UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA
Trabajo de titulación previo a obtener el grado académico de
Bióloga
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS
EXTRACTOS DE Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium
huasango R. Spruce y Croton ferrugineus Kunth
AUTOR: VIVIANA CAROLINA VALDEZ MURILLO
TUTOR: PhD. EVER MORALES AVENDAÑO
GUAYAQUIL-ECUADOR
2019
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS
DE Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce y
Croton ferrugineus Kunth
Autora: Viviana Valdez Murillo
Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño
RESUMEN
En el presente estudio, se realizó el tamizaje fitoquímico, cuantificación de flavonoides y fenoles totales, la evaluación de la actividad antibacteriana contra tres bacterias Gram Positivas (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes) y tres Gram negativas (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) y la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos etanólicos obtenidos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus. Para el análisis de las muestras se realizó el tamizaje fitoquímico por el método de Domínguez, la cuantificación de flavonoides por el método colorimétrico cloruro de aluminio, la cuantificación de fenoles totales por el método Folin-Ciocalteu, actividad antibacteriana por ensayos de difusión por disco y actividad antioxidante mediante la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). En el tamizaje fitoquímico los flavonoides y taninos presentaron mayores contenidos, mientras que los alcaloides, quinonas, antraquinonas, esteroides y saponinas estuvieron presentes en menor proporción. El contenido de flavonoides varió de 100,95 ± 1,73 a 995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto en H. escobariae y L. huasango y el contenido de fenoles varió de 10,17 ± 0,22 a 314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto en Croton ferrugineus y L. huasango el cual también obtuvo la mejor actividad antibacteriana frente a las cepas evaluadas con CMI que varían de 2.5 a 5 mg/mL y la mejor actividad antioxidante con IC50 de 0,1 mg/mL y de 0,7 mg/mL para C. ferrugineus con una diferencia significativa p<0.05. Estos resultados son los primeros reportados los que servirán como línea base para estudios posteriores.
Palabras claves: antibacteriano, antioxidante, Croton ferrugineus, fenoles, flavonoides, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, tamizaje fitoquímico.
ANEXO 13
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN
ANTIBACTERIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ETHANOLIC
EXTRACTS OF Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R.
Spruce and Croton ferrugineus Kunth
Author: Viviana Valdez Murillo
Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño
ABSTRACT
This study has done phytochemical screening, quantification of flavonoids and total phenols, evaluation of antibacterial activity against three Gram positive bacterias (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes), three Gram negatives (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) and the evaluation antioxidant activity of ethanolic extracts of Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango and Croton ferrugineus. The sample analysis employed phytochemical screening by Dominguez’s method, quantification of flavonoids by the aluminum chloride colorimetric method, quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteu method, antibacterial activity by disk diffusion assay and antioxidant activity by DPPH method. In the phytochemical screening, the flavonoids and tannins were higher proportion, while alkaloids, quinones, anthraquinones, steroids and saponins were present in lower proportion. The flavonoid content varied in a range of 100.95 ± 1.73 and 995.42 ± 3.16 mg CE / g extract, in H. escobariae and L. huasango and the total phenol content varied in a range of 10.17 ± 0.22 a 314.72 ± 1.91 mg GAE/ g extract in C. ferrugineus and L. huasango, which also obtained the best antibacterial activity against all the strains evaluated with MIC that varied of 2.5 - 5 mg/mL and also obtained the best antioxidant activity with a IC50 of 0.1 mg/mL and 0.7 mg/mL for Croton ferrugineus with a significant difference p<0.05. These results are the first reported and will serve as a baseline for further studies.
Key words: antibacterial, antioxidant, Croton ferrugineus, flavonoids, Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango, phenols, phytochemical screening.
ANEXO 14
© Derechos de Autor
Viviana Carolina Valdez Murillo
2019
i
DEDICATORIA
A Dios por haberme permito llegar hasta este momento tan especial e
importante en mi vida profesional. A mis padres, hermanos, tíos y abuelos por
haberme brindado todo su cariño y apoyo incondicional. A mi papá German que
a pesar de la distancia física, sé que está muy orgulloso de mí en estos
momentos porque logré lo que el tanto anhelaba.
ii
AGRADECIMIENTOS
A Dios porque sin él nada habría sido posible. A mi familia porque siempre han
estado conmigo en todo momento importante en mi vida. A los biólogos Shirley,
Leonardo, Xavier, Jaime, a mi tutor Ever y a mi amigo Jhon por haberme
enseñado con mucha paciencia y permitido elaborar mi trabajo de titulación.
iii
ÍNDICE DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
CAPÍTULO I ....................................................................................................... 4
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................... 4
1.2 OBJETIVOS .............................................................................................. 6
1.2.1 Objetivo General ................................................................................. 6
1.2.2 Objetivos Específicos .......................................................................... 6
1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA .......................................................... 7
1.4 HIPÓTESIS ............................................................................................... 9
CAPÍTULO II .................................................................................................... 10
2.1 ANTECEDENTES ................................................................................... 10
2.2 MARCO TEÓRICO ................................................................................. 14
2.2.1 Hibiscus escobariae .......................................................................... 14
Taxonomía.............................................................................................. 14
Ecología ................................................................................................. 14
Descripción botánica .............................................................................. 15
2.2.2 Loxopterygium huasango .................................................................. 15
Taxonomía.............................................................................................. 15
Ecología ................................................................................................. 15
Descripción botánica .............................................................................. 16
2.3.3 Croton ferrugineus ............................................................................ 16
Taxonomía.............................................................................................. 16
Ecología ................................................................................................. 17
Descripción botánica .............................................................................. 17
2.2.4 Metabolitos secundarios ................................................................... 17
2.2.5 Tamizaje fitoquímico ......................................................................... 19
Alcaloides ............................................................................................... 19
iv
Flavonoides ............................................................................................ 20
Taninos ................................................................................................... 21
Quinonas ................................................................................................ 23
Triterpenoides y esteroides .................................................................... 25
Saponinas .............................................................................................. 26
2.2.6 Cuantificación de flavonoides ........................................................... 27
2.2.7 Cuantificación de fenoles .................................................................. 27
2.2.8 Actividad antioxidante ....................................................................... 28
Metabolitos secundarios como agentes antioxidantes ........................... 28
2.2.9 Actividad antibacteriana .................................................................... 29
Metabolitos secundarios como agentes antibacterianos ........................ 30
CAPÍTULO III ................................................................................................... 31
3.1 METODOLOGÍA ..................................................................................... 31
3.1.1 Material biológico .............................................................................. 31
3.1.2 Obtención del extracto ...................................................................... 31
3.1.3 Tamizaje fitoquímico ......................................................................... 32
3.1.3.1 Determinación de alcaloides. ..................................................... 32
3.1.3.2 Determinación de flavonoides .................................................... 32
3.1.3.3 Determinación de taninos. .......................................................... 32
3.1.3.4 Determinación de quinonas y antraquinonas. ............................. 33
3.1.3.5 Determinación de esteroides y triterpenos. ................................ 33
3.1.3.6 Determinación de saponinas. ..................................................... 33
3.1.4 Cuantificación de flavonoides y ácidos fenólicos totales ...................... 34
3.1.4.1 Cuantificación de flavonoides totales. ............................................ 34
3.1.4.2 Cuantificación de ácidos fenólicos totales. .................................... 35
3.1.5 Actividad antioxidante ....................................................................... 35
3.1.5.1 Preparación de soluciones ......................................................... 35
v
3.1.5.2 Procedimiento ............................................................................. 36
3.1.5.3 Procedimiento para diluciones .................................................... 36
3.1.6 Actividad antibacteriana .................................................................... 37
3.1.6.1 Cultivo de microorganismos ....................................................... 37
3.1.6.2 Preparación y suspensión del inóculo ........................................ 37
3.1.6.3 Siembra de la muestra ................................................................ 37
3.1.6.4 Medición de la zona del halo de inhibición ................................. 38
3.1.7 Análisis estadístico ........................................................................... 38
CAPÍTULO IV ................................................................................................... 39
4.1 RESULTADOS ........................................................................................ 39
4.1.1 Tamizaje fitoquímico ......................................................................... 39
4.1.1.1 Hibiscus escobariae.................................................................... 39
4.1.1.2 Loxopterygium huasango ........................................................... 40
4.1.1.3 Croton ferrugineus ...................................................................... 41
4.1.2 Cuantificación de flavonoides ........................................................... 42
4.1.3 Cuantificación de fenoles .................................................................. 43
4.1.4 Actividad antioxidante ....................................................................... 44
4.1.5 Actividad antibacteriana .................................................................... 46
4.1.6 Análisis estadístico ........................................................................... 48
DISCUSIÓN ..................................................................................................... 49
CONCLUSIONES ............................................................................................. 53
RECOMENDACIONES .................................................................................... 54
REFERENCIAS ................................................................................................ 55
ANEXOS .......................................................................................................... 67
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de
Hibiscus escobariae ......................................................................................... 39
Tabla 2: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas
Loxopterygium huasango ................................................................................. 40
Tabla 3: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de Croton
ferrugineus ....................................................................................................... 41
Tabla 4: Contenido total de flavonoides ........................................................... 42
Tabla 5: Contenido total de fenoles ................................................................. 43
Tabla 6: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae
en bacterias Gram positivas ............................................................................. 46
Tabla 7: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae
en bacterias Gram negativas ............................................................................ 46
Tabla 8: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium
huasango en bacterias Gram positivas ............................................................ 47
Tabla 9: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium
huasango en bacterias Gram negativas ........................................................... 47
Tabla 10: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus
en bacterias Gram positivas ............................................................................. 48
Tabla 11: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus
en bacterias Gram negativas ............................................................................ 48
Tabla 12: Actividad antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de tres
especies de plantas del Ecuador ...................................................................... 44
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Hibiscus escobariae ......................................................................... 14
Figura 2: Loxopterygium huasango ................................................................. 15
Figura 3: Croton ferrugineus............................................................................ 16
Figura 4: Elementos del metabolismo del carbono en relación con las rutas de
síntesis de metabolitos secundarios ................................................................. 18
Figura 5: Alcaloides representativos ............................................................... 20
Figura 6: Tipos de flavonoides ........................................................................ 21
Figura 7: Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides ..... 22
Figura 8: Estructura química de compuestos polifenólicos de tipo flavonoide 23
Figura 9: Tipos de quinonas ............................................................................ 24
Figura 10: Molécula de escualeno y sus derivados triterpenos cíclicos
estigmasterol y sitosterol .................................................................................. 26
Figura 11: Estructura química de las saponinas .............................................. 26
viii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Curva de calibración usando quercetina como estándar ................ 42
Gráfico 2: Curva de calibración usando ácido gálico como estándar .............. 43
Gráfico 3: Actividad antioxidante de Loxopterygium huasango ....................... 44
Gráfico 4: Actividad antioxidante de Croton ferrugineus ................................. 45
Gráfico 5: Comparación del porcentaje de inhibición de radical DPPH de las
especies evaluadas frente al ácido ascórbico .................................................. 45
ix
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1: Pruebas de alcaloides ...................................................................... 67
Anexo 2: Prueba Shinoda para flavonoides .................................................... 67
Anexo 3: Prueba de Hidróxido de sodio para flavonoides ............................... 67
Anexo 4: Prueba del cloruro férrico para taninos ............................................ 68
Anexo 5: Prueba Salkowski para esteroles y triterpenos ................................ 68
Anexo 6: Prueba Liebermann-Bouchardat para esteroles y triterpenos .......... 68
Anexo 7: Prueba Borntrager para quinonas y antraquinonas .......................... 69
Anexo 8: Prueba del ácido sulfúrico para quinonas y antraquinonas .............. 69
Anexo 9: Prueba de espuma para saponinas.................................................. 69
Anexo 10: Curva de cuantificación de flavonoides .......................................... 70
Anexo 11: Prueba para la cuantificación de flavonoides ................................. 70
Anexo 12: Prueba de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles .......... 70
Anexo 13: Ensayo del radical DPPH para actividad antioxidante .................... 71
Anexo 14: Actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae ........................... 71
Anexo 15: Actividad antibacteriana de Loxopterygium huasango ................... 72
Anexo 16: Actividad antibacteriana de Croton ferrugineus en Escherichia coli 72
x
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE
Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R. Spruce Y Croton
ferrugineus Kunth
Autor: Viviana Valdez Murillo
Tutor: PhD. Ever Morales Avendaño
RESUMEN
En el presente estudio, se realizó el tamizaje fitoquímico, cuantificación de flavonoides y fenoles
totales, la evaluación de la actividad antibacteriana contra tres bacterias Gram Positivas
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes) y tres Gram negativas
(Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) y la evaluación de la
actividad antioxidante de los extractos etanólicos obtenidos de hojas de Hibiscus escobariae,
Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus. Para el análisis de las muestras se realizó el
tamizaje fitoquímico por el método de Domínguez, la cuantificación de flavonoides por el método
colorimétrico cloruro de aluminio, la cuantificación de fenoles totales por el método Folin-
Ciocalteu, actividad antibacteriana por ensayos de difusión por disco y actividad antioxidante
mediante la técnica 2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo (DPPH). En el tamizaje fitoquímico los flavonoides
y taninos presentaron mayores contenidos, mientras que los alcaloides, quinonas,
antraquinonas, esteroides y saponinas estuvieron presentes en menor proporción. El contenido
de flavonoides varió de 100,95 ± 1,73 a 995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto en H. escobariae y L.
huasango y el contenido de fenoles varió de 10,17 ± 0,22 a 314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto
en Croton ferrugineus y L. huasango el cual también obtuvo la mejor actividad antibacteriana
frente a las cepas evaluadas con CMI que varían de 2.5 a 5 mg/mL y la mejor actividad
antioxidante con IC50 de 0,1 mg/mL y de 0,7 mg/mL para C. ferrugineus con una diferencia
significativa p<0.05. Estos resultados son los primeros reportados los que servirán como línea
base para estudios posteriores.
Palabras claves: antibacteriano, antioxidante, Croton ferrugineus, fenoles, flavonoides, Hibiscus
escobariae, Loxopterygium huasango, tamizaje fitoquímico.
xi
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
CARRERA DE BIOLOGÍA UNIDAD DE TITULACIÓN
ANTIBACTERIAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITIES OF ETHANOLIC
EXTRACTS OF Hibiscus escobariae Fryxell, Loxopterygium huasango R.
Spruce AND Croton ferrugineus Kunth
Author: Viviana Valdez Murillo
Advisor: PhD. Ever Morales Avendaño
ABSTRACT
This study has done phytochemical screening, quantification of flavonoids and total phenols,
evaluation of antibacterial activity against three Gram positive bacterias (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes), three Gram negatives (Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus) and the evaluation antioxidant activity of ethanolic extracts
of Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango and Croton ferrugineus. The sample analysis
employed phytochemical screening by Dominguez’s method, quantification of flavonoids by the
aluminum chloride colorimetric method, quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteu
method, antibacterial activity by disk diffusion assay and antioxidant activity by DPPH method. In
the phytochemical screening, the flavonoids and tannins were higher proportion, while alkaloids,
quinones, anthraquinones, steroids and saponins were present in lower proportion. The flavonoid
content varied in a range of 100.95 ± 1.73 and 995.42 ± 3.16 mg CE / g extract, in H. escobariae
and L. huasango and the total phenol content varied in a range of 10.17 ± 0.22 a 314.72 ± 1.91
mg GAE/ g extract in C. ferrugineus and L. huasango, which also obtained the best antibacterial
activity against all the strains evaluated with MIC that varied of 2.5 - 5 mg/mL and also obtained
the best antioxidant activity with a IC50 of 0.1 mg/mL and 0.7 mg/mL for Croton ferrugineus with
a significant difference p<0.05. These results are the first reported and will serve as a baseline
for further studies.
Key words: antibacterial, antioxidant, Croton ferrugineus, flavonoids, Hibiscus escobariae,
Loxopterygium huasango, phenols, phytochemical screening.
1
INTRODUCCIÓN
Ecuador se ha convertido en uno de los países con un gran potencial
respecto a la medicina tradicional debido a su alta diversidad biológica y cultural
(Zambrano et al., 2014). Se estima que aproximadamente el 80% de la población
de nuestro país depende de la medicina tradicional, principalmente las personas
que viven en zonas rurales; las cuales, todavía necesitan directa o
indirectamente de las plantas para cubrir sus necesidades. En las ciudades, el
uso de plantas con propiedades terapéuticas es menor y generalmente es más
usado por las personas que viven en zonas marginales; no obstante, el comercio
de plantas medicinales aún se mantiene en los mercados de nuestro país
(Buitrón, 2013).
Las plantas están compuestas por metabolitos primarios como
carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos que están ampliamente
distribuidos y participan en la actividad celular. También, están formadas por
metabolitos secundarios; los cuales no son indispensables para las plantas; sin
embargo, forman parte de los llamados principios activos, compuestos químicos
de estructura relativamente compleja. Entre ellos se encuentran los alcaloides,
ácidos fenólicos, terpenos, quinonas, antraquinonas, saponinas que poseen
propiedades medicinales. Conociendo los metabolitos secundarios presentes en
la planta se pueden diseñar reacciones para producir derivados con utilidad
terapéutica (Kuklinski, 2000 y Lock, 1998).
Un antioxidante es una molécula que posee la capacidad de prevenir o
retardar la oxidación de otras moléculas, que pueden conducir al organismo a un
estrés oxidativo; lo que provoca una amplia diversidad de enfermedades como
la hipertensión arterial, psoriasis, diabetes mellitus, entre otras, debido a que la
defensa antioxidante es insuficiente (Lee et al., 2004; Pham-Huy, 2008). La
ingesta de una dieta rica en antioxidantes de origen natural, presentes en frutas
y vegetales disminuye el riesgo de padecer enfermedades provocadas por estrés
oxidativo (Paredes, 2010). Para saber la capacidad antioxidante de los principios
activos de las plantas y alimentos se han descrito diversas técnicas. Entre estas,
2
las más utilizada es la técnica que utiliza el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
conocido por las siglas DPPH; el cual es susceptible de reaccionar con
compuestos antioxidantes (Villaño et al., 2007; Goupy et al., 2003).
Los productos obtenidos de las plantas como los extractos y sus
compuestos puros, otorgan una gran cantidad de oportunidades para poder crear
nuevos medicamentos que beneficien al control microbiano. Uno de los
problemas actuales es la resistencia que presentan una serie de bacterias a los
antibióticos, debido a mutaciones en sus genes o por la adquisición de genes de
resistencia presentes en otros microorganismos. Además, de evitar la
propagación y la aparición de la resistencia a los antibióticos el objetivo es el
descubrimiento de nuevos fármacos (Fernández et al., 2003).
En Ecuador según los datos de la Organización Mundial de la Salud
(OMS) las enfermedades causadas por infecciones bacterianas fueron las más
comunes, ubicándose en el puesto número uno las infecciones respiratorias, la
diarrea aguda en segundo lugar. En relación a esto, se puede lograr el desarrollo
de farmacéuticos con actividad antimicrobiana, siendo indispensable el estudio
de plantas utilizadas en el país, comenzando con la identificación de los
principios activos presentes en las plantas para después obtener información
sobre la capacidad antimicrobiana del compuesto de interés (OMS, 2018; Ncube,
et al., 2008).
En la medicina, actualmente existen un 30% de fármacos provenientes
del reino vegetal, esta cifra tiende a elevarse en los últimos años debido al
descubrimiento de los principios activos presentes en las plantas. Los
metabolitos secundarios presentes en ellas poseen un gran interés biomédico,
por las diversas actividades biológicas que poseen como antioxidantes,
antimicrobianos, antiinflamatorios, expectorantes, analgésicos, desintoxicantes,
entre otros (Villareal, et al., 2014).
El género Hibiscus pertenece a la familia Malvaceae y se caracteriza por
presentar gran cantidad de flavonoides, taninos, triterpenos. Además, se han
demostrado sus propiedades antimicrobianas frente a Escherichia coli,
3
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, y con actividad
antioxidante, atribuida a los fenoles presentes en este género, de los que
destacan las antocianinas y los ácidos fenólicos (Medina et al., 2013; Reyes et
al., 2015; Sulaiman et al., 2014; Da Costa et al., 2014). A pesar de las
propiedades que poseen algunas especies del género Hibiscus, no se han
reportado estudios de la composición química y actividad biológica de Hibiscus
escobariae.
La especie Loxopterygium huasango de la familia Anacardiaceae se
encuentra en bosques secos tropicales, y presenta entre los metabolitos
secundarios: flavonoides, fenoles, saponinas, quinonas. Sin embargo, a pesar
de que esta especie ha sido empleada como antiviral, diaforético, anestésico,
repelente, catártico (Bussman, et al., 2009; Aguirre, 2012), hasta el presente no
se han registrado estudios sobre su actividad biológica; de acuerdo a revisiones
bibliográficas realizadas.
Croton ferrugineus es un arbusto que pertenece a la familia
Euphorbiaceae y diversas especies que pertenecen a este género son conocidas
comúnmente como “sangre de drago”, “palo sangre”, “palo de grado”, entre otros
dependiendo la zona. En cuanto a su uso, se han descrito experiencias como
antiséptico, cicatrizante, antiinflamatorio y antidiarréicos (Ordoñez, 2016). El
género Croton contiene metabolitos secundarios como alcaloides, flavonoides,
taninos, quinonas, esteroles y catequinas; sin embargo, no se han realizado
estudios de la composición química y la actividad biológica a Croton ferrugineus.
Dado a los antecedentes antes nombrados, estas especies fueron
escogidas por estar descritas en otros trabajos científicos por su contenido de
principios activos de importancia en la biomedicina como antioxidantes,
antiinflamatorios, antimicrobianos, entre otros. Por lo tanto, el objetivo del
presente trabajo fue identificar los metabolitos secundarios y evaluar la actividad
antibacteriana y antioxidante de los extractos etanólicos.
4
CAPÍTULO I
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Ecuador presenta una gran diversidad de flora, la cual se ha estudiado
desde hace muchos años, pero no fue sino hace 19 años que gracias a la
publicación Catálogo de las Plantas Vasculares del Ecuador (Jørgensen y León-
Yánez 1999), se documentó la presencia de más de 16000 especies de plantas.
Este número se ha ido incrementando durante los últimos años en un 6%; por lo
que actualmente sobrepasa las 17000 especies de plantas vasculares (Neill y
Ulloa 2011, Jørgensen et al., 2006).
Valencia et al. (2000) documentó la existencia de 4011 especies de
plantas endémicas en el Libro Rojo de Plantas Vasculares del Ecuador. La flora
de este país siempre ha sido distinguida debido a la riqueza de plantas
empleadas en la medicina tradicional y actualmente un 60% de estas especies
endémicas tienen uso medicinal (Naranjo y Escaleras, 1995); las mismas que
son de gran importancia por las comunidades indígenas. El estudio de estas
plantas medicinales ha sido desarrollado mayormente en la región Sierra y
Amazónica; sin embargo, en la región Costa son muy pocos los estudios
dedicados a plantas medicinales (Zambrano, et al., 2014).
Entre las especies de interés fitoquímico se encuentra, Hibiscus
escobariae, incluida en la familia Malvaceae; la cual, es un arbusto endémico de
los bosques secos de la costa del Ecuador de 0-500 msnm. De esta, solo se
conocen 18 poblaciones; encontradas en el Parque Nacional Machalilla ubicado
en la Provincia de Manabí y en la Isla de La Plata. Hibiscus escobariae, está
documentada en el Libro Rojo de Plantas Endémicas del Ecuador y catalogado
por la UICN como especie casi amenazada (Montúfar, R. y Pitman, 2004).
Actualmente no se han registrado estudios fitoquímicos de Hibiscus
escobariae, pero se conoce que diversas especies del género Hibiscus son
utilizadas en la industria farmacéutica para tratar afecciones como la
5
hipertensión arterial, procesos inflamatorios, afecciones hepáticas, entre otras
(Carretera y Ortega, 2017).
Loxopterygium huasango pertenece a la familia Anacardiaceae, conocida
comúnmente como: “Huasango” o “Hualtaco” en la provincia del Guayas y Santa
Elena. Se encuentra distribuida en la costa ecuatoriana y en la región tumbesina
peruana, desarrollándose en Bosques Muy Seco y Bosque Seco Premontano
(Jørgensen y León-Yánez 1999); además se caracteriza por estar presente
creciendo en suelos de textura moderadamente fina o fina con presencia de
gravas superficiales y es frecuente encontrarlo cerca de las quebradas (Conde,
2015).
La resina de L. huasango es empleada en la medicina como repelente,
ungüentos contra el reumatismo y anestésico para extraer los dientes en mal
estado. Otras de sus aplicaciones es la utilización de la madera para la
construcción de casas como postes, vigas, astillas para paredes que logran
resistir varias décadas, también como leña (Aguirre, 2012).
Croton ferrugineus pertenece a la familia Euphorbiaceae, conocida
comúnmente como: “Mosquera”, “Mosqueta” en el Ecuador, es un arbusto que
se distribuye desde Colombia, Brasil y en Ecuador desde el Río Chota en el
norte hasta Loja en el sur, está documentado en el Libro Rojo de Plantas
Vasculares del Ecuador y catalogado por la UICN como especie vulnerable
(Webster et al., 1999, Jørgensen y León-Yánez 1999).
Las hojas de Croton son utilizadas en la medicina tradicional por sus
propiedades cicatrizantes, antiinflamatorios, antisépticas, hemostáticas y
antidiarréicas. Algunas poblaciones indígenas las usan para tratar la fiebre
causada por infecciones digestivas, para baños vaginales antes del parto y para
hemorragias postparto (Tamariz, et al., 2003).
6
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 Objetivo General
• Identificar los metabolitos secundarios y evaluar la actividad antibacteriana y
antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae,
Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.
1.2.2 Objetivos Específicos
• Realizar el tamizaje fitoquímico de los extractos etanólicos de hojas de
Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.
• Cuantificar flavonoides y fenoles totales de los extractos etanólicos de hojas
de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus y su
actividad antioxidante.
• Determinar la actividad antibacteriana de los extractos etanólicos de hojas de
Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus.
7
1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA
La fitoquímica está encargada del estudio de metabolitos secundarios y
primarios elaborados, acumulados por las plantas. Esta disciplina se encarga de
analizar, la estructura de estos compuestos, su biosíntesis, metabolismo, su
distribución natural, su función biológica y su evaluación. Una de las
aplicaciones más importantes de la fitoquímica se encuentra en la industria de
alimentos y farmacéuticas de compuestos vegetales. De igual manera,
contribuye a generar información a la bioquímica vegetal, fisiología vegetal,
fitopatología, paleobotánica, toxicología, agronomía, genética vegetal,
sistemática vegetal y biotecnología vegetal (Viña, 2017).
El uso de plantas medicinales para tratar distintas enfermedades está
ligado a las tradiciones culturales, que han pasado de generación en generación
desde épocas ancestrales, beneficiando a las personas y comunidades que
mantienen y conservan el uso de plantas con propiedades terapéuticas (Osorio,
2014). En Ecuador, por poseer una gran diversidad de flora, existe una amplia
variedad de plantas con propiedades terapéuticas que podrían ser usadas como
materia prima para la producción de medicamentos (Sharapin, 2000).
Los estudios fitoquímicos realizados por Carretera y Ortega (2017) en
especies del género Hibiscus de la familia Malvaceae, indican que existe
presencia de flavonoides, taninos y triterpenos. En Hibiscus sabdariffa se ha
detectado actividad antimicrobiana y antioxidante, la cual ha sido comprobada
en ratas de laboratorio; además de que la misma es capaz de atenuar la
progresión de la enfermedad renal crónica.
En Loxopterygium huasango, de la familia Anarcadiaceae, existe la
presencia de flavonoides, taninos, quinonas, saponinas, y alcaloides; los cuales
tienen su importancia en la producción de fármacos como antibióticos,
antifúngicos, inhibidores enzimáticos y antitumorales (Bussman et al., 2009).
En Croton ferrugineus se han realizado estudios fitoquímicos que indican
la presencia de flavonoides, fenoles, triterpenos y esteroles; los cuales están
8
relacionados a su interés terapéutico como tratamiento de úlceras
gastrointestinales, cólicos uterinos, retención de orina y como anticancerígeno
(Tamariz, et al. 2003).
En la actualidad son diversas enfermedades por las que tiene que padecer
el ser humano, y muchas de ellas son causadas por microorganismos patógenos
que han adquirido gran resistencia a los antibióticos, además del daño que causa
los radicales libres. He aquí la importancia de la presente investigación que
permitirá dar a conocer acerca de la composición fitoquímica presente en los
extractos etanólicos de hojas de Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango
y Croton ferrugineus y evaluar su actividad antibacteriana y antioxidante; además
de prevenir la destrucción de especies de plantas, que por desconocimiento no
son consideradas económicamente rentables.
9
1.4 HIPÓTESIS
Hipótesis alternativa (Hi):
Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus
presentan actividad antibacteriana y antioxidante.
Hipótesis nula (Ho):
Hibiscus escobariae, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus no
presentan actividad antibacteriana y antioxidante.
10
CAPÍTULO II
2.1 ANTECEDENTES
En el estudio “Actividad biológica de los compuestos del género Hibiscus”,
Vasudeva et al. (2008), mencionan que diversas especies del género presentan
flavonoides, antocianinas, terpenoides, esteroides, polisacáridos, alcaloides,
aminoácidos, lípidos, sesquiterpenos, quinonas y grupos de naftaleno. Algunos
de estos metabolitos secundarios mencionados han mostrado actividad
antibacteriana, antioxidante, antiinflamatoria, antihipertensiva, antifertilidad y
antifúngica (Kholkute et al., 1977; Parmar y Ghosh, 1978; Gangrade et al., 1979;
Jain et al., 1997; Faraji y Tarkhani, 1999).
Prasad (2014), realizó un análisis fitoquímico en varias especies de
Hibiscus donde los extractos etanólicos de las hojas mostraron la presencia de
alcaloides y taninos, mientras que los flavonoides, triterpenos, glucósidos
cardiotónicos y quinonas estuvieron presentes en pocos extractos, mientras que
las saponinas estuvieron ausentes.
En el estudio “Propiedades terapéuticas del Hibisco”, realizado en
Hibiscus sabdariffa, encontraron la presencia de ácidos orgánicos, cítrico,
málico, entre otros. También contiene aminoácidos, flavonoides, ácidos
fenólicos, polisacáridos y fitoesteroles. Se han elaborado diferentes ensayos in
vitro e in vivo destacando los efectos que tiene para tratar enfermedades como
la hipertensión arterial, procesos inflamatorios, afecciones hepáticas. Además de
comprobar sus propiedades antimicrobiana, antioxidante, antiespasmódica,
antipirética, diurética, cardioprotectora, protectora renal, hipoglucemiante,
antiobesidad y quimioprotectora, disminuye los niveles de colesterol y logra la
inhibición de la oxidación del LDL-colesterol en animales como ratas y conejos y
en el ser humano (Serban et al., 2015; Buckholz et al., 2016; Carretera y Ortega,
2017).
Hibiscus sabdariffa presenta fenoles, tales como antocianinas y ácidos
fenólicos a los cuales se atribuye su actividad antioxidante. Se ha logrado
11
detectar la presencia de flavonoides como el kaempferol-3-glucósido, un
derivado de quercetina, y antocianinas, así como varios ácidos fenólicos.
(Medina et al., 2013; Reyes et al., 2015; Salinas-Moreno et al., 2012, Da Costa
et al., 2014; Frank et al., 2012). Se han reportado diversos estudios del contenido
total de fenoles en Hibiscus sabdariffa, presentando un contenido total de 14,18
mg GAE/ g de extracto y de 10.71±0.29 mg GAE g-1 (Vivas et al., 2014; Reyes et
al. 2015).
La evaluación de la actividad antioxidante que se realizó en Hibiscus
sabdariffa mediante la técnica del radical DPPH presentó un IC50=0,1 mg / mL.
También se le ha evaluado la actividad antioxidante en Hibiscus rosa-sinensis
mostrando su mayor capacidad en el extracto etanólico (Prassad, 2014; Reyes
et al., 2015; Da Costa, 2010).
En cuanto a estudios de actividad antibacteriana en las especies del
género Hibiscus contra las bacterias Gram positivas, se ha demostrado que son
susceptibles a los extractos; contrario a lo que sucede con las bacterias Gram
negativas que por lo general son menos susceptibles porque poseen su
membrana externa de lipopolisacárido y lipoproteína que es resistente a
sustancias antibacterianas (Chung et al., 2004; Alzoreky et al., 2003).
Sulaiman et al. (2014), realizó pruebas de actividad antimicrobiana del
Hibiscus sabdariffa para compararlas con Allium sativum (ajo) y Zingiber
officinale (jengibre), frente a Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa, observándose inhibición del crecimiento bacteriano
en concentraciones de 25 a 200 mg/mL. Alshami y Alharbi (2014), determinaron
el efecto antimicrobiano bacteriostático de Hibiscus sabdariffa, frente a cepas de
Escherichia coli en concentraciones mínimas que podían variar entre 0.5 a 4
mg/mL.
Bussman et al. (2009), evaluó el extracto de hojas de Loxopterygium
huasango encontrando en el tamizaje fitoquímico metabolitos secundarios tales
como alcaloides, flavonoides, taninos, quinonas, antraquinonas, saponinas y
esteroles. De la Torre et al. (2008) y Aguirre (2012), afirman que Loxopterygium
12
huasango es empleada como antiviral, diaforética, anestésica, repelente y para
eliminar verrugas; además la resina de la corteza del huasango es utilizada para
tratar dolores musculares y fracturas.
Actualmente no se han reportado estudios sobre la actividad biológica de
Loxopterygium huasango. Sin embargo, si se han realizado estudios a la familia
Anacardiaceae que se caracteriza por presentar metabolitos secundarios tales
como flavonoides, taninos, terpenos, estroles, saponinas y quinonas. Debido a
la diversidad química que posee esta familia se le atribuyen diversas actividades
biológicas como: citotóxica, antibacteriana, antioxidante, antiinflamatoria,
antimalárica, antiviral, catártico, entre otras (Silva et al., 2015; Atto et al. 2016;
Pérez et al., 2012; Suzimone et al., 2006; Sanchez, 2000; Garrido et al., 2004).
En el estudio “Importancia medicinal del género Croton (Euphorbiaceae)”,
menciona que existe la presencia de metabolitos secundarios tales como
fenoles, esteroles, diterpenos de tipo labdano y flavonoides de tipo flavanoles y
derivados del Kaempferol, los cuales, son de gran importancia por las actividades
biológicas que poseen, debido a la variedad química que presenta, el cual ofrece
diversos compuestos con potencial farmacológico (Barrera et al., 2016). Wen et
al. (2018), realizaron diversos estudios desde 2006-2018, de los componentes
químicos y biológicos que presentan especies del género Croton encontrándose
diterpenoides, sesquiterpenoides, glucósidos, alcaloides. El metabolito
secundario predominante lo conforman los diterpenoides, los cuales han sido los
aislados más estudiados del género y se ha demostrado que poseen actividades
biológicas muy variadas.
Salatino et al. (2007), indicó que la presencia de alcaloides en la familia
Euphorbeaceae no son comunes, pero existen en algunas especies del género
Croton, que si lo poseen. El alcaloide glutarimida es una nueva clase de
sesquiterpeno de tipo alcaloide que fue obtenido por especies de Croton.
También confirmó la presencia de taninos como proantocianidinas uno de los
principios activos más importantes en las especies que pertenecen al grupo de
“sangre de drago”, además de flavonoides de tipo flavonoles y flavonas que se
han aislado de hojas.
13
El tamizaje fitoquímico que se realizó en Croton elegans reporta la
presencia de metabolitos secundarios tales como: quinonas, alcaloides,
flavonoides, catequinas y triterpenos que han sido reportados por poseer
actividad antimicrobiana, antiinflamatoria, cardiotónica y espasmolítica
(Ordoñez, 2016; Romero, 2015; Kongkathip et al., 2002; Queiroga et al., 2000;
Tamokou et al., 2009; Kuete et al., 2007; Tchakam et al., 2012).
En Croton mauritianus se ha encontrado actividad antioxidante mediante
la técnica de eliminación del radical DPPH, con un IC50 de 0,03 ± 0,7 mg/mL, en
Croton thurife un IC50, con un valor de 0,02 mg/mL, y en Croton collinus un IC50
de 0,06 mg/mL. Mientras que, en Croton elegans no hubo actividad (Novello et
al., 2016; Quintero, 2017; Romero, 2015; Altamirano, 2015).
Algunas especies del género Croton poseen actividad antibacteriana, se
ha comprobado que la especie C. laui presenta una fuerte actividad
antibacteriana con una concentración mínima inhibitoria (CIM) de 43.4 µM,
contra cepas de bacterias Gram positivas como Staphylococcus sp.,
Micrococcus luteus y Bacillus subtilis, mientras que en Croton thurifer presenta
una CMI de 1 mg/mL frente a Bacillus subtilis. También se evaluó la actividad
antibacteriana en Croton elegans, frente a diversas cepas del género
Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella, Pseudomonas,
Salmonella, Trichophytum, presentando actividad solo en Streptococcus (Liu et
al., 2014; Quintero, 2017; Ordoñez, 2016; Romero, 2015).
14
2.2 MARCO TEÓRICO
2.2.1 Hibiscus escobariae
Figura 1: Hibiscus escobariae
Taxonomía
Phylum: Tracheophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Malvales
Familia: Malvaceae
Género: Hibiscus
Especie: Hibiscus escobariae
Ecología
Es una planta endémica de los bosques secos tropicales y subtropicales
del Ecuador de 0-500 m.s.n.m, conociéndose únicamente 18 poblaciones en el
Parque Nacional Machalilla y en la Isla de la Plata, aunque pueden estar en
hábitats similares de la Reserva Ecológica Manglares-Churute (Montúfar y
Pitman, 2004).
15
Descripción botánica
Poseen tallos híspidos, tomentosos o con tricomas escuamiformes,
hojas indivisas, lobadas o digitales, pedúnculo generalmente articulado, flores
solitarias con sus pétalos más largos que el cáliz, con colores vivos; cinco estilos
libres en la parte superior, estigmas terminales (Montúfar y Pitman, 2004).
2.2.2 Loxopterygium huasango
Figura 2: Loxopterygium huasango
Taxonomía
Phylum: Tracheophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Sapindales
Familia: Anacardiaceae
Género: Loxopterygium
Especie: Loxopterygium huasango
Ecología
Se encuentra distribuido en Bosques Secos y Bosque Seco Premontano,
desde la región tumbesina de las costas de Perú, hasta la Península de Santa
Elena en Ecuador entre los 0 a 800 m.s.n.m (Chavesta, 2005).
16
Descripción botánica
Árbol caducifolio que mide 25 m de alto, de fuste cilíndrico y algunas veces
irregular, con hojas imparipinadas, alternas, dispuestas en espiral, con base
oscura y ápice agudo. Su fruto es una sámara y su inflorescencia es en panículas
axilares pinosas de 5 cm de longitud, siendo terminales o distales, sus flores son
pequeñas, actinomorfas, pentámeras, de 2-4 mm de longitud, el pedicelo de 1-2
mm de longitud (Centro de Ideas, 2006 y Chavesta, 2005).
2.3.3 Croton ferrugineus
Figura 3: Croton ferrugineus
Taxonomía
Phylum: Tracheophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Malpighiales
Familia: Euphorbiaceae
Género: Croton
Especie: Croton ferrugineus
17
Ecología
Se encuentra distribuido en Perú, Colombia, Brasil y Ecuador (provincia
de Loja); habita desde Bosques Húmedos hasta zonas xerofíticas (Govaerts,
2018).
Descripción botánica
Arbusto con savia lechosa, sus hojas son alternas, simples, con
presencia de tricomas en la superficie, presentan glándulas en la base de la
lámina, inflorescencia condensada, las flores son unisexuales actinomorfas,
poseen pétalos reducidos o ausentes, ovario es tricarpelar con un lóbulo por
lóculo o cámara (Barrera et al., 2016).
2.2.4 Metabolitos secundarios
Son compuestos orgánicos de bajo peso molecular que presentan una
distribución restringida en cada género, familia o especie del reino vegetal,
incluso en partes específicas de cada planta, encontrándose en pequeñas
cantidades. No poseen función directa en los procesos de: crecimiento,
fotosíntesis, respiración, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o
síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos.
A pesar de no ser indispensable en el funcionamiento celular de las
plantas, tiene importantes funciones ecológicas otorgándoles olor, sabor y color
a las flores y frutos; lo que las hace atrayente de insectos polinizadores y
dispersores de semillas y frutos, o repelente de animales predadores debido a
que le proporciona sabores amargos que algunas veces pueden ser venenosos
(Ávalos y Pérez, 2009; Lincoln y Zeiger, 2006). Algunos de estos metabolitos
secundarios como: alcaloides, flavonoides, taninos, terpenos, saponinas,
quinonas, entre otros. Son de alto valor medicinal debido a sus propiedades
terapéuticas, además de poseer valor económico para la industria alimentaria,
cosmética y farmacéutica.
18
Las principales rutas de biosíntesis de metabolitos secundarios se derivan
del metabolismo primario del carbono. Para el caso de los alcaloides que se
sintetizan a mediante la ruta de síntesis del ácido shikímico y a partir de
aminoácidos. Mientras que, los compuestos fenólicos (lignanos, cumarinas,
taninos y flavonoides) son derivados de los fenilpropanoides mediante la vía del
ácido shikímico o la vía malonato/acetato. En cambio, los terpenoides se
sintetizan por la vía del ácido mevalónico (Figura 4).
Figura 4: Elementos del metabolismo del carbono en relación con las rutas de síntesis de metabolitos secundarios (Ávalos y Pérez, 2009)
19
2.2.5 Tamizaje fitoquímico
Una de las primeras etapas del estudio fitoquímico es el tamizaje o
screening fitoquímico, un método cualitativo que va a poder determinar los
principales grupos químicos presentes en las plantas y a partir de allí va a ser de
gran ayuda para poder guiar a la extracción y aislamiento de los grupos de
interés.
El screening fitoquímico se fundamenta en la aplicación de solventes y de
reacciones de precipitación y color para la extracción de metabolitos en las
plantas, permitiendo una evaluación rápida, reproducible, sensible y de bajo
costo. Los resultados solo sirven de guía y se debe interpretar junto a los
resultados del screening farmacológico. Es decir, si una planta tiene acción sobre
el sistema nervioso central en el tamizaje farmacológico y a su vez presenta
alcaloides en el tamizaje fitoquímico, es muy probable que se deba a la presencia
de estos; lo mismo sucede cuando hay actividad antiinflamatoria que puede ser
por la presencia de flavonoides, efectos catárticos relacionado con las
antraquinonas (Palacios, 2009).
Alcaloides
Son compuestos que contienen uno o más átomos de nitrógeno, formando
parte de un anillo heterocíclico que posee átomos de nitrógeno y carbono (Figura
5). Es uno de los grupos más grandes debido a que posee aproximadamente 15
mil metabolitos secundarios, encontrándose en un 20% de las plantas vasculares
(Lincoln y Zeiger, 2006). Los alcaloides son biosintetizados a partir de
aminoácidos precursores como triptófano, tirosina, fenilalanina, lisina, arginina y
ornitina, solos o combinados con terpenoides (Sepúlveda et al., 2003).
Hasta el presente, se han aislado aproximadamente 7 mil estructuras de
alcaloides, debido a sus propiedades toxicológicas y medicinales como
anestésicos y analgésicos. Se los puede encontrar en abundancia en hojas,
raíces y semillas, pero sus concentraciones van a ser variables por factores
como la madurez, suelo, variaciones estacionales, entre otros (Sepúlveda et al.,
2003).
20
Para poder detectar la presencia de alcaloides en general, existen
diversos reactivos como Wagner, Mayer, Bouchardat y Dragendorff, que están
basados en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos
ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como bismuto, mercurio,
tugsteno formando precipitados (López 2007, Arango, 2008).
Figura 5: Alcaloides representativos (Arango, 2008)
Flavonoides
Son compuestos fenólicos que contienen un variable número de grupos
hidroxilos, ubicados generalmente en los carbonos 4, 5 y 7; comparten un
esqueleto carbonado básico (difenilpiranos) que posee 15 átomos de carbono
(Figura 6), se diferencian de las distintas clases de flavonoides, dependiendo del
lugar en anillo C. Los azúcares son muy comunes en la mayoría de flavonoides,
apareciendo naturalmente como glicósidos (Lincoln y Zeiger, 2006).
21
Figura 6: Tipos de flavonoides (López, 2010)
Se han identificado aproximadamente 5 mil flavonoides de distintos tipos,
encontrándose en vegetales, semillas y frutos, también se han descrito diversas
propiedades terapéuticas atribuidas a los flavonoides tales como: antioxidantes,
antimicrobianas, antiinflamatoria, antihemorrágicas, antivirales, antialérgicas,
hepatoprotectora, fotoprotectora, entre otras. En la prueba de shinoda para
determinar la presencia de flavonoides, el ácido clorhídrico al ser un medio ácido
fuerte y en presencia de magnesio se genera un hidrógeno produciendo la
reducción del ión flavilio de color rojo escarlata (Guacuja, 1995).
Taninos
Son compuestos polifenólicos solubles en agua y en solventes orgánicos
polares, presentan varios grupos hidroxilo que están unidos a estructuras
fenólicas, lo que les otorga la característica de poder formar complejos con
proteínas, minerales y otras macromoléculas. Existen dos grupos de taninos:
hidrolizables y condensados.
22
Los taninos hidrolizables son componentes fenólicos no flavonoides
(Figura 7), se caracterizan por presentar estructura de glicósidos, ésteres de
glucosa y de ácidos fenólicos como el ácido gálico. Son aquellos que por medio
de hidrólisis en medio ácido y a ebullición forman productos solubles en agua y
en presencia de sales de hierro dan coloraciones negro-azulada. Estos taninos
se los encuentran comúnmente en hojas, fruto, vainas y espinas de plantas
dicotiledóneas (Vásquez et al., 2012; Goycochea, 2010).
Figura 7: Estructura química de compuestos polifenólicos no flavonoides (Vásquez, 2014)
Los taninos condensados de tipos flavonoides (Figura 8), son menos
solubles en agua que los taninos hidrolizables y se oxidan en un medio ácido a
ebullición formando flobafenos que son polímeros de color rojo. Sus moléculas
parecen ser intermediarios en la biosíntesis de catequina y los flavan-,34-dioles,
por esta razón están relacionados con los flavonoides, además de poderse
hidrolizar a antocianinas con la presencia de ácidos, denominándose
proantocianidinas (Ávalos y Pérez, 2009).
23
Figura 8: Estructura química de compuestos polifenólicos de tipo flavonoide (Vásquez, 2014)
Se han descrito diversas aplicaciones de los taninos que son originadas
por sus propiedades astringentes, actuando como antidiarreico y antiséptico
debido a que pueden impermeabilizar las capas más externas de la piel y las
mucosas, pueden bloquear la formación de endotelina-1 que es una molécula
que provoca la vasoconstricción, poseen efectos antimicrobianos, antifúngicos,
antioxidante, además de servir como antitóxico por ser hemostáticos y precipitar
en presencia de alcaloides. Todas las propiedades terapéuticas que poseen es
a causa de su toxicidad al unirse a proteínas de forma inespecíficas, formando
puentes de hidrógeno entre los grupos hidróxilo y los sitios electronegativos de
las proteínas (Reed, 2010).
Quinonas
Las quinonas son compuestos aromáticos que poseen un grupo
dicarbonilo, y se pueden encontrar en plantas, hongos y bacterias. Existen tres
tipos: benzoquinonas, naftoquinonas o antraquinonas (Figura 9), dependiendo
del grado de complejidad de su estructura química; de tal manera que pueden
ser monocíclicas, bicíclicas o tricíclicas (Domínguez, 1985).
24
Figura 9: Tipos de quinonas (Martínez, 2012)
Las benzoquinonas (monocíclicas) son estructuras derivadas del benceno
que conforman el grupo al que le han dado menor interés en relación a la
fitoterapia, además de ser un potente alergizante debido a que algunas pueden
comportarse como haptenos por la combinación de los grupos amino o tiol
induciendo una dermatitis por sensibilización.
Las naftoquinonas (bicíclicas) son estructuras derivadas del naftaleno,
que se encuentran generalmente en plantas superiores, en forma heterosídica
cuando la planta está fresca y durante el proceso de desecación libera genina.
Presenta importantes propiedades terapéuticas como antibacteriana y fungicida.
También es muy usada en la industria cosmética como colorante natural
(Stoldùlková et al., 2010).
Las antraquinonas (tricíclicas) son estructuras derivadas del antraceno,
presentan dos grupos de cetona insaturadas que por reducción se transforman
en fenoles y generalmente están en forma de heterósidos. Se han descrito
diversas propiedades terapéuticas como antimicrobianas, anticancerígenas,
antioxidantes y antifúngicas (Stoldùlková et al., 2010; Bustamante et al., 2010).
Para poder detectar la presencia de antraquinonas existen pruebas
cualitativas como la reacción de Bornträger, en la que solo se da cuando existen
antraquinonas oxidadas libres, que son solubles en disolventes orgánicos y al
añadirles hidróxido de potasio se forma una capa de coloración roja debido a las
sales que posee (Sánchez y Santa, 2009).
25
Triterpenoides y esteroides
Los terpenoides son compuestos que poseen hidrógeno, oxígeno y
cadenas de carbono que están formadas por la unión de dos o más moléculas
de isoprenos, conforman uno de los grupos más numerosos de metabolitos
secundarios existiendo más de 40 mil moléculas diferentes. Se clasifican según
el número de unidades de isopreno en: hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) y
poliisoprenoides ((C5) n) (López, 2007; Ávalos y Pérez, 2009; Lizcano et al.,
2008). Además, son solubles en solventes orgánicos y por lo general insolubles
en agua, aunque en el contenido celular se encuentran solubles debido a que
forman parte de los glicósidos. Diversos terpenoides son de gran importancia en
la industria de alimentación, cosmética, agrícola como insecticida y farmacéutica
por sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antimalariales y
antimicrobianas (Cuadrado, 2004; Ringuelet et al., 2013).
Uno de los grupos más estudiados de los terpenoides son los
triterpenoides que están formados por una estructura policíclica, generalmente
tetra o pentacíclica. En el reino vegetal se los puede encontrar como glicósidos,
ésteres o libres, en las hojas, frutos y algunas resinas de árboles.
Entre los triterpenoides se encuentran los esteroides, alcoholes sólidos
formados con C27 a C29 átomos, con una estructura fundamental de ciclopentano
perhidro fenantreno y una cadena lateral al que pueden insertarse radicales
libres de metilo o etilo, son de origen animal, aunque también han sido
encontrados en vegetales en forma libre, como ésteres (Figura 10), o como
glicósidos. Pueden clasificarse como esteroles, saponinas esteroidales (o sus
agliconas sapogeninas), glicósidos cardíacos, esteroalcaloides y las llamadas
hormonas esteroidales (Look, 1994; Domínguez, 1979).
26
Figura 10: Molécula de escualeno y sus derivados triterpenos cíclicos estigmasterol y sitosterol
(Ávalos y Pérez, 2009)
Saponinas
Son un grupo de glicósidos formados por una estructura heterosídica que
contienen uno o varios azúcares con propiedades surfactantes, es decir que al
diluirse en el agua forman espuma abundante y relativamente estable, similares
al jabón, también se pueden presentar como agliconas es decir sin molécula de
azúcar denominándose sapogeninas, originadas por hidrólisis ácida o enzimática
(Figura 11). Además, muchas de ellas también tienen propiedades hemolíticas
debido a que pueden alterar la permeabilidad de las membranas biológicas, lo
que resulta tóxico para los animales que poseen sangre fría (Domínguez, 1979).
Figura 11: Estructura química de las saponinas (Ahumada, et al., 2016)
27
A las saponinas se le atribuyen diversas propiedades terapéuticas como
antiinflamatorias, antimicrobianas, analgésicas, antiespectorantes, antiviral,
espermicida, antihemorroidales, venotónicos, además pueden producir
hemólisis de los glóbulos rojos y proteger contra el cáncer de estómago e
intestino (Cuadrado, 2004).
2.2.6 Cuantificación de Flavonoides
Existen diversos métodos para realizar la cuantificación de flavonoides,
como métodos cromatográficos entre los cuales se puede encontrar
cromatografía de capa fina, cromatografía de gases, cromatografía líquida y
cromatografía de gases acoplado a masas GC/MS. Estos métodos poseen la
ventaja de ser altamente eficientes, debido a su aportación de información
definitiva para la caracterización de las muestras, teniendo como desventaja el
elevado costo. Sin embargo, se puede cuantificar los flavonoides por métodos
espectrofotométricos que son más económicos y confiables entre ellos se
encuentra el método colorimétrico de cloruro de aluminio que forma complejos
estables de ácidos con el grupo cetona en C-4 o bien el grupo hidroxilo en C-3 o
C-5 de flavonas y flavonoles. Además, también forma complejos lábiles ácidos
con los grupos dihidroxilo en el anillo A o B de los flavonoides (Meza, 2011;
Zhishen et al., 1999).
2.2.7 Cuantificación de fenoles
El método más usado para la cuantificación de fenoles totales es Folin-
Ciocalteu propuesto por Singleton et al. (1999), basado en la capacidad de los
fenoles para reaccionar frente a agentes antioxidantes. Folin-Ciocalteu es un
reactivo con una mezcla de molibdato y tungstato sódico que puede reaccionar
en presencia de fenoles, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico. En
el momento en que se da la transferencia de electrones a un pH básico va a
reducir los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, produciendo un
color azul intenso, de tungsteno y molibdeno, de tal manera que este color es
28
proporcional al número de grupos hidroxilo de las moléculas de los fenoles
(Henderson et al., 2000).
2.2.8 Actividad antioxidante
Un antioxidante es aquella sustancia que puede prevenir o retardar las
reacciones de oxidación; es decir pueden evitar el daño que causan los radicales
libres. Estos son átomos que poseen un electrón desapareado o impar, que
recorren el organismo para robar un electrón a moléculas estables y lograr su
estabilidad electroquímica; ocasionando la inestabilidad de las moléculas que
cedieron su electrón, lo que a su vez se convierte en un radical libre, iniciándose
reacciones en cadena.
Se han descrito diversos métodos para evaluar la actividad antioxidante,
pero al que más se le ha mostrado su atención es a la técnica 2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo conocido comúnmente como DPPH, debido a que es una técnica
barata, rápida, sensible y reproducible. Este método se basa en que el radical
libre DPPH, reacciona en presencia de un agente antioxidante, el cual le cedió
un átomo de hidrógeno, decolorándose de color azul-violeta a amarillo pálido,
que se lee a una absorbancia de 517nm, para poder determinar el porcentaje de
inhibición del DPPH y finalmente obtener el valor IC50, es decir la concentración
de la muestra problema que produce una inhibición del 50% del DPPH (Nenadis
et al., 2007; Chaouche et al., 2013).
Metabolitos secundarios como agentes antioxidantes
Los compuestos fenólicos como los flavonoides poseen un variable
número de grupos hidroxilos en su estructura química, la excelente actividad
antioxidante se le atribuye a la quelación de hierro y otros metales de transición.
Por ello la industria farmacéutica y alimenticia ha mantenido un gran interés
como protección a los fenómenos que causan un daño oxidativo ocasionando un
elevado número de enfermedades (Havsteen, 1993, Perez, 1994).
29
La acción antioxidante de los flavonoides de debe a que son capaces de
retirar el oxígeno reactivo generalmente en forma de aniones superóxidos,
radicales hidróxidos, peróxidos, lipídicos o hidroperóxidos. Así bloquea la acción
destructora de dichas sustancias sobre las células (Pace et al., 1995).
El grupo de flavonoides que se presenta en las plantas como glucósidos,
quercetina y mircetina poseen una elevada actividad antioxidante, debido a son
excelentes captadores de radicales libres, rompiendo la cadena en reacciones
de oxidación de lípidos. La capacidad antioxidante de los flavonoides va a
depender de: la presencia en el anillo B de la estructura catecol u O-dihidroxi, la
presencia de un doble enlace en posición 2,3 y la presencia de grupos hidroxilo
en posición 3 y 5 que ejercen el máximo potencial antioxidante (Bors et al., 1990).
El flavonoide que mejor cumple estos requisitos es la quercetina, así que
es la más efectiva en cuanto a su función antioxidante y muestra efectos
correlacionados con el ácido ascórbico (Vitamina C). De manera que el ácido
ascórbico reduce la oxidación de la quercetina, que al combinarse con ella,
permite que mantenga sus funciones durante un tiempo más prolongado (Merck,
2000).
2.2.9 Actividad antibacteriana
Consiste en evaluar si la muestra es capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano, para esto el ensayo más empleado es el antibiograma disco-placa
propuesto por Bauer-Kirby, recomendado por el Comité Nacional para
Estándares de Laboratorios Clínicos (NCCLS). El fundamento de este ensayo es
depositar en la superficie del agar previamente inoculado con el microorganismo,
discos de papel secante que contiene los diferentes antibióticos y muestras a
evaluar. En el momento en que existe el contacto entre el disco que contiene
antibiótico y la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe el agua y el antibiótico
se difunde en el agar de manera radial, formándose un gradiente de
concentración, lográndose observar una zona de inhibición a partir de 18-24
horas de haber realizado el ensayo (Picaso, 2000; Bauer et al. 1966).
30
El ensayo disco-placa finaliza en la lectura del valor de la concentración
mínima inhibitoria (CMI), que se obtiene por métodos de dilución, la
concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y
bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la CMI.
Metabolitos secundarios como agentes antibacterianos
El anillo B de los flavonoides juegan un papel importante en la actividad
antibacteriana, porque se intercalan con las bases de los ácidos nucleicos, lo
que origina la inhibición de la síntesis de ADN y ARN. Los flavonoides robinetina,
miricetina y epigallocatequina inhiben la síntesis de ARN en S. aureus y los
flavonoides como quercetina, apigenina y 3,6,7,3’, 4’-pentahidroxiflavona, que
poseen una hidroxilación en el anillo B inhiben la síntesis de la enzima ADN
girasa, variando la estructura de E.coli (Cushnie et al., 2005).
Una de las isoflavonas con mejor actividad antibacteriana son las
fitoalexinas, que son un tipo de flavonoides indetectable antes de la infección, se
producen como un mecanismo de resistencia frente a microorganismos
patógenos, limitando la invasión de los mismos, transcribiendo y traduciendo los
ARNm adecuados, activando nuevas rutas biosintéticas (Lincoln y Zeiger, 2006).
Otros de los compuestos fenólicos como: proantocianidinas,
antocianidinas, ácido cinámico, ácido 3-cumárico, ácido cafeico, ácido ferulico,
ácido clorogénico, pelargonidina, delfinidina y cianidina y cianidin-3-glucósido
también poseen actividad antibacteriana pero solo contra bacterias gram-
negativas (Puupponen et al., 2001).
Las quinonas identificadas como 2-acetoxi-2,3-dihidro-nafto-[2,3-b]-furan-
4,9-diona; 2-hidroxi-1,4- naftoquinona; 1,4-naftoquinona y 2-acetoxi-2,3-
dihidronafto-[1,2-b]-furan-4,5-diona poseen actividad antibacteriana frente a
Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus inhibiendo
la síntesis de ADN y ARN (Rodríguez et al., 2007).
31
CAPÍTULO III
3.1 METODOLOGÍA
3.1.1 Material biológico
Las hojas de Hibiscus escobariae fueron recolectadas en mayo del 2018,
en el campus de la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias Naturales
ubicada en 79°55.14' Oeste 2°8.50.4' Sur. La identificación botánica fue
realizada por el especialista MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección
Cornejo 5916 que reposa en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias
naturales, Universidad de Guayaquil, Ecuador.
Las hojas de Loxopterygium huasango fueron recolectadas en mayo del
2018, en el campus de la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias
Naturales 79°55.14' Oeste 2°8.50.4' Sur. La identificación botánica fue realizada
por el especialista MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección Cornejo 5686
que reposa en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias naturales,
Universidad de Guayaquil, Ecuador.
Las hojas de Croton ferrugineus, fueron recolectadas en abril del 2018 en
la provincia de Loja-Ecuador, en la localidad de Catamayo ubicada en 79°34.52'
Oeste 3°98.13' Sur. La identificación botánica fue realizada por el especialista
MSc. Xavier Cornejo, basada en la colección Cornejo 9244 que fue depositado
en el herbario GUAY de la Facultad de Ciencias naturales, Universidad de
Guayaquil, Ecuador.
3.1.2 Obtención del extracto
Las muestras vegetales se secaron durante dos días a temperatura de
40°C, en una estufa con circulación de aire; luego de este período se procedió a
la maceración de hojas con etanol al 99%, el cual estuvo en reposo durante 4
días en condiciones de oscuridad a temperatura ambiente. Luego se filtraron los
extractos y se concentraron a presión reducida en un Rotavapor (R-3 BUCHI).
32
3.1.3 Tamizaje fitoquímico
Los metabolitos secundarios tales como: alcaloides, flavonoides,
taninos, quinonas y antraquinonas, saponinas, esteroides y triterpenos se
determinaron mediante la metodología propuesta por Domínguez (1979).
3.1.3.1 Determinación de alcaloides.
A cada 10 mg de extracto se le añadieron 2 mL de ácido clorhídrico al 5%.
Posteriormente se agregaron de 2-5 gotas de los reactivos Wagner, Mayer,
Bouchardat y Dragendorff. Se consideró como positiva las pruebas en las que
se observó un precipitado color rojo marrón (Wagner), blanco (Mayer), pardo
(Bouchardat) y naranja-rojizo para el reactivo Dragendorff (Anexo 1).
3.1.3.2 Determinación de Flavonoides
Prueba de Shinoda: A 1 mL de extracto diluido se le añadieron 3 gotas
de ácido clorhídrico concentrado. La formación del color rojo indicó la presencia
de auronas y chalconas. En los casos en que no se observaron cambios de color,
se añadieron piezas de magnesio metálico. La formación de coloraciones
naranja, roja o magenta indicó la presencia de flavonas y flavonoides,
respectivamente (Anexo 2).
Prueba de hidróxido de sodio (10%): A 1 mL de extracto diluido en etanol
absoluto se le añadieron 3 gotas de hidróxido de sodio al 10%. La Formación de
coloración rojo-amarillo, café-naranja, púrpura-rojo o azul indicó la presencia de
xantonas y/o flavonas, flavonoides, chalconas y antocianinas, respectivamente
(Anexo 3).
3.1.3.3 Determinación de Taninos.
Reacción cloruro férrico: A 1 mL del extracto etanólico se le añadieron
gotas de la solución de cloruro férrico al 10%. La formación de una coloración
33
azul indicó la presencia de taninos hidrolizables y el color verde, indicó la
presencia de taninos condensados (Anexo 4).
3.1.3.4 Determinación de quinonas y antraquinonas.
Prueba de Borntrager: Se llevó a sequedad 5mL de extracto y se
añadieron 4 mL de la solución de hidróxido de potasio al 5%, se llevó el tubo a
ebullición por 3 minutos a baño María, se dejó enfriar, se añadieron 2 mL de
cloroformo, se agitó para la extracción y la fase acuosa se descartó, mientras
que a la fase orgánica se le adicionaron 2 mL de una solución de hidróxido de
potasio al 5%. La formación del color rojo indicó la presencia de antraquinonas
(Anexo 5).
Prueba de ácido sulfúrico: A 10 mg de extracto etanólico se le añadió 1
gota de ácido sulfúrico concentrado. La formación de color rojo indicó la
presencia de quinonas (Anexo 6).
3.1.3.5 Determinación de esteroides y triterpenos.
Prueba de Salkowski: A 3 mL de extracto etanólico se le añadieron 2 mL
de cloroformo y 1 mL de ácido sulfúrico concentrado hasta que se formó una
doble fase. La formación de color pardo en la capa media indicó un anillo
esteroideo (Anexo 7).
Prueba Lieberman Bouchard: A 2 mL de extracto etanólico se le añadió 1
mL de anhídrido acético y 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Se dejó en
reposo por de 5 minutos. La formación de una capa intermedia de color azul-
verde indicó esteroles, y el color rosado, rojo, magenta o violeta reveló la
presencia de terpenoides (Anexo 8).
3.1.3.6 Determinación de saponinas.
Prueba de la espuma: A 20 mg del extracto etanólico se le añadió 1 mL
de agua destilada caliente, se agitó vigorosamente para formar espuma, se dejó
reposar durante 10 minutos. El contenido de saponina se midió de la siguiente
34
manera: sin espuma (ausencia); espuma menos de 3 mm de alto (pobre);
espuma de 6 mm de altura (moderada) y espuma de más de 8 mm de altura
(abundante) (Anexo 9).
3.1.4 Cuantificación de flavonoides y ácidos fenólicos totales
Se cuantificó los flavonoides totales mediante el método colorimétrico
cloruro de aluminio propuesto por Zhishen et al. (1999) y la cuantificación de
fenoles totales se la realizó mediante el método Folin Ciocalteu propuesto por
Singleton et al. (1999).
3.1.4.1 Cuantificación de Flavonoides Totales.
Para la cuantificación de flavonoides totales se realizó una curva de
calibración utilizando la quercetina como patrón de referencia a una
concentración de 0.1 mg/mL. Para realizar el tratamiento de la curva de
calibración se añadió una alícuota (0.25 mL) de solución estándar de quercetina
(20, 40, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500 ,750 µg/ mL) a un tubo de ensayo de 15
mL. Se agregó un 1 mL de H2O destilada. Se añadió al tubo de ensayo 0.075
mL de NaNO2 al 5%. Después de 6 minutos, se agregó 0,075 mL de AlCl3 al
10%. Después de 5 minutos, 0.5 mL de NaOH 1 M y completar el volumen total
hasta 2.5 mL con H2O. Se mezcló bien la solución y se colocó 200 µL en los
micros placas. La absorbancia se midió frente a blanco de reactivo preparado a
510 nm en un espectrofotómetro Multiskan GO Thermo Scientific. El contenido
total de flavonoides se expresó como mg equivalentes de Quercetina (CE) / g de
masa fresca (Anexo 10).
Para el análisis de las muestras por triplicado, se utilizó una concentración
de 0.5 mg/mL de etanol absoluto. Posteriormente se sometió al mismo
tratamiento que la curva de calibración (Anexo 11).
35
3.1.4.2 Cuantificación de Ácido Fenólicos Totales.
Para la cuantificación de ácidos fenólicos totales se realizó una curva de
calibración utilizando el ácido gálico como patrón de referencia a una
concentración de 0.5 mg/mL. Para realizar el tratamiento de la curva de
calibración se añadió una alícuota (150 L) solución estándar de Ácido gálico
(30, 50, 80, 100, 120, 150, 180, 210 µg/ mL) a un tubo de ensayo de 15 mL. Se
agregó 75 µL de Folin-Ciocalteu. Inmediatamente se agitó en vortex. Se Esperó
10 minutos, en absoluta oscuridad. Se añadió 375 µL de la solución de
Carbonato de sodio. Se agitó y guardó en absoluta oscuridad por 30 minutos. Se
colocó 200 µL en los micros placas. La absorbancia se midió frente a blanco de
reactivo preparado a 760 nm en un espectrofotómetro Multiskan GO Thermo
Scientific. El contenido total de fenoles se expresó como mg equivalentes de
Ácido Gálico (GAE) / g de extracto seco.
Para el análisis de las muestras por triplicado, se utilizó una concentración
de 0.5 mg/mL de etanol absoluto. Posteriormente se sometió el mismo
tratamiento que la curva de calibración (Anexo 12).
3.1.5 Actividad antioxidante
Las pruebas de actividad antioxidante se la realizaron por la técnica DPPH
(2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) propuesta por Williams et al. (1995) utilizando el
ácido ascórbico como blanco positivo.
3.1.5.1 Preparación de soluciones
Solución stock DPPH (A): 6 x 10 -5 M (metanol)
Solución de trabajo (B): Se tomaron 5 mL de solución stock de DPPH y
se aforó a 50 mL con metanol.
Solución de ácido ascórbico (C): Se preparó una solución de ácido
ascórbico 1 mM: 17.6 mg en 100 mL de metanol.
36
Solución stock de muestra (D): Se pesaron en tubo eppendorff 4 mg de
extracto y se aforaron a 1 mL.
3.1.5.2 Procedimiento
En tubo de ensayo se colocaron 50 µL de solución C y 700 µL de solución
B y se agitó. Se tomaron 50 µL de la solución stock de muestra de extracto y se
agregaron 700 µL de la solución B y se agitó. Posteriormente se dejaron los tubos
en oscuridad y cubiertos durante 30 minutos. Se leyó la absorbancia a 517 nm
del blanco (metanol), de la solución DPPH, del ácido ascórbico y de las muestras.
La absorbancia del DPPH estuvo en un rango de 0.600 a 0.700 nm. Las muestras
se analizaron por triplicado (Anexo 13).
Los cálculos del porcentaje de inhibición se lo realizaron con la siguiente fórmula:
%I =absorbancia del DPPH − Absorbancia muestra
absorbancia del DPPHx 100
Cuando el porcentaje de inhibición de la muestra fue mayor al 50 %, se aplicaron
diluciones de la solución stock de extracto para lograr encontrar la concentración
mínima inhibitoria.
3.1.5.3 Procedimiento para diluciones
Se tomaron 500 µL, 250 µL, 150 µL, 100 µL 50 µL, 25 µl, 20 µl de la
solución stock de extracto y se aforaron a 1 mL en un tubo eppendorff, luego en
tubos de ensayo por triplicado se agregaron 50 µL de cada una de las diluciones,
se agregaron 700 µL de la solución B. Posteriormente se dejaron los tubos en
oscuridad y cubiertos durante 30 minutos. Se leyó la absorbancia a 517 nm y se
calculó el porcentaje de inhibición.
37
3.1.6 Actividad antibacteriana
Las pruebas de actividad antibacteriana se la realizaron mediante la
metodología de ensayos de difusión por disco propuesta por Bauer-Kirby (1966),
contra tres bacterias Gram Positivas (Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Bacillus subtilis ATCC 6633, Listeria monocytogenes ATCC 19115 y tres Gram
negativas (Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802).
3.1.6.1 Cultivo de microorganismos
La siembra se realizó en el medio Müeller-Hinton Agar a 37 °C durante 18 h.
3.1.6.2 Preparación y suspensión del inóculo
Se seleccionaron de 3-5 colonias de cada microorganismo de un cultivo
puro de no más de 24 horas de su inoculación, se transfirieron las colonias a un
tubo que contenía de 3-5 mL de solución salina, se ajustó el inóculo a una
turbidez equivalente al estándar 1,0 de McFarland.
3.1.6.3 Siembra de la muestra
Se agregaron 200 µL de la suspensión del microorganismo y se lo
distribuyó en toda la placa de Müeller-Hinton Agar de manera homogénea con
ayuda de un asa de inoculación, se esperó 15 minutos manteniendo la caja Petri
cerrada para que la superficie del medio sembrado se seque. Se evaluaron
cuatro concentraciones del extracto: 20, 50, 100 y 200 mg/mL, para encontrar la
concentración mínima inhibitoria (CMI), para lo cual se colocaron 20 µL sobre
discos en blanco de la marca Oxoid™ de 6 mm de diámetro. En cada placa
también se colocaron como blanco positivo un disco de antibióticos de referencia
y como blanco negativo un disco en blanco con 20 µL de etanol. Se incubaron
las placas sembradas a 35°C por 16-18 horas.
38
En el caso de L. huasango también se evaluaron las concentraciones de
2.5, 5, 10, 15 mg/mL debido a que la CMI se encontró por debajo de la mínima
evaluada anteriormente (20 mg/mL).
Los antibióticos que se usaron de referencia fueron:
Ceftriaxone® Oxoid™ (30 µg) para Staphylococcus aureus
Sulfamethoxazole® Oxoid™ (25 µg) para Bacillus subtilis
Penicillin® G Oxoid™ (10 µg) para Listeria monocytogenes
Gentamicin® Oxoid™ (10 µg) para Escherichia coli
Tobramicina® Oxoid™ (10 µg) para Pseudomonas aureginosa
Tetracycline® Oxoid™ (30 µg) para Vibrio parahaemolyticus
3.1.6.4 Medición de la zona del halo de inhibición
Se midió la zona de inhibición redondeando al perímetro más cercano al
disco con un calibrador vernier digital, manteniendo la placa a unos pocos
centímetros sobre una superficie de color negro que no refleje la luz (Anexo 14-
16).
3.1.7 Análisis estadístico
Se comparó el porcentaje de inhibición del DPPH de Hibiscus escobariae,
Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus, frente al ácido ascórbico,
realizando un test de Anova simple, mediante el paquete estadístico Statgraphics
Plus.
39
CAPÍTULO IV
4.1 RESULTADOS
4.1.1 Tamizaje fitoquímico
4.1.1.1 Hibiscus escobariae
La Tabla 1 resume los resultados de los metabolitos secundarios
presentes en Hibiscus escobariae. Los alcaloides se presentaron en bajas
proporciones. Los flavonoides se presentaron de manera abundante en los dos
ensayos realizados. Los taninos al igual que los flavonoides fueron abundantes.
Esteroles y triterpenos se presentaron en cantidades moderadas. Quinonas,
antraquinonas y saponinas estuvieron ausentes.
Tabla 1: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de Hibiscus escobariae
Metabolitos Ensayo Hibiscus escobariae
Alcaloides Reactivo Mayer
Reactivo Bouchardat
Reactivo Wagner
Reactivo Dragendorff
+
-
-
+
Flavonoides Reactivo Shinoda
NaOH 10%
+++
+++
Taninos FeCl3 +++
Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky
Reactivo Liebermann-Burchard
+
++
Quinonas y
antraquinonas
Reactivo Borntrager
H2SO4
-
-
Saponinas Espuma -
Clave: Nivel de precipitación en Alcaloides e intensidad de color en flavonoides, taninos,
esteroles y triterpenos, quinonas y antraquinonas: Ausente (-), Bajo (+), Moderado (++),
Abundante (+++). Saponinas: Espuma: Ausente (-), Pobre (< 3mm), Moderado (>6mm),
Abundante (>8mm).
40
4.1.1.2 Loxopterygium huasango
En la Tabla 2 resume los resultados del tamizaje fitoquímico del extracto
etanólico obtenido de hojas Loxopterygium huasango. Los alcaloides,
flavonoides, taninos, quinonas y antraquinonas se presentaron en proporciones
abundantes; mientras que los esteroles, triterpenos y saponinas se presentaron
en bajas proporciones.
Tabla 2: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas Loxopterygium huasango
Metabolitos Ensayo Loxopterygium huasango
Alcaloides Reactivo Mayer
Reactivo Bouchardat
Reactivo Wagner
Reactivo Dragendorff
+++
++
+
++
Flavonoides Reactivo Shinoda
NaOH 10%
+++
+++
Taninos FeCl3 +++
Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky
Reactivo Liebermann-Burchard
+
-
Quinonas y
antraquinonas
Reactivo Borntrager
H2SO4
+++
-
Saponinas Espuma 3mm
Clave: Nivel de precipitación en Alcaloides e intensidad de color en flavonoides, taninos,
esteroles y triterpenos, quinonas y antraquinonas: Ausente (-), Bajo (+), Moderado (++),
Abundante (+++). Saponinas: Espuma: Ausente (-), Pobre (< 3mm), Moderado (>6mm),
Abundante (>8mm).
41
4.1.1.3 Croton ferrugineus
Los flavonoides y taninos fueron abundantes en todos los ensayos
realizados. Los alcaloides, esteroles, triterpenos, quinonas, antraquinonas y
saponinas se presentaron en bajas proporciones (Tabla 3).
Tabla 3: Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico obtenido de hojas de Croton ferrugineus
Metabolitos Ensayo Croton ferrugineus
Alcaloides Reactivo Mayer
Reactivo Bouchardat
Reactivo Wagner
Reactivo Dragendorff
-
-
-
+
Flavonoides Reactivo Shinoda
NaOH 10%
+++
+++
Taninos FeCl3 +++
Esteroles y triterpenos Reactivo Salkwosky
Reactivo Liebermann-Burchard
+
+
Quinonas y
antraquinonas
Reactivo Borntrager
H2SO4
+
-
Saponinas Espuma 3 mm
Clave: Nivel de precipitación en Alcaloides e intensidad de color en flavonoides, taninos,
esteroles y triterpenos, quinonas y antraquinonas: Ausente (-), Bajo (+), Moderado (++),
Abundante (+++). Saponinas: Espuma: Ausente (-), Pobre (< 3mm), Moderado (>6mm),
Abundante (>8mm).
42
4.1.2 Cuantificación de flavonoides
La curva de calibración obtenida para la cuantificación de flavonoides
totales mediante el uso de quercetina como estándar se muestra en la Gráfico 1.
Gráfico 1: Curva de calibración usando quercetina como estándar
Los resultados de la Tabla 4 muestran el contenido total de flavonoides de
las tres plantas evaluadas:
Hibiscus escobariae, presentó un contenido total de flavonoides de
100,95 ± 1,73 mg CE/g extracto.
Loxopterygium huasango presentó un contenido total de flavonoides de
995,42 ± 3,16 mg CE / g extracto.
Croton ferrugineus presentó un contenido total de flavonoides de 190,50
± 0,83 mg CE / g extracto.
Tabla 4: Contenido total de Flavonoides
Especie Flavonoides totales (mg CE / g extracto)
Hibiscus escobariae
Loxopterygium huasango
Croton ferrugineus
100,95 ± 1,73
995,42 ± 3,16
190,50 ± 0,83
y = 0,00045x + 0,067R² = 0,997
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0 200 400 600 800
Ab
sorb
anci
a
Concentración g CE/mL
43
4.1.3 Cuantificación de fenoles
La curva de calibración obtenida para la cuantificación de fenoles totales
mediante el uso de ácido gálico como estándar se muestra en la Gráfico 2.
Gráfico 2: Curva de calibración usando ácido gálico como estándar
Los resultados mostrados en la Tabla 5 indican el contenido total de
fenoles de las tres plantas evaluadas:
Hibiscus escobariae obtuvo un contenido total de fenoles de 12,24 ± 0,22
mg GAE/ g extracto.
Loxopterygium huasango presentó un contenido total de fenoles de
314,72 ± 1,91 mg GAE/ g extracto.
Croton ferrugineus presentó un contenido total de fenoles de 10,17 ± 0,22
mg GAE/ g extracto.
Tabla 5: Contenido total de fenoles
Especie Fenoles (mg GAE/ g extracto)
Hibiscus escobariae
Loxopterygium huasango
Croton ferrugineus
12,24 ± 0,22
314,72 ± 1,91
10,17 ± 0,22
y = 0,0071x + 0,0226R² = 0,9961
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 50 100 150 200 250
Ab
sorb
anci
a
Concentración g GAE/ mL
44
4.1.4 Actividad antioxidante
En la Tabla 12 se muestran los resultados de Hibiscus escobariae, que
obtuvo un porcentaje de inhibición del radical DPPH de 47,33 ± 1,26, menor al
requerido para calcular la concentración de inhibición del 50% (IC50).
Loxopterygium huasango presentó un porcentaje de inhibición del 92,97
± 0.81, con una concentración de inhibición del 50% de 0,1 mg/mL (Tabla 12).
La concentración de inhibición del 50% (IC50) se calculó con la ecuación de la
recta (y= 286,36x+20,756) R² = 0,989, obtenido de la curva de referencia del
patrón analizado (Gráfico 3).
Croton ferrugineus presentó un porcentaje de inhibición de 82,95 ± 0,35,
con un IC50 de 0,7 mg/mL (Tabla 2). La concentración de inhibición del 50% (IC50)
se calculó con la ecuación de la recta (y=50,926x+15,046) R² = 0,985, obtenido
de la curva de referencia del patrón analizado (Gráfico 4).
Tabla 6: Actividad antioxidante de los extractos etanólicos de hojas de tres especies de plantas del Ecuador
Especie Porcentaje de inhibición (%) IC50 mg/mL
Hibiscus escobariae
Loxopterygium huasango
Croton ferrugineus
47,33 ± 1,26
92,97 ± 0.81
82,95 ± 0,35
-
0,1
0,7
Clave: IC50: Concentración de inhibición del 50%; (-) Ausente
Gráfico 3: Actividad antioxidante de Loxopterygium huasango
y = 286,36x + 20,756R² = 0,9892
0
20
40
60
80
100
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Po
rcen
taje
Concentración mg/mL
45
Gráfico 4: Actividad antioxidante de Croton ferrugineus
En el Gráfico 5, se compara el porcentaje de inhibición del radical DPPH
de las tres especies evaluadas frente al ácido ascórbico. Se puede observar que
la especie Hibiscus escobariae presentó un 47,33% de inhibición, mostrando una
gran diferencia frente al porcentaje de inhibición del ácido ascórbico que fue de
95,32%. Loxopterygium huasango presentó un porcentaje de inhibición del
92,97%, siendo muy similar al del ácido ascórbico con un 95,32%. Croton
ferrugineus presentó un porcentaje de inhibición del radical DPPH del 82,95%,
estando cerca al porcentaje de inhibición de 95,32% del ácido ascórbico.
Gráfico 5: Comparación del porcentaje de inhibición de radical DPPH de las especies evaluadas frente al ácido ascórbico (control).
y = 50,926x + 15,046R² = 0,9858
0
10
20
30
40
50
60
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Po
rcen
taje
Concentración mg/mL
95,48
47,33
92,97
82,95
0
20
40
60
80
100
120
Po
rcen
taje
Ácido ascórbico Hibiscus escobariae
Loxopterygium huasango Croton ferrugineus
46
4.1.5 Actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae, sobre Bacillus subtilis
produjo un halo de inhibición de 13,5 mm con una concentración mínima
inhibitoria (CMI) de 100 mg / mL y frente a Listeria monocytogenes con un halo
de inhibición de 7,4 mm con una CMI de 50 mg / mL (Tabla 6). En cambio,
Hibiscus escobariae, no presentó ninguna actividad antibacteriana frente a las
bacterias Gram negativas (Tabla 7).
Tabla 7: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram positivas
Zona del halo de inhibición (mm) Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram
positivas
20
mg/mL
50
mg/mL
100
mg/mL
200
mg/mL
CRO SXT P
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Bacillus subtilis ATCC
6633
Listeria monocytogenes
ATCC 19115
NI
NI
NI
NI
NI
7,4
NI
13,5
7,75
NI
19
8,4
13,5
30
18
NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P:
Penicillin G (10 µg)
Tabla 8: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Hibiscus escobariae en bacterias Gram negativas
Zona del halo de inhibición (mm)
Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram negativas 20
mg/mL
50
mg/mL
100
mg/mL
200
mg/mL
CN TOB TE
Escherichia coli ATCC
25922
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15442
Vibrio parahaemolyticus
ATCC 17802
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
22
22
27
NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline
(30 µg)
47
Loxopterygium huasango mostró inhibición frente a las bacterias Gram
positivas evaluadas, mostrando una zona del halo de inhibición de 9 mm frente
a Staphylococcus aureus, 10,5 mm frente Bacillus subtilis, ambas con una CMI
de 5 mg/mL, mientras que Listeria monocytogenes obtuvo un halo de inhibición
de 8mm con una CMI de 2,5 mg/mL (Tabla 8).
Loxopterygium huasango presentó actividad antibacteriana frente a las
bacterias Gram negativas evaluadas, obteniendo un halo de inhibición de 7,75
mm para Escherichia coli, 10,25 mm en Pseudomonas aeruginosa y 9,5 mm en
Vibrio parahaemolyticus, todas presentaron una CMI de 2,5 mg/mL (Tabla 9).
Tabla 9: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram positivas
Zona del halo de inhibición (mm)
Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram
positivas
2,5
mg/mL
5
mg/mL
10
mg/mL
15
mg/mL
20
mg/mL
CRO SXT P
Staphylococcus
aureus ATCC 25923
Bacillus subtilis
ATCC 6633
Listeria
monocytogenes
ATCC 19115
NI
NI
8
9
10,5
9
10
12,2
10
12,5
13,5
12,2
14,5
15,5
13,5
13,5
30
18
NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P:
Penicillin G (10 µg)
Tabla 10: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Loxopterygium huasango en bacterias Gram negativas
Zona del halo de inhibición (mm)
Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram
negativas
2,5
mg/mL
5
mg/mL
10
mg/mL
15
mg/mL
20
mg/mL
CN TOB TE
Escherichia coli
ATCC 25922
Pseudomonas
aeruginosa ATCC
15442
Vibrio
parahaemolyticus
ATCC 17802
7,75
10,25
9,5
9,25
11,75
12,5
11,5
13
15
13,25
15
17,5
14,5
17,75
20,5
22
22
27
NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline
(30 µg)
48
Croton ferrugineus no presentó inhibición antibacteriana frente a las
bacterias Gram positivas (Tabla 10) y en presencia de Escherichia coli, mostró
un halo de inhibición de 8 mm con un CMI de 200 mg/mL (Tabla 11).
Tabla 11: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram positivas
Zona del halo de inhibición (mm)
Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram positivas 20
mg/mL
50
mg/mL
100
mg/mL
200
mg/mL
CRO SXT P
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Bacillus subtilis ATCC
6633
Listeria monocytogenes
ATCC 19115
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
13,5
30
18
NI: No presentó inhibición. CRO: Ceftriaxone (30 µg); STX: Sulfamethoxazole (25 µg); P:
Penicillin G (10 µg)
Tabla 12: Actividad antibacteriana del extracto etanólico de Croton ferrugineus en bacterias Gram negativas
Zona del halo de inhibición (mm)
Antibióticos de
referencia
Bacterias Gram negativas 20
mg/mL
50
mg/mL
100
mg/mL
200
mg/mL
CN TOB TE
Escherichia coli ATCC 25922
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 15442
Vibrio parahaemolyticus
ATCC 17802
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
NI
8
NI
NI
22
22
27
NI: No presentó inhibición. CN: Gentamicin (10 µg); TOB: Tobramicina (10 µg); TE: Tetracycline
(30 µg)
4.1.6 Análisis estadístico
Puesto que el p-valor del test de Anova simple fue inferior a 0,05, hubo
diferencia significativa estadísticamente entre las medias de la actividad
antioxidante de una especie a otra con el ácido ascórbico, para un nivel de
confianza del 95%.
49
DISCUSIÓN
Hibiscus escobariae
Hibiscus escobariae (Malvaceae), presentó poco contendido de
alcaloides, esteroles y triterpenos; los flavonoides y taninos fueron abundantes,
mientras que las quinonas, antraquinonas y saponinas estuvieron ausentes. La
presencia de estos metabolitos y ausencia de saponinas coincide con los
resultados reportados por Prasad (2014), para las especies del género Hibiscus
(Serban et al., 2015). La presencia de estos metabolitos le otorgaría a H.
escobariae, las propiedades antimicrobiana, antioxidante, antiespasmódica,
antipirética, diurética, cardioprotectora, entre otras, que presentan las especies
de su mismo género (Vasudeva et al., 2008).
Las hojas de Hibiscus escobariae presentaron elevados contenidos de
flavonoides con un total de 100,95 mg CE/g de extracto y de fenoles con un total
de 12,24 mg GAE/g de extracto. Estos valores son muy cercanos al contenido
de fenoles totales de la especie Hibiscus sabdariffa con 14,18 mg GAE/ g de
extracto (Vivas et al., 2014). H. escobariae no presentó actividad antioxidante a
pesar de tener elevados contenidos de flavonoides y fenoles; lo cual difiere de
los estudios realizados a otras especies de su mismo género. Medina et al.
(2013) y Reyes et al. (2015), afirman que la estructura química y concentraciones
de antocianinas y otros polifenoles presentes en las flores y cáliz son los
responsables de la actividad antioxidante en Hibiscus sabdariffa. Probablemente
esta sea la razón por la cual H. escobariae no expresó inhibición mayor al 50%
del DPPH, debido a que en el presente trabajo se utilizó el extracto de hojas;
mientras que en los otros trabajos realizados a distintas especies de Hibiscus se
emplearon otras partes aéreas de la planta excepto sus hojas (Gomes et al.,
2010).
Diversos estudios confirman que los flavonoides y taninos son los
responsables de la actividad antibacteriana y antioxidante (Serban et al., 2015;
Buckholz et al., 2016; Carretera y Ortega, 2017). Posiblemente el alto contenido
de flavonoides y taninos que presentó H. escobariae, sean los responsables de
50
la actividad antibacteriana frente a Bacillus subtilis (CMI 100 mg/mL) y frente a
Listeria monocytogenes (CMI 50 mg/mL); lo cual coincide con los estudios
realizados por Chung et al. (2004), quienes mencionan que los extractos
evaluados de diferentes especies de la familia Malvaceae no presentaron
inhibición frente a bacterias Gram negativas. Probablemente este resultado sea
debido a la cápsula externa de lipopolisacárido y lipoproteína, que poseen las
bacterias; las cuales son resistentes a compuestos antibacterianos (Alzoreky et
al., 2003). Sin embargo, los resultados presentados difieren de la especie
Hibiscus sabdariffa; la cual obtuvo inhibición frente a Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa observándose una CMI de 25 a 200 mg/mL (Sulaiman
et al., 2014).
Loxopterygium huasango
Loxopterygium huasango (Anacardiaceae), presentó alcaloides,
flavonoides, taninos, quinonas y antraquinonas en proporciones abundantes;
mientras que los esteroles, triterpenos y saponinas, presentaron poco contenido.
Estos resultados coinciden con los metabolitos secundarios reportados por
Bussman et al. (2009). La presencia de estos metabolitos es común en la familia
Anacardiaceae (Suzimone et al., 2006).
Se ha reportado que los altos contenidos de flavonoides y taninos son los
responsables de la actividad antibacteriana, antioxidante, citotóxica, diaforética,
antiinflamatoria y antiviral, en diversas especies de la familia Anacardiaceae;
mientras que los alcaloides, le otorga propiedades analgésicas y anestésicas; y
las quinonas y antraquinonas son las responsables de actuar como laxantes
(Silva et al., 2015; Atto et al., 2016; Pérez et al., 2012; Sepúlveda et al., 2003;
Bustamante et al., 2010). La presencia de estos metabolitos secundarios en L.
huasango confirmaría su uso en la medicina tradicional como antiviral,
diaforético, anestésico, repelente y catártico (Bussman, et al., 2009; Aguirre,
2012).
51
A pesar de que hubo diferencia significativa estadísticamente entre L.
husango y el ácido ascórbico, el porcentaje de inhibición del radical DPPH en L.
huasango fue de 92,97%, cercano al del ácido ascórbico (Vitamina C) que obtuvo
un porcentaje del 95,48%. Lo que coincide con los estudios realizados por
Sanchez et al. (2000), quienes mencionan que la actividad antioxidante
presentes en los compuestos fenólicos en algunos géneros de la familia
Anacardiaceae, se debe a capacidad funcional de excelentes captores de
radicales libres, ejerciendo efecto inhibitorio sobre la peroxidación de
fosfolípidos. Además, de presentar una mejor actividad antioxidante que la
vitamina C, E y β-carotenos. Estudios realizados por Garrido et al. (2004),
mencionan que los flavonoides de tipo biflavonoides y otros compuestos
fenólicos comunes en algunas especies de la familia Anacardiaceae, son el
componente principal de una marca de productos antioxidantes 100% naturales
denominada VIMANG®. Por lo tanto, L. huasango al haber presentado un
porcentaje de inhibición del DPPH cercano al del ácido ascórbico, podría ser
empleado para la creación de nuevos fármacos naturales con capacidad
antioxidante.
El extracto de L. huasango, presentó una excelente actividad
antibacteriana frente a todas las bacterias Gram positivas y Gram negativas
evaluadas y a mínimas concentraciones (2,5 – 5 mg/mL). Probablemente la
actividad antibacteriana determinada en L. huasango se deba al elevado
contenido de flavonoides y taninos analizados, lo que confirman los estudios
realizados por Suzimone et al. (2006), quienes mencionan que los compuestos
fenólicos presentes en la familia Anacardiaceae son los responsables de la
actividad inhibitoria frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas, debido
a que en su estructura poseen una hidroxilación en el anillo B, lo cual inhibe la
síntesis de ADN y ARN de las bacterias (López, 2010).
Croton ferrugineus
Croton ferrugineus (Euphorbeaceae), en el tamizaje fitoquímico presentó
elevadas cantidades de flavonoides y taninos, mientras que los alcaloides,
52
esteroles, triterpenos, quinonas, antraquinonas y saponinas se presentaron en
bajas proporciones. Los metabolitos presentes en Croton ferrugineus son
comunes a los reportados en distintas especies del género Croton (Barrera et
al., 2016). Se han realizado diversos trabajos de aislamiento de alcaloides,
flavonoides, taninos y terpenoides a los cuales se le atribuyen actividades
biológicas como: antimicrobianas, antiinflamatorias, cardiotónicas y
espasmolíticas (Wen et al., 2018; Salatino et al., 2007, Ordoñez, 2016).
El alto contenido de flavonoides y taninos que presentó Croton
ferrugineus, podría ser el responsable de la actividad antioxidante cercana a la
del ácido ascórbico (Vitamina C). Estos resultados son similares a los obtenidos
por Altamirano (2015), quién evaluó la presente actividad con cuatro especies
del género Croton, donde menciona que todas presentaron una actividad
antioxidante similar a la del ácido ascórbico. En diversas especies del género
Croton se ha encontrado la presencia de flavonoides de tipo flavonoles y flavonas
y taninos como proantocianidinas, responsables de la propiedad antioxidante
debido a los grupos hidroxilos que presentan en el anillo B y la doble ligadura
que se presentan en algunos flavonoides en el anillo C (Salatino et al., 2007;
Bors et al., 1990).
A pesar de que Croton ferrugineus obtuvo elevados contenidos de
flavonoides y fenoles totales, solo presentó actividad antibacteriana frente a
Escherichia coli, lo que difiere de la especie C. laui, que presentó inhibición
frente a bacterias Gram positivas como: Staphylococcus aureus y Bacillus
subtilis, al igual que Croton thurifer que también obtuvo actividad frente Bacillus
subtilis (Liu et al., 2014; Quintero 2017). Sin embargo estudios realizados por
Romero (2015), de actividad antibacteriana en la especie Croton elegans frente
a Staphylococcus aureus y Pseudomonas aureginosa evidenciaron que no hubo
actividad frente a las cepas mencionadas. Por lo tanto, las actividades
antibacterianas de las especies del género Croton van a variar de una especie a
otra debido a la diversidad química que presenta (Barrera et al., 2016).
53
CONCLUSIONES
• En el presente estudio la mayoría de compuestos activos estuvo presentes
en las tres especies evaluadas; sin embargo, los metabolitos que se
presentaron en cantidades abundantes fueron los flavonoides y taninos.
Loxopterygium huasango fue la que más presentó compuestos activos,
obteniendo aparte de abundantes contenidos de flavonoides y fenoles, la
presencia de alcaloides, quinonas y antraquinonas en abundancia, mientras
que las saponinas solo estuvieron presentes en Loxopterygium huasango y
Croton ferrugineus.
• Los mayores contenidos de flavonoides totales se observaron en
Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus, con 995,42 ± 3,16 y 190,50
± 0,83 mg CE/g de extracto; y el mayor contenido de fenoles totales lo
obtuvieron Loxopterygium huasango e Hibiscus escobariae, con 314,72 ±
1,91 y 12,24 ± 0,22 mg GAE/g de extracto. De acuerdo a los resultados
obtenidos, Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus fueron las que
obtuvieron la mejor actividad antioxidante, por lo que podría usarse en un
futuro para la elaboración de nuevos fármacos con capacidades
antioxidantes.
• De acuerdo a los resultados obtenidos en la evaluación de actividad
antibacteriana, las especies Hibiscus escobariae y Loxopterygium huasango
podrían considerarse como una nueva fuente natural para la elaboración de
productos antibacterianos, sobretodo la especie Loxopterygium huasango
que mostró el mejor resultado contra todas las bacterias evaluadas,
presentando concentraciones mínimas inhibitorias de 2,5 a 5 mg/mL;
mientras que Hibiscus escobariae solo presentó actividad frente a Bacillus
subtilis y Listeria monocytogenes causantes de enfermedades infecciosas.
54
RECOMENDACIONES
• Hibiscus escobariae y Loxopterygium huasango al haber presentado
actividad antibacteriana contra algunas de las cepas evaluadas, son
especies promisorias recomendadas para realizar pruebas para la
bioprospección de nuevos antibióticos.
• Los resultados de actividad antibacteriana y antioxidante de Loxopterygium
huasango muestran que es una especie rica en principios activos. Por esta
razón es importante evaluar en L. huasango otro tipo de actividades
biológicas como: antifúngica, citotóxica, alelopática, antiinflamatoria, entre
otras.
• Realizar el aislamiento de metabolitos secundarios de Hibiscus escobariae,
Loxopterygium huasango y Croton ferrugineus para descubrir cuál es el
responsable de las actividades biológicas que poseen.
• Realizar estudios biodirigidos de los metabolitos secundarios presentes en
los extractos de estas plantas, donde su aplicación esté orientada a la
industria farmacéutica, de alimento, entre otras.
55
REFERENCIAS
Aguirre, Z. 2012. Especies forestales de los bosques secos del Ecuador. Guía
dendrológica para su identificación y caracterización. Proyecto Manejo
Forestal Sostenible ante el Cambio Climático. MAE/FAO - Finlandia.
Quito, Ecuador. 140 p.
Ahumada, A., Ortega, A., Chito, D., Benítez R. 2016. Saponinas de quinua
(Chenopodium quinoa willd): Un subproducto con alto potencial biológico.
Grupo de Investigación en Química de Productos Naturales, Universidad
del Cauca, Edificio de los Laboratorios. Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm.
45(3): 438-469.
Alshami, I. y Alharbi, A. 2014. Hibiscus sabdariffa extract inhibits in vitro biofilm
formation capacity of Candida albicans isolated from recurrent urinary tract
infections. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 4: 104-108.
Altamirano, J. 2015. Evaluación de la Actividad antioxidante de cuatro especies
del género Croton. Universidad Central del Ecuador. Quito.
Alzoreky, N., Nakahara, K. 2003. Antibacterial activity of extracts from some
edible plants commonly consumed in Asia. Universidad de Buenos Aires.
International Journal of Food Microbiology.
Arango, G. 2008. Alcaloides y compuestos nitrogenados. Facultad de Química y
Farmacéutica. Universidad de Antioquía. Medellín, Colombia.
Atto, V., Pierre, K., Monteomo, G., Adeoti, M. 2016. Phytochemical Screening of
Sclerocarya birrea (Anacardiaceae) and Khaya senegalensis (Meliaceae),
Antidiabetic Plants. International Journal of Pharmacy and Chemistry.
Ávalos, G. y Pérez, U. 2009. Metabolismo secundario de plantas. Reduca
(Biología). Serie Fisiología Vegetal. 2(3): 119-145.
56
Barrera, A., Gómez, D., Castiblanco, F., 2016. Importancia medicinal del género
Croton (euphorbiaceae). Revista cubana de plantas medicinales.
Universidad Militar Nueva Granada. Bogotá, Colombia.
Bauer, A.W, Kirby, W.M, Sherris, J.C, Turck, M. 1996 Antibiotic susceptibility
testing by a standardized single disc method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493.
Bors, W., Heller, W., Michel, C., Saran, M. 1990. Flavonoids as Antioxidants:
Determination of Radical-Scavenging Efficiencies, Methods Enzymol.
Buchholz, T., Melzig, T. 2016. Medicinal plants traditionally used for treatment of
obesity and diabetes mellitus- screening for pancreatic lipase and a-
amylase inhibition. Phytother.
Buitrón, 2013. Ecuador: uso y comercio de plantas medicinales, situación actual
y aspectos importantes para la conservación. Quito: Traffic International
Bussman, W., Glenn, A., Meyer, K., Rothrock, A. 2009. Phyto-Chemical Analysis
of Peruvian Medicinal Plants. Brown Center, Missouri Botanical Garden,
P.O. Box 299, St. Louis.
Bustamante, J., Botero, E., Carrascal, L. 2010. Estandarización de la técnica
espectrofotométrica (UV-VIS) para la cuantificación de antraquinonas
presentes en productos a base de Aloe vera. Universidad de Pereira
Tecnológica de Pereira, Escuela de Química. p. 22.
Carretera, M. y Ortega, T. 2017. Propiedades terapéuticas de Hibisco.
Departamento de Farmacología. Facultad de Farmacia, Universidad
Complutense de Madrid.
CENTRO IDEAS. 2006. Estudio Fenológico de Especies Forestales Nativas de
Bosques Seco Alto Piura. Piura, Perú. 191 p.
Chaouche, T., Haddouchi, F., Ksouri, R., Medini, F., El-Haci, A., Boucherit, Z.
2013. Antioxidant activity profiling by spectrophotometric methods of
phenolic extract of Prasium majus L. Free rad Antiox.
57
Chavesta, M. 2005. Madera para pisos. Departamento de industrias forestales.
UNALM (Universidad Nacional Agraria La Molina). Lima, PE. 176 p.
Chung, P., Chung, L., Ngeow, Y., Goh, S., Imiyabir, Z. 2004. Antimicrobial
activities of Malaysian plant species. Pharmaceutical Biology.
Conde, V., 2015. Procesos biotecnológicos para la proliferación y enraizamiento
in vitro de Hualtaco Loxopterygium huasango Spruce ex Engl.,
proveniente del bosque seco de la provincia de Loja. Loja- Ecuador.
Cos, P., Vlietinck, A., Berghe, D., y Maes, L. 2006. Anti-infective potential of
natural products: How to develop a stronger in vitro «proof-of-concept».
Journal of Ethnopharmacology, 106(3): 290-302.
Cuadrado, L. 2004. Estudio Bromatológico y Fitoquímico de la Jicama
(Smallanthus sonchifolia) para determinar el tiempo óptimo de cosecha.
Riobamba, EC. Escuela Superior Politécnica de Chimborazo.
Cushnie, T., Lamb, A. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Elsevier and the
International Society of Chemotherapy International Journal of Anticrobial
Agents.
Da Costa, I., Bonnlaender, B., Sievers, H., Pischel, I., Heinrich, M. 2014. Hibiscus
sabdariffa L.–A phytochemical and pharmacological review. Food
Chemistry 165: 424-443.
Domínguez, X. 1979. Métodos de Investigación fitoquímica Editorial Limusa.
México.
Faraji, M., Tarkhani, A. 1999: The effect of sour tea (Hibiscus sabdariffa) on
essential hypertension. J. Ethnopharmacol. 65: 231–236.
Fernández, F., López, J., Ponce, L., y Machado, C. 2003. Resistencia
bacteriana. Revista Cubana de Medicina Militar.
Gangrade, H., Mishra, S., Kaushal, R. 1979. Antimicrobial activity of oil and
unsaponifiable matter of red roselle. Indian Drugs 16: 147–148.
58
Garrido, G., González, D., Lemus, Y., García, D., Lodeo, L., Quintero,
G., Delporte, C., Nunes, A., Delgado, R. 2004. In vivo and in vitro anti-
inflammatory activity of Mangifera indica L. extract (VIMANG®)
Pharmacol.
Gehrke, I., Neto, A., Pedroso, M., Mostardeiro, C., Da Cruz, I., Silva, U., Ilha,
V., Dalcol, I., Morel, A., 2013. Antimicrobial activity of Schinus lentiscifolius
(Anacardiaceae). Center for Research in Natural Products (NPPN),
Universidad Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil.
Gomes, M., Da Costa, R., Moreira, R., Pegas, J., Lígia, L., Saffi, J. 2010
Pharmacological evidences for the extracts and secondary metabolites
from plants of the genus Hibiscus. Laboratório de Genética Toxicológica.
Food Chemistry.
Goupy, P., Dufour, C., Loonis, M. y Dangles, O., 2003. Quantitive kinetic analysis
of hydrogen transfer reaction from dietary polyphenols to the DPPH
radical. J Agric Food Chem.
Govaerts R. 2018. Croton ferrugineus. World checklist of selected plant families
(WCSPF)
Goycochea, R. 2010. Evaluación de taninos y goma del fruto de la Tara
Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze provenientes de las lomas de
Atiquipa. Arequipa – Perú. Universidad Nacional Agraria de la Molina.
106p.
Guacuja, E. 1995. Contribución al Estudio Fitoquímico y determinación de la
acción antimicrobiana de Senecio candidissimus. Obtenido de
Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas.
Havsteen, B. 1993. Flavonoids: A class of natural products of high
pharmacological potency. Biochem Pharmacol.
Henderson, M., Miranda, C., Stevens, J., Deinzer, M., Buhler, D. 2000. In vitro
inhibition of human P450 enzymes by prenilated flavonoids from hops.
Humulus lupuls. Xenoiotica.
59
Jain, R., Arora, R., Jain, S. 1997. Chemical constituents and bioactivity studies
of Hibiscus micranthus Linn. Indian J Pharm Sci Mar–Apr: 91–93.
Jørgensen, P.M. y S. León-Yánez (eds.). 1999. Catalogue of the vascular plants
of Ecuador. Monogr. Syst. Bot. Missouri Bot. Gard. 75(i–viii): 1–1182.
Jørgensen, P.M., Ulloa Ulloa, C. y Maldonado, C. 2006. Riqueza de plantas
vasculares. 37–50. En: M. Moraes, B. Øllgaard, L.P. Kvist, F. Borchsenius
y H. Balslev (eds.), Botánica económica de los Andes centrales.
Universidad Mayor de San Andrés; Plural Editores, La Paz.
Kholkute, S.D, Mudgal, V., Udupa, K.N. 1977. Studies on the antifertility
potentiality of Hibiscus rosa-sinensis. Parts of medicinal value: Selection
of species and seasonal variations. Planta Med. 31: 35–39.
Kongkathip, N., Dhumma-upakorn, P., Kongkathip, B., Chawananoraset, K.,
Sangchomkaeo, P. y Hatthakipanichakul, S. 2002. Study on cardiac
contractility of cicloeucalenol and isolated from Tinospora crispa. Journal
of Etnopharmacology.
Kuete, V., Nguemeving, J., Beng, V., Blaise, A., Etoa, F., Meyer, M., Bodo, B.,
Nkengfack, A. 2007. Antimicrobial activity of the methanolic extracts and
compounds from Vismia laurentii De Wild (Guttiferae). Journal of
ethnopharmacology. 109(1): 372–379.
Kuklinski, C. 2000. Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias
medicamentosas de origen natural. 1ª ed. Ed. Ediciones Omega S.A.
España.
Lee, J., Koo, N., Min. 2004. Reactive oxygen species, aging, and antioxidative
nutraceuticals. Comp Rev Food Sci Saf.
Lincoln, T. y Zeiger, E. 2006. Fisiología Vegetal I. 3ª ed. Publicaciones de la
Universidad Jaume I. pp. 529.
60
Liu, C., Wang, J., Chu, C., Cheng, M., Tseng, T. 2002. In vivo protective effect
of protocatechuic acid on tert-butyl hydroperoxide-induced rat
hepatotoxicity. Food Chem Toxicol.
Liu, C.P., Xu, J.B., Zhao, J.X., Xu, C.H., Dong, L., Ding, J., Yue, J.M. 2014.
Diterpenoids from Croton laui and their cytotoxic and antimicrobial
activities. J. Nat. Prod.
Lizcano, A., Vergara, J. 2008. Evaluación de la actividad antimicrobiana de los
extractos etanólicos y/o aceites esenciales de las especies vegetales
Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y
Passiflora manicata frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos.
Bogotá, CO. Pontificia Universidad Javeriana. 131p.
Lock, O. 1998. Investigación Fitoquímica. 1ª ed. Ed. Pontificia Universidad
Católica del Perú. pp 1–3. Domínguez X. Métodos de Investigación
Fitoquímica. 1ª ed.
López, E. 2007. Estudio fitoquímico y aproximación genética en especies de la
sección Plinthine del Género Arenaria (Caryophyllaceae). Tesis Doctoral.
Granada, ES. Universidad de Granada. 186p.
López, M. 2010. Determinación de la actividad biológica de flavonoides y su
identificación por electroforesis capilar en plantas medicinales. Instituto
Técnico Nacional de México.
Martínez, A. 2012. Quinonas y compuestos relacionados. Facultad de química y
farmacia. Universidad de Antioquía. Medellín, Colombia.
Medina, E., Sumaya, M., Machuca, L., Sánchez-Herrera, R., Balois y Jiménez.
2013. Actividad antioxidante de extractos de cálices deshidratados de 64
Variedades de jamaica (Hibiscus Sabdariffa L.) en función de fenólicos y
antocianinas totales. Revista Ciencias Técnicas Agropecuarias 22: 41-44.
Merck, S.A. 2000. Industrias Químicas: Bioflavonoides: Quercetina y Rutina.
Informe a Profesionales.
61
Meza, M. 2011. Análisis de flavonoides en plantas medicinales por electroforesis
capilar y determinación de su actividad biológica. Unidad Profesional
Interdisciplinaria de Biotecnología.
Montúfar, R. y Pitman, N. 2004. Hibiscus escobariae. 2006. IUCN Red List of
Threatened Species.
Montúfar, R. y Pitman, N. 2004. Hibiscus escobariae. La Lista Roja de Especies
Amenazadas 2004 de la UICN: e.T45624A11008022.
Naranjo, P., Escaleras, R. 1995. La Medicina Tradicional en el Ecuador.
Corporación Editora Nacional, Quito.
Ncube, N., Afolayan, A., Okoh, O. 2008. Assessment techniques of antimicrobial
properties of natural compounds of plant origin: current methods and
future trends. African Journal of Biotechnology.
Neill, D.A., Ulloa-Ulloa, C., 2011. Adiciones a la Flora de Ecuador: Segundo
Suplemento, 2005–2010.
Nenadis, N., Lazaridou, O., Tsimidou, M. 2007. Use of reference compounds in
antioxidant activity assessment. Agric. Food. Chem.
Novello, C.R., Marques, L.C., Pires, M.E., Kutschenco, A.P., Nakamura, C.V.,
Nocchi, S., Sarragiotto, M.H., Mello, J. 2016. Bioactive indole alkaloids
from Croton echioides. J. Braz. Chem. Soc.
Ordoñez, L. 2016. Evaluación antibacteriana de los extractos de Croton elegans
frente a Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumoniae y Streptococcus mutans, patógenos de enfermedades
respiratorias. Universidad Politécnica Salesiana, sede Quito.
Organización Mundial de la Salud. 2018. Estrategia de Cooperación de la salud.
Departamento de Sistemas y Servicios de Salud de la Base Global de
Gastos en Salud.
Osorio, E. 2014. Farmacognosia aspectos básicos. Facultad de química y
farmacia. Universidad de Antioquía. Medellín, Colombia.
62
Pace, C., Hahn, S., Diamandis, E., Soleas, G., Goldberg, D. 1995. The red wine
phenolics trans-resveratrol and quercitin block human platelet aggregation
in eicosanoid synthesis: implication for protection against coronary heart
disease. Clin. Chim. Acta. 235: 207-219.
Palacios, M. 2009. Metabolitos primarios y secundarios. Universidad Católica
“Los ángeles de Chimbote”. Escuela de farmacia y bioquímica.
Paredes, O., Cervantes, M., Vigna, M., Hernández. T., 2010. Berries improving
human health and healthy aging and promoting quality life. Plant Foods
human Nutr.
Parmar, N., Ghosh, M.1978. Antiinflammatory activity of gossypin, a bioflavonoid
isolated from Hibiscus viti-folius Linn. Indian J. Pharmacog. 10: 277–293.
Peres, W. 1994 Radicais Livres em nïveis biológicos. Ed. Universidad Católica
de Pelotas, Brasil.
Pérez, Y., Rivero, R., Suárez, L., González, M., Hung, B. 2012. Phytochemical
Caracterization the Extracts of Spondias mombin L. (Anacardiaceae).
Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Santiago de
Cuba, Cuba.
Pham-Huy, 2008. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int. J. Biomed
Sci.
Picaso, J. 2000. Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los
antimicrobianos. Procedimiento en microbiología clínica.
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica.
Prasad, M. 2014. In vitro Phytochemical Analysis and Antioxidant Studies of
Hibiscus Species. Department of Biotechnology, Sangenomics Research
Labs, Domlur Layout, Bangalore, India.
Puupponen, P., Nohynek, L., Meier, C., KaÈhkoÈnen, M., Heinonen, M., Hopia,
A., y Oksman, I. 2001. Antimicrobial properties of phenolic compounds
63
from berries. VTT Biotechnology, and University of Helsinki. Department
of Applied Chemistry and Microbiology. Food Chemistry Division.
University of Helsinki. Finland.
Queiroga C., Silva G., Dias P., Possenti A. y De Carvalho J. 2000. Evaluation
of the antiulcerogenic activity of friedelan-3beta-ol and friedelin isolated
from Maytenus ilicifolia (Celastraceae). Journal of Etnopharmacology.
72(3): 465-8.
Quintero, N. 2017. Estudio comparativo de la actividad antibacteriana y
antioxidante de los extractos etanólicos de Croton thurifer Kunth y Croton
collinus Kunth. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de
Farmacia y Bioquímica.
Reed, J. 2010. Nutritional toxicology of tannins and related polyphenols in forage
legumes. Journal of Animal Science 73: 1516-1528.
Reyes, A., Salinas, Y., Ovando, M., Arteaga, R., Martínez, M. 2015. Análisis de
ácidos fenólicos y actividad antioxidante de extractos acuosos de
variedades de jamaica (Hibiscus sabdariffa L.) con cálices de colores
diversos. Departamento de Ingeniería Agroindustrial. Universidad
Autónoma Chapingo.
Reyes-Luengas, A., Salinas-Moreno, Y., Ovando-Cruz, M., Arteaga-Garibay, R.
y Martínez-Peña, M. 2015. Análisis de ácidos fenólicos y actividad
antioxidante de extractos acuosos de variedades de jamaica (Hibiscus
sabdariffa L.) con cálices de colores diversos. Agrociencia 49: 277-290.
Ringuelet, J., Viña, S. 2013. Productos Naturales Vegetales. 1 ed. Universidad
Nacional de la Plata. La Plata, AR. Editorial de la Universidad de la Plata.
258p.
Rodríguez, C., Gaitán, I., Jairo, M., Zambrano, R. 2007. Análogos de quinonas
naturales con actividad antibacteriana. Scientia Et Technica, vol. XII.
Universidad Tecnológica de Pereira, CO.
64
Romero, L., 2015. Estudio de los Recursos Fitoterapéuticos Ancestrales para su
Conservación y Aprovechamiento Sostenible: “Aislamiento,
caracterización y actividad biológica de metabolitos secundarios de
Croton elegans Kunth”. Universidad Técnica Particular de Loja.
Salatino, A., Salatino, M., Negri, G. 2007. Traditional uses, chemistry and
pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae). J. Braz. Chem.
Sanchez, G., Giuliani, A., Núnez ,J., Davison, G., León, O. 2000. Protective
effects of Mangifera indica L. extract, mangiferin and selected antioxidants
against TPA-induced biomolecules oxidation and peritoneal macrophage
activation in mice. Pharmacol. Res. 2000 42(6): 565-73.
Sánchez, V., Santa, F. 2009. Estudio de antraquinonas presentes en extractos
de mucílagos, y hojas de Aloe vera de plantas cultivadas en la región
cafetera. Universidad tecnológica de Pereira. p. 27-28.
Sepúlveda, J., Porta, H., Rocha, M. 2003. La Participación de los Metabolitos
Secundarios en la Defensa de las Plantas. Revista Mexicana de
Fitopatología.
Serban, C., Sahebkar, A., Ursoniu, S., et al. 2015. Effect of sour tea (Hibiscus
sabdariffa L.) on arterial hypertension: a systematic review and meta-
analysis of randomized controlled trials. J Hypertens.
Sharapin, N. 2000. Cualidades de materia prima para productos
fitofarmacéuticos. Conferencia en el I Curso Iberoamericano de
Fitoterapia Clínica y III Reunión de Coordinación Internacional de
RIPROFITO (Red Iberoamericana de Productos Fitofarmacéuticos).
Guatemala.
Silva, J., Aquino, P., Santos, J., Nascimento, I., Gomes, E., Silva, A., Verissimo,
R., Aquino, T., Araújo, J. 2015. Phytochemical compounds and
pharmacological properties from Schinus molle Linnaeus and Schinus
terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae). Laboratory of Medicinal Chemistry
(LMC), Federal University of Alagoas. Brasil.
65
Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Ravento’s, R.M., 1999. Analysis of total
phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of
Folin-Ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 299: 152–178.
Stoldùlková, E., Man, P., Kolarik, M., Flieger, M. 2010. High-perfomance liquid
chromatography-off line mass spectrometry analysis of anthraquinones
produced by Geosmithia lavendula. Journal of Chromatography 1217:
6296 - 6302.
Sulaiman, F. A., Kazeem, M.O., Waheed, A.M, Temowo, S.O., Azeez, I.O.,
Zubair, F.I., Adeyemi, T.A., Nyang, A. y Adeyemi, O.S. 2014. Antimicrobial
and toxic potential of aqueous extracts of Allium sativum, Hibiscus
sabdariffa and Zingiber officinale in Wistar rats. Journal of Taibah
University for Science 8: 315-322.
Suzimone, C., Juceni, P. 2006. Metabólitos secundários de espécies de
Anacardiaceae. Departamento de química exacta, Universidad Estatal del
Suroeste de Nahía, Brasil.
Tamokou J., Tala M., Wabo H., Kuiate J. y Tane P. 2009. Antimicrobial activities
of methanol extract and compounds from stem bark of Vismia
rubescens. Journal of Ethnopharmacology. 124: 571–575.
Tchakam, P., Lunga, P., Kowa, T., Honore, A., Wabo, H., Tapondjou, L., Tane,
P. y Kuiate, J. 2012. Antimicrobial and antioxidant activities of the extracts
and compounds from the leaves of Psorospermum aurantiacum and
Hypericum lanceolatum. Complementary and Alternative Medicine.
Valencia, R., N. Pitman, S. León-Yánez y P.M. Jørgensen (eds.). 2000. Libro rojo
de las plantas endémicas del Ecuador 2000. Herbario QCA, Pontificia
Universidad Católica del Ecuador, Quito.
Vásquez, G. 2014. Aislamiento de metabolitos secundarios de la corteza de
Spondias purpurea L. Universidad Nacional Autónoma de México.
Vasudeva, N., Sharma, S. 2008 Biologically Active Compounds from the Genus
Hibiscus. Pharmaceutical Biology, 46(3): 145-153
66
Vazquez, F., Alvarez, P., Lopéz, D., Wall-Medrano, Y., De la Rosa, A. 2012.
Taninos hidrolizables y condensados: naturaleza química, ventajas y
desventajas de su consumo. Tecnociencia. 6(2): 84-93.
Villaño, D., Fernández, P., Moya, M., Troncoso, A., García, M. 2007. Radicals
Scavenging ability of polyphenolic compounds towards DPPH free radical.
Talanta.
Villareal, M., Cardoso, A., Ortíz, A., Sharma, A. 2014. Biotecnología para producir
medicina de plantas mexicanas. Universidad Nacional Autónoma de
México. Revista Digital universitaria.
Viña, S., 2017. Curso de Bioquímica y Fitoquímica. Universidad Nacional de la
Plata. Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales.
Vivas, L., Wagner, M., Ricco, R. 2014. Control de calidad farmacobotánico y
fitoquímico de Hibiscus sabdariffa L. Cátedra de Farmacobotánica.
Departamento de Farmacología. Facultad de Farmacia y Bioquímica.
Wen, H.X, Wei, Y.L, Qian, L. 2018. Chemical Constituents from Croton Species
and Their Biological Activities. Key Laboratory for Forest Resources
Conservation and Utilization in the Southwest Mountains of China, Ministry
of Education, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China.
Williams, W., Cuvelier, M., Berset, C., 1995 Use of a free radical method to
evaluate antioxidant activty. LWT Food Sci Technol.
Zambrano, L., Buenaño, M., Mancera, N., y Jimenez, E. 2014. Estudio
etnobotánico de plantas medicinales utilizadas por los habitantes del área
rural de la Parroquia San Carlos, Quevedo, Ecuador.
Zhishen, T., Mengcheng, W., Jianming. 1999. The determination of flavonoid
contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals.
Food Chemistry.
67
ANEXOS
Anexo 1: Pruebas de alcaloides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 2: Prueba Shinoda para flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 3: Prueba de Hidróxido de sodio para flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
68
Anexo 4: Prueba del cloruro férrico para taninos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 5: Prueba Salkowski para esteroles y triterpenos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 6: Prueba Liebermann-Bouchardat para esteroles y triterpenos: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
69
Anexo 7: Prueba Borntrager para quinonas y antraquinonas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 8: Prueba del ácido sulfúrico para quinonas y antraquinonas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 9: Prueba de espuma para saponinas: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
70
Anexo 10: Curva de cuantificación de flavonoides.
Anexo 11: Prueba para la cuantificación de flavonoides: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 12: Prueba de Folin-Ciocalteu para la cuantificación de fenoles: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
71
Anexo 13: Ensayo del radical DPPH para actividad antioxidante: Hibiscus escobariae (A), Loxopterygium huasango (B), Croton ferrugineus (C).
Anexo 14: Actividad antibacteriana de Hibiscus escobariae: Bacillus subtilis (A), Listeria monocytogenes (B).
72
Anexo 15: Actividad antibacteriana de Loxopterygium huasango: Staphylococcus aureus (A),
Bacillus subtilis (B), Listeria monocytogenes (C), Escherichia coli (D), Pseudomonas aeruginosa
(E), Vibrio parahaemolyticus (F).
Anexo 16: Actividad antibacteriana de Croton ferrugineus en Escherichia coli.