mecanismo de síntesis translesión (TLS), llevado a cabo por un

grupo de DNA polimerasas especializadas, como pol η (POLH), la cual se ha visto en

algunos casos relacionada con la resistencia a cisplatino (Köberle et al. 2010; Amable

2016). Por su parte, el sistema NER implica un gran número de proteínas, que se

encargan de reconocer el daño en el DNA, realizar una incisión a ambos lados de la

lesión, eliminar un oligonucleótido con el daño, sintetizar nuevo DNA copiando la

cadena complementaria para reemplazar el fragmento eliminado y volver a ligar el

fragmento reparado (Sancar 1996).

Concretamente, la proteína ERCC1 (Excision Repair Cross-Complementing 1) forma

un complejo con XPF (ERCC1-XPF) que se encarga de realizar la incisión en 5’ para

eliminar el daño del DNA (Sancar 1996). Existe una correlación entre la expresión de

ERCC1 y la sensibilidad al cisplatino, ya que las células con sistema NER defectivo debido

a mutaciones en este gen son hipersensibles al cisplatino, mientras que las líneas

celulares resistentes expresan más ERCC1 en comparación con las sensibles (Roos &

Kaina 2013; Amable 2016). Las células mutantes para ERCC1 muestran altos niveles de

apoptosis tras el tratamiento con cisplatino, lo que evidencia que la falta de reparación

de las lesiones inducidas por el mismo lleva a muerte celular (Roos & Kaina 2013). Se

han encontrado niveles elevados de mRNA de ERCC1 en pacientes con formas

resistentes de cáncer para una gran variedad de tumores diferentes (Amable 2016).

Por otra parte, la inactivación intracelular de cisplatino provoca la incapacidad del

cisplatino para unirse al DNA, por lo que el daño es menor y las células cancerígenas

sobreviven. La principal forma de inactivación es la conjugación del cisplatino con

glutatión (GSH), lo que lleva a su expulsión de la célula a través de transportadores, o


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bien mediante una segunda forma de inactivación que consiste en su unión a

metalotioneínas (MTs) (Amable 2016). En líneas celulares de cáncer de ovario, cuello de

útero, pulmón, vejiga y embrionario una mayor concentración de GSH se correlaciona

con resistencia a cisplatino (Köberle et al. 2010).

Por último, cambios en las vías de apoptosis también contribuyen a la resistencia

al cisplatino. La apoptosis inducida por el cisplatino puede ocurrir a través de la vía

extrínseca, o a través de la vía intrínseca o de la mitocondria, mediada por proteínas

como las de la vía de señalización de JNK, p53 y proteínas anti- o pro-apoptóticas de la

familia Bcl-2 (Köberle et al. 2010). Las alteraciones en la expresión de reguladores de

apoptosis puede modificar la sensibilidad de las células a la apoptosis por el tratamiento

con cisplatino. Las células que expresen mayores niveles de un inhibidor de apoptosis o

menores de un promotor de apoptosis podrían requerir mayores niveles de daño para

inducir muerte celular (Kartalou & Essigmann 2001a).

La familia Bcl-2 incluye proteínas pro-apoptoticas como BAX (Bcl-2-associated X

protein), BIM (Bcl-2-interacting mediator of cell death), BAD (Bcl-2 antagonist of cell

death) o BID (BH3 interacting domain death agonist). Los estímulos apoptóticos llevan

a la translocación de BAX y BAD a la mitocondria, formando poros que aumentan la

permeabilidad de la membrana y causan la liberación de citocromo c, lo que inicia la

cascada de caspasas que finalmente conduce a la muerte celular (Biagosch et al. 2010).

Debido a sus efectos proapoptóticos, una menor expresión de estas proteínas podría

causar resistencia a cisplatino, lo que se ha visto tanto en líneas celulares de cáncer de

pulmón de células pequeñas como de cáncer de ovario resistentes a cisplatino (Kartalou

& Essigmann 2001a; Biagosch et al. 2010).

A partir de todo lo mencionado hasta el momento, sería interesante desarrollar una

metodología que permita estudiar expresión génica en reacciones múltiples, así como

poner a punto esta técnica para estudiar la expresión de varios genes implicados en la

resistencia a cisplatino.

2 OBJETIVO


13

3 MATERIAL Y MÉTODOS

4 RESULTADOS

5 DISCUSIÓN

6 CONCLUSIONES


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