ANEXO:

PROYECTO: METABOLITOS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO

PRODUCIDOS POR LEVADURAS. 20060695

RESUMEN

En este proyecto se abordaron aspectos referentes a la producción de amilasas,

proteasas intracelulares y extracelulares y al citocromo P450 relacionado con la

degradación de hidrocarburos en levaduras.

En relación a las amilasas, se realizó una selección primaria para aislar y

seleccionar levaduras, a partir de 292 aislados de diversas fuentes naturales, usando

medios sólidos con almidón al 1%. De esta primera fase, sólo se aislaron 2, de las cuales

una fue la que produjo los mayores niveles de amilasa extracelular en medio Castañeda-

almidón. Con ésta se realizaron estudios cinéticos para ensayar diversos sustratos

amiláceos, obteniéndose los mejores resultados con la harina de trigo. La

caracterización realizada con el extracto crudo de la enzima, reveló que es una alfa

amilasa, con un pH óptimo de actividad y estabilidad a 6.0, termoestable. Esta enzima

está sujeta a represión por glucosa aún a concentraciones de 1%.. La identificación

molecular de la levadura revela que pertenece al género Wickerhamia sp. Como parte

de este trabajo, se trató de implementar un método de purificación más rápido y

económico para la enzima, que pueda ser aplicable en el ámbito industrial, usando como

principio la adsorción en almidón y posterior hidrólisis de éste por la enzima. Los

resultados obtenidos muestran mayor eficiencia en la separación que el método

convencional de purificación.

Con respecto a las proteasas, se logró purificar la extracelular de Y. lipolytica,

cuyas características bioquímicas la clasifican como una metalo-serín proteasa alcalina,

termoestable, con una masa molecular de 36.500 Da.

Por otra parte se realizó una búsqueda de secuencias de genes codificantes para

DAPs, APEs y CPs intracelulares de hongos en la base de datos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias se sometieron a un análisis tipo BLAST

contra el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos

http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php

A partir de la secuencia encontrada, se procedió a hacer el análisis de su región

promotora, con el fin de saber que sitios de unión a factores de transcripción pudieran

estar presentes afectando la expresión del gen de la yylDAP, se obtuvo la secuencia río

arriba del gen, correspondiente a la porción intergénica situada entre el final del gen

inmediato anterior al de nuestro interés y el inicio del gen a estudiar.

A partir del alineamiento de la secuencia codificante de la proteasa pumDAPi, se

diseñaron un par de oligonucleótidos para la amplificación de una región del gen para el

análisis RT-PCR.

El tamaño del amplificado esperado fue de aproximadamente 406 pb

Se tuvieron avances en el estudio del citocromo P450 en una levadura aislada

de un suelo contaminado con hidrocarburos. Su identificación molecular revela que es

Candida fermentati, la cual está muy relacionada con C. tropicales, que también

degrada hidrocarburos. Se realizaron cinéticas para medir la degradación de hexeno,

hexadecano y fenol con esta levadura. Se obtuvieron los RNAs totales con alta pureza,

para realizar la expresión del citocromo bajo estas condiciones.

También se obtuvieron las secuencias de los genes que codifican para la P450.

Todos estos resultados contribuyen al conocimiento básico y posible aplicación

de las levaduras para la producción de metabolitos que normalmente se obtienen de

bacterias.

INTRODUCCIÓN

Las levaduras tienen un papel fundamental en la biotecnología, ya que se utilizan en diferentes

áreas de la producción. A pesar de que los productos de mayor impacto económico han sido el

etanol (bebidas alcohólicas) y la levadura de panificación, hoy día se explora el potencial de

estos microorganismos para la obtención de otros metabolitos como pueden ser las vitamina,

carotenos, ácidos orgánicos, precursores de esteroides, biosurfactantes y diversas enzimas, así

como su inclusión en el área de la biorremadiación. Dentro del ámbito industrial, se debe tomar

en cuenta que el microorganismo no ofrezca riesgo alguno para su manejo, es decir, que sea

tipo "GRASS"; En las levaduras se conocen muchos géneros que cumplen con este requisito.

Las enzimas hidrolíticas son de los metabolitos con mayor demanda en el ámbito industrial,

dentro de este grupo las proteasas y amilasas representan el 60% y 20% en ventas a nivel

mundial. Nosotros hemos encontrado levaduras con buenos niveles de producción de amilasas

y proteasas intra y extracelulares. Las enzimas extracelulares son las más utilizadas en diversos

procesos debido a su fácil recuperación a partir de las células. Sin embargo, para las

intracelulares, en el caso de las proteasas, se sugieren usos importantes, ya que en este grupo se

encuentran la mayoría de las actividades específicas, que generan como productos de hidrólisis

péptidos con secuencias específicas de aminoácidos, que pueden tener apliaciones como

aditivos de alimentos, en la formulación de alimentos terapeúticos, y como iniciadores en el

desarrollo de algunos medicamentos. En 2 proyectos anteriores se ha estudiado el perfil

proteolítico de una levadura que produce buenos niveles de diferentes proteasas y que fue

identificada bioquimica y molecularmente como Yarrowia lipolytica. Se han purificado algunas

de sus proteasas intracelulares mayoritarias de tipo específico como la DAP (dipeptidil

aminopeptidasa) y la APE (aminopeptidasa; así mismo, se han caracterizado la CP

(carbixipeptidasa) y 2 actividades proteolíticas extracelulares inducibles por pH y sustrato. Con

respecto a esta levadura se puede mencionar que ha llamado mucho la atención en el ámbito

biotecnológico, ya que posee características fisiológicas inusuales, las cuales la hacen

considerablemente diferente de otras levaduras ascomicetales.

En el presente proyecto se planteó la búsqueda de las secuencias codificantes para las enzimas

intracelulares en el genoma de Y. lipolytica, así como el análisis "in silico" de las secuencias

obtenidas. También se realizó un análisis mediante RT-PCR de la expresión del gen DAP bajo

distintas condiciones de cultivo de la levadura. Dicho análisis fue propuesto con el fin de

conocer más acerca de los mecanismos proteolíticos en dicha levadura, el papel fisiológico de

estas enzimas, ya que muchas de ellas intervienen durante el proceso de expresión de proteínas

heterólogas; este punto es muy importante porque Y. lipolytica se está usando actualmente

como vehículo de expresión.

Por otra parte resultó interesante conocer como están regulados los genes que codifican para

estas proteasas y con ello poder producirlas de una manera más eficiente.

Con respecto a las amilasas se caracterizó una levadura que fue aislada a partir de una fuente

natural, que tiene buenos niveles de producción. Se relizarron estudios cinéticos para evaluar su

eficiencia, se identificó el tipo de amilasas que produce y se ensayó un método de purificación

para las mismas.

Otro aspecto considerado en este proyecto, fue hacer estudios en relación al citocromo P450

bajo condiciones de crecimiento con diferentes hidrocarburos en cepas que ya se han

identificado bioquímica y molecularmente y que crecen en ellos. La actividad de este citocromo

aparentemente tiene que ver con la eficiencia en la mineralización de dichos compuestos y esto

puede tener una aplicación en el terreno de la biorremediación. Se realizará para tal propósito el

análisis de los RNAs correspondientes bajo dichas condiciones, usando sondas específicas.

MATERIALES Y MÉTODOS

MICROORGANISMOS Para estudiar la producción de amilasas extracelulares se utilizaron 292 aislados de fuentes naturales.

Además se utilizó una cepa de Bacillus subtilis como referencia en algunos experimentos.

Para el análisis y expresión de los genes DAP, CP y APE se utilizó una cepa de Yarrowia lipolytica

aislada de ambientes naturales, previamente identificada tanto bioquímica como molecularmente.

Para el estudio del citocromo P450 se utilizó una levadura que utiliza varios hidrocarburos que fue

identificada como Candida fermentati.

MEDIOS DE CULTIVO Medios de cultivo para la conservación de los microorganismos y selección primaria. . Compuesto Concentración (g/L) (NH4)2C6H6O7 NaCl KH2PO4 MgSO4.7H2O Na2CO3 Extracto de levadura Almidón

0.625 0.250 0.375 0.125 0.375 1 20

En algunos experimentos el almidón fue sustituido por otros sustratos amiláceos. Cuando se prepararon medios sólidos se adicionó agar 23 g/L. MÉTODOS ANALÍTICOS Determinación de azúcares reductores por el método del 3,5-DNS. En un tubo se adicionó una mezcla de 0.5 mL del sobrenadante diluido 1:10 con 0.5 mL de sustrato

(almidón al 1% en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 6) y se incubó a 37º C durante 30 min; la

reacción se detuvo con 1.5 mL de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) y posteriormente las muestras

fueron ebullidas en un baño de agua durante 10 min. Pasado este tiempo las muestras se dejaron

enfriar y se llevaron a un volumen de 4 mL con agua destilada. Con el problema se preparó un testigo,

al cual se le adicionaron las sustancias en el siguiente orden: 0.5 mL del sobrenadante previamente

inactivado por calor, 0.5 mL de sustrato (almidón al 1% en regulador de fosfatos 0.2 M a pH 6) que se

incubaron a 37° C durante 30 min., luego se añadió 1.5 mL de DNS, se ebulló durante 10 min., luego

de dejar enfriar se llevo a 4 mL con agua destilada. Las muestras fueron leídas a 535 nm en un

espectrofotómetro. La lectura obtenida se interpoló en una curva tipo de maltosa de 0 – 1000 μg. La

actividad se expresó en unidades de amilasa (UA/mL).

Una unidad de actividad de amilasa (UA) se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar

1 micromol de grupos reductores

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO Se realizó por peso seco, lectura de densidad óptica a 600 nm y cuenta viable

DETERMINACIÓN DE SUSTRATO RESIDUAL (ALMIDÓN). Se diluyó el sobrenadante en un volumen de 10mL y se añadió 200 microlitros de la solución de yodo diluida 1:4 se agitó en le vortex hasta distinguir una coloración que fue del azul al amarillo. CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A NIVEL DE EXTRACTO CRUDO Obtención de un extracto crudo de las enzimas La producción de enzima se realizó en medio de Castañeda-almidón 2%. Se preparó un matraz de 1L conteniendo 200mL de medio, este se inoculó con 3% de cultivo obtenido en las mismas condiciones y se incubó a 28°C durante 32h, tiempo de máxima producción de amilasas. Posteriormente se procedió a separar el caldo enzimático del paquete celular y sustrato remanente, centrifugando a 3,840 xg durante 10 min. El sobrenadante se conservó en congelación hasta su uso. Para la caracterización se tomaron en cuenta los siguientes aspectos: a) Vida de anaquel del extracto enzimático. b) Determinación del pH óptimo y estabilidad a diferentes pH’s. c) Determinación de la temperatura óptima y estabilidad de la enzima a diferentes temperaturas. d) efecto de diferentes iones sobre el actividad de la amilasa. e) efecto de un agente reductor sobre la actividad amilolitica. PURIFICACIÓN DE LAS AMILASAS

OBTENCIÓN DE LOS SOBRENADANTES

Se realizó la cinética de producción de las amilasas de ambas cepas hasta su tiempo de máxima

producción (32 horas en el caso de Wickerhamia sp y 36 horas para el B. amyloliquefaciens). Los

extractos crudos recuperados fueron centrifugados a 10000 rpm a 4º C, obteniendo el sobrenadante

(enzima) el cual fue conservado en congelación hasta su uso.

MÉTODO DE ADSORCIÓN CON ALMIDÓN

Se probaron concentraciones de almidón de 14, 28, 42, 56 %. Se colocaron 50 mL del extracto crudo

de la enzima con cada una de las concentraciones antes mencionadas durante 24 h en agitación a 4º C

para su adsorción. Pasado este tiempo, las muestras se centrifugaron a 13000 rpm a 4º C, recuperando

la enzima adsorbida al soporte (almidón) y la enzima que no fue adsorbida (sobrenadante) a los cuales

se les determinó la actividad enzimática por el método de Miller.

Se realizó colocando 200 mL de extracto crudo enzimático con la concentración óptima de almidón

(28%), durante 24 horas para su adsorción en agitación a una temperatura de 4º C. Posteriormente se

hizo una centrifugación a 13000 rpm a 4º C recuperando la enzima que no fue adsorbida al almidón

(sobrenadante) así como la enzima adsorbida al soporte y se midió la actividad amilolítica del

sobrenadante por el método de Miller. El almidón con la enzima adsorbida se puso a digerir con

regulador Tris-HCl 0.1 M a un pH de 7.5 en un baño de agua a 37º C durante 1 h, y se determinó la

actividad amilolítica del sobrenadante así como la cantidad de proteína por el método de Bradford. El

sobrenadante se recuperó por centrifugación y fue concentrado con sulfato de amonio al 80% durante

2 h a 4º C, cuidando que la adición del sulfato fuera lenta y en agitación constante. Luego la muestra se

centrifugó a 13000 rpm durante 1 h a 4º C. Con la enzima recuperada se procedió a dializarla en

membranas de diálisis primero con agua destilada y después con regulador de Tris –HCl 0.1 M pH

7.5 durante 24 h en agitación. Al final del proceso, se midió la actividad enzimática y la cantidad de

proteína recuperada después de la purificación.

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Los principios de separación empleados fueron el de intercambio iónico y el de tamiz molecular.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La matriz empleada fue DAEA Sephadex A-25-120 en una columna de vidrio de 80 cm de longitud

por 2.5 cm de diámetro. Previamente, el gel se hidrató con regulador de Tris –HCl 0.01 M pH 7, y se

desgasificó. La columna se empacó con la matriz y se equilibró con 100 mL de regulador Tris-HCl

0.01M pH 7. Se colocaron 6 mL de la muestra (extracto crudo enzimático) que se mantenía en

congelación e inmediatamente se adicionaron 100 mL de regulador Tris- HCl 0.01M pH 7.

Para la elución de las proteínas retenidas en la columna se aplicó un gradiente de cloruro de sodio 0.1-

0.5 M empleando 100 mL de cada una de las concentraciones. Se recuperaron 200 fracciones, cada

una de aproximadamente 3 mL que posteriormente fueron leídas a 280 nm y se les determinó la

actividad amilolítica. Con los resultados se construyó un perfil de elusión.

CROMATOGRAFÍA DE TAMIZ MOLECULAR

Se utilizaron las fracciones eluídas con mayor actividad amilolítica provenientes de la columna de

intercambio iónico.

Éstas se pasaron a través de una columna de 80 cm de longitud por 2.5 cm de diámetro empacada con

Sephadex G75-120 y equilibrada con 100 ml de Tris-HCl 0.01M pH 7. Se recolectaron 40 fracciones

de 3 mL cada una, con un flujo constante de 1 mL por minuto, las fracciones fueron leídas a 280 nm y

se les determinó la actividad amilolítica.

COMPROBACIÓN DE LA PUREZA

Después de obtener los perfiles de elución que resultaron de las diferentes separaciones

cromatográficas, se tomaron las fracciones correspondientes a los picos de proteína con actividad de

amilasa y se concentraron en centricones con un límite de exclusión de 10000 Daltones.

A partir de las muestras concentradas se tomaron aproximadamente 40 μL de proteína para hacer

electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones despolimerizantes.

Para la purificación de la proteasa extracelular se utilizaron columnas de intercambio iónico y tamiz

molecular

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA SDS-PAGE

Se realizó empleando el método descrito por Laemmli (1973) con las muestras concentradas y

preparadas con solución 2X para la muestra (Tris-HCl 0.5M pH 6.8, SDS 2%, 2-mercaptoetanol 5%,

glicerol 10% y azul de bromofenol 0.002%) y sometidas a ebullición 2 min.

Para el corrimiento se prepararon geles de poliacrilamida, cuya concentración de arcrilamida en el gel

concentrador y separador fueron del 4 y 10% respectivamente a partir de una solución de monómeros

al 30.8%, TEMED 0.5 M pH 6.8, SDS al 10%, persulfato de amonio 10%. En el caso del gel

empacador se utilizó Tris-HCl 0.5 M a un pH de 6.8 y en el gel espaciador se utilizó Tris-HCl 1.5 M a

un pH de 8.8. El regulador de corrimiento fue Tris (1.5%), glicina (7.2%) y SDS (0.5%) a un pH final

de 8.3.

El corrimiento se realizó en una cámara de electroforesis Mini-PROTEIN II de Bio.Rad. Se aplicó una

corriente de 90 V, 12 mA durante 1.5 horas. Posteriormente la visualización de las bandas de proteínas

se realizó por la tinción con nitrato de plata.

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES NATIVAS

A partir de la muestra concentrada, se tomaron 40 μL para hacer la electroforesis. Se utilizaron geles

de poliacrilamida al 10 % en condiciones no desnaturalizantes, (sin SDS) usando como regulador de

corrimiento Tris-glicina (3.0 g de Trizma-base, 14.4 g de glicina por litro de agua). El corrimiento se

realizó a 90 V, 12 mA durante 1.5 h., y una vez terminada la separación los geles se introdujeron en

una solución de almidón al 2% durante 1 hora a 4º C, con el objeto de que el gel se impregnara con el

almidón (sustrato); el exceso de almidón se eliminó con agua desionizada. Posteriormente el gel fue

sumergido en regulador de fosfatos 0.2 M a pH de 6 y se incubó a 37º C durante 30 minutos, para

que la amilasa hidrolizara al almidón. La visualización de la enzima se realizó revelando el gel con

una solución de lugol diluido 1:10. Se realizó un testigo en el cual se colocó una parte del gel en

regulador de fosfatos 0.2M pH 6 durante 30 minutos a temperatura ambiente que posteriormente fue

revelado con solución de lugol diluido 1:10.

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 1. Análisis BLAST del genoma de Yarrowia lipolytica, empleando las secuencias reportadas de

otras proteasas en levaduras.

Con el fin de amplificar un fragmento del gen que codifica para la dipeptidil aminopeptidasa

yylDAP se realizó una búsqueda de secuencias de genes que codifiquen para DAPs intracelulares de

hongos en la base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias se sometieron a un análisis

tipo BLAST con el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos

http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php .

Para los genes codificantes de las yylAPE y yylCP también se realizó la búsqueda de los ORF’s

codificantes en la misma dirección electrónica.

Posteriormente, se sometieron a otro análisis tipo BLAST tanto para secuencias nucleotídicas como

aminoacídicas en la base de datos del GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para confirmar

la función atribuida a dichos genes.

2. Análisis bioinformático de la secuencia promotora.

a) Análisis de la secuencia promotoras de los genes que codifican para una dipeptidil aminopeptidasa

(paquete bioinformático MatInspector)

3. Diseño de iniciadores para la amplificación del (los) gen(es) que codifica(n) para la proteasa

yylDAP

A partir del alineamiento de la secuencia codificante de la proteasa yylDAP, se diseñaron un par de

oligonucleótidos para la amplificación de una región del gen para el análisis RT-PCR.

4. Amplificación de una región del gen que codifica para la dipeptidil aminopeptidasa yylDAP.

Extracción de DNA genómico de Y. lipolytica.

La extracción del DNA genómico de Y. lipolytica se realizó por el método descrito por Hoffman y

Winston en 1987. La concentración del DNA se determinó espectrofotométricamente.

* Amplificación

Se realizóla amplificación de un fragmento del o los genes para yylDAP mediante la técnica de PCR

utilizando los iniciadores diseñados.

A continuación se muestran las condiciones que se utilizarán para la amplificación de los genes que

codifican para una aminopeptidasa yylDAP de Y. lipolytica .

Mezcla de reacción MgCl2 50 mM 1.0 µl Regulador de PCR 10X 2.5 µl Mezcla de dNTP´s 10 mM 0.5 µl Iniciador-D 10 mM 1.0 µl Iniciador-R 10 mM 1.0 µl DNA 10 ng/µl 1.0 µl Agua 18.0 µl El volumen final de la reacción será de 25 µl. Amplificación de genes CYP52

A partir de DNA genómico de las diferentes levaduras se procedió a realizar una PCR para la

amplificación de un fragmento de una 1 Kb de los genes CYP52 con las siguientes condiciones:

Iniciador derecho CYP52s: CYA TGT TGA GAC CAC ART TTG C

Iniciador reverso CYP52r: GAC CYA AAC AAA TTC TTG GAC C

Desnaturalización previa a 95ºC 5 min 95ºC 1 min 50ºC 1 min 72ºC 1 min Extención final 72ºC 5 min

Identificación por API

Las cepas seleccionadas se sometieron a identificación por el sistema API ID 32 C según

instrucciones del fabricante.

Identificación molecular

1. Obtención de DNA total a partir de las levaduras

Para este propósito se utilizó el método descrito por Lehmann et al., 1992 con algunas

modificaciones:

Matraces con 5 ml de caldo YEPD fueron inoculados a partir de los viales de conservación,

éstos se incubaron a 28ºC / 100 rpm durante 24-72 h, dependiendo del tiempo de generación de cada

levadura. La biomasa de 1 ml de cultivo se cosechó por centrifugación a 3,000 x g durante 5 min

utilizando para ello microtubos de 1.5 ml. El paquete celular se lavó con 1 ml de agua desionizada

estéril y se centrifugó a 3,000 x g durante 5 min. A partir de este paquete celular se obtuvieron

protoplastos utilizando la técnica descrita por Guengerich et al. (1991). Un paquete celular de

aproximadamente 0.2 g de células se resuspendieron en 1 ml de regulador Tris-HCl 10 mM, sorbitol

1.2 M, DTT 10 mM pH 7.5 y 15 U de zimoliasa (ICN) y se incubaron 30ºC durante 2 h. La formación

de protoplastos se verificó continuamente por observaciones al microscopio, los protoplastos se

recuperaron por centrifugación a 3,000 x g durante 5 min. Para romper los protoplastos, se adicionaron

200 �l de regulador Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM, NaCl 10 mM, SDS 1%, Tritón X-100 2%

y 200 �l de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1), la mezcla se agitó en un Vórtex dando 8 pulsos de

30 seg y periodos de reposo en hielo de 30 seg. Al finalizar los pulsos se adicionaron 200 �l de

regulador TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM), la mezcla se centrifugó a 22,000 x g durante 5

35 ciclos

min. El sobrenadante se recuperó en un microtubo nuevo, al que se adicionó 1 ml de etanol absoluto y

se mezcló por inversión. La muestra se refrigeró durante 2 min a -20ºC, posteriormente se centrifugó a

22,000 x g durante 5 min, el etanol se eliminó y la muestra de DNA se dejó secar en una campana de

flujo laminar. Una vez seco el botón se adicionaron 400 �l de regulador TE y 10 �g de RNAasa y se

incubó a 37ºC durante 15 min. Posteriormente se adicionaron 10 �l de acetato de amonio 4 M y 1 ml

de etanol absoluto, se mezcló por inversión y se refrigeró a -20ºC durante 20 min, finalmente se

centrifugó durante 2 min a 22,000 x g, el etanol se evaporó en una campana de flujo laminar y el DNA

se resuspendió en 50 �l de agua desionizada estéril.

El DNA así obtenido se cuantificó en un espectrofotómetro a 260 nm (ácidos nucleicos) y se

obtuvo la relación de absorbancias 260/280. La concentración de DNA se determinó aplicando la

equivalencia de 1 OD equivale a 50 �g/ml. El DNA se consideró de buena calidad si el valor de esta

relación fue mayor a 1.7 (Sambrook et al., 1989).

Para verificar la calidad del DNA y descartar la posibilidad de una degradación del mismo, se

sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Una vez verificada la cantidad y calidad del

DNA éste se almacenó a -20ºC.

2. Electroforesis de DNA en gel de agarosa.

El DNA se separó por electroforesis en geles de agarosa al 1% en regulador TAE (Sambrook et

al., 1989) 1X a 80 V. El DNA se tiñó con bromuro de etidio 0.5 �g/ml y se observó en un

transiluminador de luz ultravioleta.

3. Amplificación de un fragmento del gen 26s rDNA

Se procedió a amplificar un fragmento de 600 pb del gen 26s rDNA de la cepa. Siguiendo el

protocolo de amplificación que se muestra en la Tabla1. Las secuencias de los oligonucleótidos

utilizados en la amplificación son las siguientes:

Oligonucleótido Fep-JL 5´CATATCAATAAGCGGAGCAAAAG3´

Oligonucleótido Rep-JL 5´GCTCCGTGTTTCAAGACG3´

Tabla 1. Condiciones de amplificación para un fragmento de 600 pb del gen 26s rDNA de levaduras (Fell, 1993).

P

Para la realización de la PCR se utilizó un termociclador Mastercycler 384 (Eppendorf); una vez

terminada la reacción, se sometieron 3 �l de los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa

(ver 2.). Los amplificados obtenidos se purificaron con el “QIAEX II Gel extraction Kit” de QIAGEN.

44.. CClloonnaacciióónn ddeell ffrraaggmmeennttoo ddee 660000 ppbb ccoorrrreessppoonnddiieennttee aall ggeenn 2266ss rrDDNNAA eenn eell vveeccttoorr PCR 2.1

TOPO

Los fragmentos previamente amplificados con los oligonucleótidos Fep-JL y Rep-JL, se

sometieron a clonación en el vector PCR 2.1 TOPO (Invitrogen), y se siguieron las indicaciones del

fabricante, las colonias con inserto y con marcador de resistencia a ampicilina se inocularon para

extraer DNA plasmídico empleando el método de lisis alcalina (Sambrook, 1989).

Parámetro

Condición

Regulador 10X 1X MgCl2 4 mM dNTP´s 0.8 mM

Iniciador S 0.8 mM Fep-JL Iniciador R 0.8 mM Rep-JL

Taq polimerasa 0.06 U/ml DNA 6 ng/ml

Temperatura y tiempo de desnaturalización inicial 94º C, 5 min

Temperatura y tiempo de desnaturalización 94º C, 1 min

Temperatura y tiempo de alineamiento 57º C, 1 min

Temperatura y tiempo de extensión 72º C, 1 min

Temperatura y tiempo de la extensión final 72º C, 5 min

Número de ciclos 35

Posteriormente se realizó la selección de clonas con la construcción deseada mediante el

análisis de restricción del DNA plasmídico con la enzima de restricción EcoRI.

55.. PPuurriiffiiccaacciióónn ddee llooss pprroodduuccttooss ddee cclloonnaacciióónn yy sseeccuueenncciiaacciióónn

A partir del DNA plasmídico de las clonas seleccionadas se amplificó la región del inserto más

100 pb corriente arriba y corriente abajo, empleando los olinucleótidos Reverse M13 y Forward M13

(Invitrogen). El protocolo de amplificación se muestra en la Tabla 2.

Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para amplificar a partir del DNA plasmídico son las

siguientes:

Oligonucleótido Forward M13 5´ GTAAAACGACGGCCAG 3´

Oligonucleótido Reverse M13 5´CAGGAAACAGCTATGAC 3´

Tabla 2. Condiciones de amplificación del inserto clonado en el vector PCR 2.1 TOPO utilizando los iniciadores Forward M13 y Reverse M13 (Invitrogen).

L

Parámetro Condición Regulador 10X 1X

MgCl2 2.4 mM dNTP´s 0.5 mM

Iniciador S 0.5 mM Forward M13 Iniciador R 0.5 mM Reverse M13

Taq polimerasa 0.24 U/ml DNA 2.4 ng/ml

Temperatura y tiempo de desnaturalización inicial 94º C, 2 min

Temperatura y tiempo de desnaturalización 94º C, 1 min

Temperatura y tiempo de alineamiento 55º C, 1 min

Temperatura y tiempo de extensión 72º C, 1 min

Temperatura y tiempo de la extensión final 72º C, 7 min

Número de ciclos 35

Los amplificados obtenidos se purificaron a partir de agarosa utilizando el kit comercial “QIAquick

Gel Extraction Kit” (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.

A partir de los amplificados purificados se procedió a realizar la secuenciación en un

secuenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer PE (Applied Biosystems).

66.. AAnnáálliissiiss bbiiooiinnffoorrmmááttiiccoo

Las secuencias obtenidas se compararon con las depositadas en la base de datos de NCBI

mediante análisis BLASTN (htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov).

A partir de los resultados obtenidos con el análisis BLASTN, se procedió a realizar un

alineamiento múltiple con la ayuda del programa Clustal X versión 1.81 (Thompson, 1997), usando los

parámetros de lento/seguro, 15.5 para apertura de “gaps”, 6.6 para la extensión de los mismos,

eliminación de secuencias divergentes en un 30% ó más, peso de 0.5 para las transiciones y la matriz

IUB peso del DNA, no se empleó la matriz negativa, para posteriormente efectuar una edición manual

de los alineamientos obtenidos usando el programa SeaView (Galtier, et al.,1996) y BioEdit Version

7.0.0.

Con la secuencia editada se procedió a realizar un segundo BLASTN para conocer con que

especie presenta una mayor similitud. La asignación taxonómica encontrada sirvió para coleccionar

secuencias relacionadas adicionales con un criterio taxonómico empleando la base de datos Taxonomy

Browser de la NCBI (htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov). Se obtuvieron las secuencias del gen 26s rDNA

para las especies del mismo género y familia.

Las relaciones filogenéticas entre las cepas se establecerán por métodos de distancia,

parsimonia, y Bayesianos.

RESULTADOS

Actividad amilolítica

Como se observa en la tabla 3, del total de cepas evaluadas, solo 5 presentaron halos de hidrólisis

desde las 24h de incubación. De estas 4 son bacilos Gram positivos y una levadura que forma

pseudomicelio. Estas representan tan solo el 4% del total de la población ensayada (Fig. 3B). Los halos

de hidrólisis se muestran en la figura 3 A. En las 5 cepas se presentaron tamaños de halos muy

parecidos, por ello es que se eligieron las 5.

Tabla 3. Microorganismos amiloliticos aislados de fuentes naturales

Cepa Característica Procedencia 6 Levadura formadora de

pseudomicelio Limón

8 Bacilo Gram + Champiñón 162 Bacilo Gram + Leche 79 Bacilo Gram + Búlgaros 30 Bacilo Gram + Plátano

Figura. 1A) Selección primaria B) Representación gráfica del porcentaje de microorganismos

amiloliticos en una población de 292 cepas

Se realizaron análisis cinéticos con almidón y los resultados indicaron que la levadura fue la mejor

productora de la amilasa. El ensayo con diferentes sustratos dio mejores resultados con harina de trigo

(figura 2)

4% Halo de hidrólisis

A B

TRIGO

MAÍZ

ALMIDÓN

PAPA

ARROZ

GLUCOSA0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 12 24 30 36 48 60 72

TIEMPO (h)

Act

ivid

ad d

e am

ilasa

(U/m

L)

Figura 2 Producción de α-amilasa con diferentes sustratos. Los cultivos se incubaron a 28ªC durante

72h. La actividad se determinó por el método del DNS.

La amilasa extracelular se comporta como un metabolito primario, ya que se sintetiza a lo largo de la

curva de crecimiento.

UAμ = 0.243h-1

Crecimiento

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 12 24 30 36 48 60 72Tiempo (h)

Act

ivid

ad d

e am

ilasa

U/m

L

0

1

2

3

4

5

6

Cre

cim

ient

o lo

g 10 U

FC/m

L

Figura3.Cinética de crecimiento y actividad de �-amilasa de Lev 6. Se utilizó el medio de Castañeda-

harina de trigo 2%.

Identificación in situ de la actividad de la α-amilasa

Se realizó una identificación in situ de la actividad de amilasa presente en el sobrenadante de un

cultivo de 32 h obtenida de un medio con almidón 2%, previo corrimiento electroforéticamente en

ausencia de SDS.

Figura 4. Zimograma de la levadura 6: 1- Marcador de Peso molecular; 2- Electroforesis en

condiciones desnaturalizantes teñido con plata; 3- Electroforesis en condiciones nativas teñido con

plata; 4- Gel revelado con solución de lugol al 1:10 antes de digerir; 5- Gel revelado con solución de

lugol 1:10 después de digerir a 37º C durante 30 min.

En la figura 4 se puede observar que solo una banda con actividad de amilasa (zona clara) fue

revelada en un sobrenadante del cultivo (carril 5), esta corresponde con la observada en el carril 3

procedente de una electroforesis en condiciones nativas y teñida con nitrato de plata.

En el carril 2 se revela de igual forma una banda en condiciones desnaturalizantes cuyo peso molecular

corresponde a 56.2 KDa.

192.7KDa 117.9KDa 99.2KDa 54.1KDa 37.7KDa 29.4KDa 20.1KDa

1 2 3 4 5

Identificación molecular de la levadura 6.

Huvarum

Hclermontiae

Hopuntiae

Hlachancei

Hguilliermondii

Hmeyeri

Hvalbyensis

Hvineae

Hosmophila

Hoccidentalis

Hoccidentalisc

Ssinensis

Sludwigii

Nfulvescense

Ncommutata

Wfluorescens

Wickerhamia

Gambilitica

63

59

35

47

99

100

100

100

100

99

74

60

72

99

56

La levadura descrita como 6 amilolítica presenta una similitud del 99.61% con Wickerhamia sp

reportada en el banco de genes. La similitud obtenida indica que posiblemente se trate de una levadura

perteneciente a este género de levaduras de acuerdo a los criterios de Rossello-Mora y Amman, 2001.

El cual dice “La asignación taxonómica para establecer el nivel de especie debe guardar una similitud

mayor al 97.5%, mientras que la identificación a nivel de género se requiere del 95% con la mejor

secuencia relacionada. La similitud con Wickerhamia fluorescens es de 83.4%.

La purificación de la amilasa se logró con muy buena recuperación 70% usando un método de

adsorción con almidón, y posterior hidrólisis de éste por la acción de la enzima., en comparación con

el protocolo tradicional que usa columnas de intercambio iónico y tamiz molecular, como se aprecia en

la tabla 4, en donde se puede observar que la enzima alcanza un grado de purificación de 3.35 veces

con una recuperación de 3.1%.

Tabla 4. Resumen de purificación de la amilasa extracelular de Wickerhamia sp

Etapa Proteína total (mg)

Actividad total (UA)

Actividad específica (UA/mL)

Recuperación (%)

Purificación (veces)

Extracto crudo

155.4 1544600 9939.5 100 1

DEAE Sephadex A-25-120

1.68

49638

29546.4

3.2

2.9

Sephadex G-75-120.

1.48

49290

33304.1

3.1

3.35

Resultados de análisis de genes APE, DAP y CP 1. Análisis BLAST del genoma de Y. lipolytica, empleando las secuencias reportadas de otras

proteasas en levaduras.

Se realizó una búsqueda de secuencias de genes codificantes para DAPs, APEs y CPs

intracelulares de hongos en la base de datos http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Las secuencias se

sometieron a un análisis tipo BLAST contra el genoma completo de Y. lipolytica en la base de datos

http://cbi.labri.fr/Genolevures/blast/index.php (Tabla 1, Tabla 2)

2. Análisis bioinformático de la secuencia promotora (datos teóricos).

A partir de la secuencia encontrada, se procedió a hacer el análisis de su región promotora, con el

fin de saber que sitios de unión a factores de transcripción pudieran estar presentes afectando la

expresión del gen de la yylDAP, se obtuvo la secuencia río arriba del gen, correspondiente a la porción

intergénica situada entre el final del gen inmediato anterior al de nuestro interés y el inicio del gen a

estudiar (Fig. 1,Tabla3).

3. Diseño de iniciadores para la amplificación de los genes que codifican para la proteinasa

pumDAP.

A partir del alineamiento de la secuencia codificante de la proteasa pumDAPi, se diseñaron un par de

oligonucleótidos para la amplificación de una región del gen para el análisis RT-PCR.

El tamaño del amplificado esperado es de aproximadamente 406 pb (Fig. 2)

4. Amplificación de una región del gen que codifica para la dipeptidil aminopeptidasa pumDAP.

Condiciones de amplificación:

Desnaturalización inicial 94° C 2 min.

35 ciclos de:

Desnaturalización 94° C 30 seg.

Alineamiento 59° C 45 seg.

Extensión 72° C 1. 5 min.

Extensión final 72° C 5 min.

Fig. 2 Amplificado de 406 pb . Carril 1. Marcador de talla molecular de 100pb, carril 2, cepa MI-IPN-1, carril 3, cepa W29

Tabla 2. ORF’s putativos codificantes para Carboxipeptidasas de Y. lipolytica

Número de Acceso

Parecida a Peso molecular

(KDa)

pI Proteína en aminoácidos

Numero de nucleótidos

Cadena

YALI0B01408g Candida albicans, precursor de Carboxi peptidasa Y

61.9 4.6 554 1662 -

YALI0C00803g Candida albicans, precursor de Carboxi peptidasa Y

57.8 4.9 520 1560 +

YALI0B05170g Saccharomyces cerevisiae YGL203c carboxi peptidasa KEX1 (YSC-alpha)

69.3 4.3 614 1842 +

YALI0F16489g Saccharomyces cerevisiae YJL172w CPS1 precursor de Gly-X carboxi peptidasa YSCS

64.2 5.2 580 1740 +

YALI0F25333g Saccharomyces cerevisiae YJL172w CPS1, precursor de Gly-X carboxi peptidasa YSCS

64.6 6.3 580 1740 -

YALI0A18810g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa

55.2 4.6 493 1479 +

YALI0B20812g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa P3.65.f3.1

54.8 6.2 488 1464 -

YALI0C21604g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa P3.65.f3.1

65.6 4.9 589 1767 -

YALI0C23661g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-proteasa

50.2 4.8 458 1347 +

YALI0D08052g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín.proteasa

52.8 4.6 468 1404 -

YALI0D09042g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y

52 5.0 461 1383 -

YALI0F11803g Saccharomyces cerevisiae YMR297w PRC1 carboxi peptidasa Y, serín-prpteasa

50.6 5.6 457 1371 +

Tabla 3. Proteínas de unión a probables sitios de transcripción en la región promotora del gen putativo de la dipeptidil aminopeptidasa de Yarrowia lipolytica

PROTEÍNA DE UNIÓN SECUENCIA QUE RECONOCE CARACTERISTICAS

MATA1 tGATGtact Mating factor 1

GCN4 cagTGACtgtttt Respuesta a inanición de aa

CUSE actattgtGCTGacc Respuesta a señales de cobre

HSF nTTCCaggann Respuesta a condiciones de estrés térmico

STE11 (MCM1) cgtcttTTTTgttttttct Cajas TR especificas

NIT2 TATCnnn Regulación por fuente de nitrógeno

)

Fig. 2. Secuencia promotora del gen putativo de la yylDAP (YALI0B02838g)

RESULTADOS CITOCROMO P450 Se han hecho cinéticas de crecimiento en presencia de hexano, hexadecano y fenol, para obtener los

RNA totales para hacer los ensayos de expresión usando la técnica de RT-PCR.

Se tienen iniciadores de DNAs que codifican para el citocromo P450 de Candida tropicalis y C.

fermentati, ambas aisladas de suelos contaminados con hidrocarburos e identificadas molecularmente

en este trabajo.

El trabajo continúa tanto en la identificación molecular de otras levaduras que también degradan

hidrocarburos, así como en investigar si poseen los genes del Cit. P450.

El análisis de expresión también se está realizando todavía.

IMPACTO Los resultados obtenidos en este proyecto muestran la importancia que las levaduras tienen en

diferentes ámbitos de la biotecnología; contribuyen al conocimiento de estos microorganismos en

cuanto a su potencial de producción de diferentes metabolitos.

Un aspecto importante es que el proyecto ayudó a la formación de recursos humanos cuyo interés es

desarrollarse en el ámbito industrial.

Por otro lado, los resultados nos servirán para dar difusión al conocimiento mediante la preparación de

al menos 2 artículos.