COMPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS ACEITES ESENCIALES DE ORÉGANO (Lippia graveolens s.l.)

RESUMEN Se comparó la composición química de aceite esencial de diferentes poblaciones de orégano silvestre (Lippia graveolens s.l.) procedentes de los Estados de Durango, Nuevo León y Tamaulipas, así como de Guatemala y Honduras. Se observó una marcada diferencia en la composición química de varias de las poblaciones de orégano analizadas, principalmente en dos municipios de Durango, así como en la de Guatemala y Campeche. En general, los análisis de calidad realizados al aceite esencial procedente de las regiones de mayor producción de orégano en Durango, señalaron pocas diferencias significativas entre sí, a excepción de cinco de las muestras, las cuales aún cuando los valores obtenidos presentaron valores ligeramente diferentes, coinciden con las diferencias encontradas también en el análisis cromatográfico. El análisis comparativo de la calidad del aceite esencial de orégano obtenido en cuatro equipos de destilación construidos en acero inoxidable, aluminio, cobre, lámina galvanizada y cristalería de laboratorio, demostró que si hubo deterioro del aceite esencial, con respecto al análisis fisicoquímico (color, índice de refracción, densidad y residuo a la evaporación), así como en el análisis químico, particularmente en la concentración de componentes, en el número y presencia de éstos. Sin embargo, los componentes mayoritarios del aceite esencial de orégano como son el timol, carvacrol, γ-terpineno y p-cimeno, no fueron afectados en su concentración y presencia en las muestras analizadas, ni en el material botánico almacenado después de cuatro años.

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INTRODUCCIÓN La variabilidad morfológica del orégano en el mundo ha dado lugar a controversias en cuanto a su clasificación botánica. En México se considera la existencia de dos especies de orégano comercial: Lippia graveolens y L. berlandieri; aunque algunos taxónomos las consideran sinónimos, sus características morfológicas y su distribución en la República Mexicana, señalan que en algunas zonas áridas del norte de México, esta planta presenta variantes morfológicas y composición química diferentes al resto de las especies denominadas orégano en otros estados, por lo cual podría tratarse de otra especie o de una variedad o subespecie de L. graveolens que debería tratarse con un nombre diferente. La demanda del aceite esencial de orégano en el mercado internacional y nacional, ha provocado que algunos productores de orégano mexicano, extraigan el aceite esencial de este arbusto en equipos de destilación caseros o en pequeña escala, construidos en materiales distintos al acero inoxidable, como cobre o aluminio principalmente, sin descartar otros materiales más baratos; los cuales afectan la calidad del producto extraído, así como los productos, que se elaboran ya de por sí, sin ningún control de calidad físico, químico y microbiológico. En esta investigación se determinó la variación en la composición química de aceites esenciales de orégano (Lippia graveolens s.l.) en distintos sitios de las áreas de recolección de Durango, de algunas localidades de la República Mexicana y de algunos países de Centroamérica. También se analizaron parámetros de calidad del aceite esencial de algunas regiones de Durango para reconocer los requisitos mínimos para proponer un proyecto de certificación para aceites esenciales, al menos para Durango, al aportar información que apoye los procesos de certificación del producto y que contribuya a su mejor manejo, aprovechamiento y conservación del recurso silvestre. Paralelamente se evaluó la calidad del aceite esencial de orégano obtenido en prototipos de destilación construidos con diferentes materiales para conocer los parámetros de calidad de este aceite que son afectados y poder proporcionar la asesoría necesaria y el servicio externo para extraer aceites esenciales en pequeña y mediana escala con calidad, mayores rendimientos y menores insumos a los usuarios que así lo soliciten.

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MÉTODOS Y MATERIALES Recolección de material botánico El material silvestre se recolectó en diversos sitios de las áreas oreganeras de Durango (Figura 1). Estas muestras se compararon con material botánico procedente de Tamaulipas, Nuevo León, Coahuila, Zacatecas, Campeche, Guatemala y Honduras (Cuadro 1). Procesamiento del material recolectado De todo el material recolectado, se procesaron los ejemplares de herbario para su identificación en el Herbario CIIDIR de este Centro de trabajo. Posteriormente se realizó la limpieza, separación de la hoja y del tallo de la parte aérea de las muestras colectadas para su análisis químico (Figura 2). Para el monitoreo de la calidad del aceite esencial en los distintos prototipos, y el montaje de las técnicas correspondientes, se trabajó con material recolectado en 2006 y 2007, donado por el Ing. Ramiro Martínez, productor del Municipio del Mezquital, Dgo., por lo cual se carece en este caso, de los comprobantes de herbario. En el caso particular del análisis de calidad, también se recolectó orégano domesticado, fresco en octubre del 2007, procedente del área experimental del CIIDIR - Durango, para comparar la calidad de este aceite esencial recién extraído, con el de procedencia más antigua (donación). Con respecto al área experimental, el material botánico silvestre fue trasplantado en los años 1998 y 1999, proveniente de diversos municipios del estado de Durango.

Figura 1. Recolección del orégano. Figura 2. Procesamiento del material recolectado Construcción y adaptación de prototipos de extracción con diversos materiales Se construyeron cuatro prototipos para extraer el aceite esencial de diversas dimensiones, en función de la accesibilidad en aluminio, cobre, lámina galvanizada y acero inoxidable Figura 3. Así mismo, se montó un equipo de destilación con cristalería de laboratorio para utilizarlo como un equipo control para comparar este aceite esencial extraído, con los obtenidos en los distintos prototipos).

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(a) (b) (c) (d)

Figura 3. Equipos de extracción. a) Acero inoxidable; b) Aluminio; c) Cobre; d) Lámina galvanizada.

Extracción de aceite esencial y estandarización de prototipos Para la obtención del aceite esencial en los prototipos construidos, la hoja de orégano se sometió a una destilación con arrastre de vapor de agua. Se utilizó una parrilla de calentamiento como fuente de calor. Se cuantificó el rendimiento del aceite esencial de las muestras en los diferentes prototipos. Inmediatamente después, los aceites esenciales obtenidos se guardaron en envases de vidrio ámbar, se sellaron con parafilm y se guardaron en refrigeración hasta su uso. Control de calidad El control analítico de los aceites esenciales permite determinar la calidad y el grado de pureza e identidad de una esencia genuina, además, ofrece información sobre la tecnología de producción. El aceite obtenido del material de donación, fue sometido al análisis de control de calidad correspondiente, consistente en el análisis fisicoquímico y el análisis cromatográfico. En el primer caso, se determinaron algunos parámetros basados en normas oficiales mexicanas y en técnicas convencionales, como: color por un método colorimétrico (IPN, 1998); densidad relativa por el método del picnómetro (NMX-F-075-1987) y por el método de la balanza Mohr-Whestphal (IPN, 1998); índice de refracción (NMX-F-074-S-1981), cenizas por el método gravimétrico (NMX-F-607-NORMEX-2002), solubilidad en etanol por un método volumétrico (NMX-K-081-1976) y residuo a la evaporación por un método gravimétrico (NMX-F-077-1976). Este tipo de análisis son importantes para determinar la pureza, calidad y posibles adulteraciones que en un momento dado, se pudieran presentar. Análisis cromatográfico El análisis de cromatografía de gases se realizó únicamente a las muestras recolectadas durante 2007 y el resto de las muestras fueron analizadas por cromatografía en capa fina de silicagel. Para la cromatografía de gases, una porción de cada uno de los aceites esenciales, se colocó en viales de vidrio ámbar y se disolvieron en una mezcla de etanol-cloroformo 1:1. Enseguida, el aceite se analizó en un equipo de cromatografía de gases (propiedad

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del SIRENA en Salaices, Chih.), marca Perkin Elmer CLARUS 500, con una columna capilar AT-1 de 30 m de longitud y un diámetro interno de 0.25 mm, con inyector automatizado. Se utilizó un detector de ionización a la flama y se usó helio UAP como gas acarreador, hidrógeno y aire para la flama. La temperatura del inyector fue de 250 °C y la temperatura del detector de 270 °C, se programó una rampa de temperaturas con diferentes tiempos (Silva, et al., 2008). Las muestras se compararon con cinco estándares: γ-terpineno, p-cimeno, eucaliptol (1,8-cineole), carvacrol y timol. Éstos fueron inyectados en las mismas condiciones de operación que las muestras. En seguida los cromatogramas obtenidos se analizaron para comparar el perfil de terpenoides presentes en las diversas muestras. Para el análisis de cromatografía en capa fina, se colocaron 0.05 μL de cada uno de los aceites esenciales en las placas de silicagel, además del timol como estándar a una concentración de 10 mg/mL. Las placas se eluyeron con cloroformo/benceno 1:1 y se revelaron con vainillina y calor. Análisis estadístico Para el análisis estadístico del aceite esencial obtenido en los diferentes materiales, se elaboraron cartas de control y diagramas de dispersión, para determinar el cumplimiento de los parámetros de calidad, en el equipo utilizado como estándar (cristalería de laboratorio). Todos los gráficos de control de calidad y los diagramas de dispersión se elaboraron con el programa QS WINDOWS. Para el control estadístico de los datos obtenidos en los análisis efectuados con cada aceite esencial extraído en los diferentes prototipos de extracción, se graficaron los resultados obtenidos en gráficos de control tipo “X”, determinando la media del estándar, el límite de control superior y el límite de control inferior, mediante la fórmula:

LCS = Χ + A2R LC = X LCI = X - A2R

Donde: LCS = Límite central superior

LC = Límite central o media de las muestras LCI = Límite central inferior X = media de las muestras A

2 = constante que depende del número de muestra

R = rango Posteriormente se analizaron las relaciones entre las variables involucradas mediante diagramas de dispersión, el cual se aplicó a la determinación de la solubilidad en etanol. Los resultados obtenidos en el análisis de cromatografía de gases de las muestras recolectadas durante 2007, se compararon mediante un análisis de similitud de

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componentes por agrupamiento en un cluster con el programa Statistica Versión 7. Para este tipo de análisis, únicamente se tomó en cuenta la presencia o ausencia de cada uno de los elementos presentes en las diferentes muestras analizadas.

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Cuadro 1. Colectas de Lippia graveolens s.l. Muestra Colecta Fecha Colector País

1 502 Octubre de 2007 Lorena López Guatemala

2 503 Octubre de 2007 Lorena López Honduras

3 504 Octubre de 2007 Lorena López Yucatán, Méx.

4 505 Octubre de 2007 Lorena López Campeche, Méx.

5 506 Septiembre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

6 508 Septiembre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

7 509 Septiembre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

8 510 Octubre de de 2007 Lorena López Durango, Méx.

9 511 Octubre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

10 512 Octubre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

11 513 Octubre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

12 515 Octubre de 2007 Lorena López Durango, Méx.

13 5956 Octubre de 2007 Socorro González Tamaulipas, Méx.

14 6301 Noviembre de 2007 Socorro González Nuevo León, Méx.

15 7540 Septiembre de 2008 Socorro González Coahuila, Méx.

16 690 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

17 691 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

18 693 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

19 695 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

20 696 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

21 697 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

22 698 Octubre de 2008 Celina González Zacatecas, Méx.

23 699 Octubre de 2008 Celina González Durango, Méx.

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RESULTADOS

Control de calidad del aceite esencial de orégano de algunas muestras recolectadas y del material nuevo y viejo

En general, los resultados obtenidos estuvieron influenciados por la procedencia de los materiales analizados y del estado de envejecimiento o madurez de los aceites esenciales, lo cual se observó en los distintos análisis realizados y los comparados con los de la literatura (Cuadro 2). Cuadro 2. Comparación de algunas propiedades fisicoquímicas del aceite de orégano.

Aceite esencial Nuevo Viejo Pino (1996)

Alaniz (1998)

Espinoza y Gómez

(2007) Media DE Media DE Media Media Media Rendimiento (%) 3.9 0.54 3.38 0.7754 2.2 5.09 1.55 Índice de refracción 1.49 0.0028 1.51 0.0023 1.50 1.49 1.52 Densidad g/mL 0.9446 0.0008 0.9372 0.0006 0.9218 0.94 0.954 Solubilidad en etanol (80%) 1.22 0.0289 1.17 0.0577 - - - Rendimiento Rendimiento del material recién recolectado y del material de donación. La extracción del aceite esencial de material vegetal viejo, presentó ligeramente menor rendimiento, por 100 g de muestra. Este hecho se debe probablemente, a que el material botánico de origen, no se guardó en las condiciones óptimas, por lo cual el contenido de varios de los componentes más volátiles, se volatilizaron dado su bajo peso molecular y puntos de ebullición menores de 40°C (Figuras 4, 5). Sin embargo, el material vegetal más nuevo, debería haber tenido un rendimiento mayor, pero en este caso la influencia de las mínimas condiciones de estrés a las cuales están sometidas las plantas de orégano del área experimental, no son las adecuadas comparadas con las que normalmente tienen las plantas de orégano silvestre. Aunado a este parámetro, este material se cortó ligeramente inmaduro, (Cuadro 3). Cuadro 3. Rendimiento del aceite esencial de material nuevo y viejo Tipo de orégano Rendimiento %/100 g Rendimiento %/g Nuevo (domesticado) 1.0 - 3.9 2.3 – 4.0 Viejo (donación) 1.0 – 3.1 3.3 – 4.7

Figura 4. Rendimiento del aceite esencial de orégano nuevo.

Figura 5. Rendimiento del aceite esencial de orégano viejo.

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Análisis organoléptico. Los resultados del análisis organoléptico muestran parámetros semejantes a excepción del color y del olor, que obviamente en el aceite esencial nuevo, el olor es mucho más fresco y penetrante (Cuadro 4). El caso específico del color, se observaron dos tonalidades del amarillo, una de ellas, amarillo – verdoso, probablemente debido a que el orégano del campo experimental, procede de diversos municipios del Estado de Durango, y el grado de densidad óptica es mayor en este aceite, en comparación con el del material más antiguo (Figura 6). Cuadro 4. Características organolépticas del aceite esencial de orégano Parámetro analizado Aceite esencial de orégano nuevo Aceite esencial de orégano viejo Apariencia Líquida, traslúcida, ligeramente

viscosa (muy fluida) Líquida, traslúcida, ligeramente viscosa (muy fluida)

Color (Densidad óptica)

Amarillo verdoso muy claro, D.O. = 1.4.

Amarillo muy claro (D.O. = 1.1).

Olor Característico al del timol y carvacrol Característico al del timol y carvacrol Sabor Característico, picante Característico, picante

00.20.40.60.8

11.21.4

Densidad óptica

Orégano nuevo Orégano viejo

Tipo de orégano

Figura 6. Densidad óptica 400-450 nm Índice de refracción. Este parámetro es uno de los más importantes, en el control de calidad de un aceite esencial, pues es característico para cada tipo de aceite e indica el grado de pureza del mismo. En general, esta medida fue muy similar en todas las muestras analizadas, a excepción de las muestras procedentes de dos municipios, los cuales también mostraron un análisis cromatográfico de capa fina diferente (Cuadro 5). Cuadro 5. Ïndice de refracción del aceite esencial de distintas colectas.

Muestra de aceite esencial Índice de refracción Nuevo 1.4862 Viejo 1.5059 Durango 1 1.505 Durango 2 1.477 Durango 3 1.4762

9

Durango 4 1.505 Durango 5 1.5061 Durango 6 1.502 Durango 7 1.505 Coahuila 1.505 Zacatecas 1.505

Las diferencias del índice de refracción encontradas entre los aceites esenciales de orégano nuevo y viejo, se debe principalmente a la procedencia de las muestras. El material donado, proviene de un solo municipio, mientras que el más nuevo, del campo experimental del CIIDIR-Durango (Figura 7).

1.461.465

1.471.475

1.481.485

1.491.495

1.51.505

1.51

Nuevo Viejo Dg1 Dg2 Dg3 Dg4 Dg5 Dg6 Dg7 Coah Zac

Procedencia

Índi

ce d

e re

frac

ción

Figura 7. Comparación del índice de refracción de orégano de distintas colectas.

Densidad. Las diferencias encontradas no fueron significativas aun cuando los aceites esenciales fueron extraídos de plantas de distintos lotes. Esta información podría contribuir hasta cierto grado, como un parámetro de aceptación de la densidad para los aceites esenciales de orégano del Estado de Durango (Cuadro 6, Figura 8). Cuadro 6. Densidad relativa de los aceites esenciales de orégano nuevo y viejo.

Tipo de orégano Picnómetro Balanza Mohr-Whestphal Nuevo 0.9446 0.9424 Viejo 0.9372 0.9348

0.928

0.93

0.932

0.934

0.936

0.938

0.94

0.942

0.944

0.946

Den

sida

d (g

/mL)

Picnómetro Balanza MWMétodo: Orégano viejo Orégano nuevo

Figura 8. Comparación de la densidad relativa del aceite esencial de orégano.

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Cenizas. En esta determinación, el valor obtenido del aceite esencial de orégano nuevo también es muy similar al del aceite esencial más antiguo, aunque se observan diferencias poco significativas, las cuales se deben a que el aceite esencial nuevo, contiene mayor número de componentes comparado con el aceite viejo, por la volatilización de algunos de éstos (Cuadro 7). Por lo que este análisis también es de gran ayuda para detectar la adulteración con otros aceites (Figura 9). Cuadro 7. Cenizas en los aceites esenciales de orégano nuevo y viejo.

Tipo de orégano Cenizas (%) Nuevo 0.0388 Viejo 0.0332

0.030.0310.0320.0330.0340.0350.0360.0370.0380.039

Cen

izas

(%)

Orégano viejo Orégano nuevo

Tipo de orégano

Figura 9. Determinación de cenizas en planta nueva y vieja.

Residuo a la evaporación. Este análisis puede determinar si la muestra ha sufrido algún tratamiento térmico o estuvo expuesta a un mal almacenamiento a temperaturas superiores a los 30°C. Y aunque los resultados obtenidos no fueron muy significativos, tal vez el orégano donado no se almacenó en las condiciones óptimas, que se requieren a temperaturas menores a 20°C (Cuadro 8, Figura 10). Cuadro 8. Residuo a la evaporación de los aceites esenciales de orégano nuevo y viejo.

Tipo de orégano Cenizas (%) Nuevo 0.1812 Viejo 0.1331

11

0

0.05

0.1

0.15

0.2

Res

iduo

a la

ev

apor

ació

n (%

)Orégano viejo Orégano nuevo

Tipo de orégano

Figura 10. Determinación del residuo a la evaporación. Solubilidad en etanol. Cada uno de los aceites esenciales se comportó de distinta forma en las diferentes mezclas de etanol, por lo que se observaron cambios significativos en el aceite esencial de orégano viejo. En general los volúmenes de las soluciones etanólicas de diferentes concentraciones, fue mucho menor, en el aceite del orégano de menor tiempo de almacenamiento, comparado con el utilizado en el orégano más joven (Cuadro 9). Las concentraciones etanólicas de 55 y 50 %, no se consideraron debido a que los volúmenes utilizados de éstas para solubilizar las muestras del aceite esencial, no se encontraron, y deben ser superiores a 250 mL. Por esta razón, estas concentraciones de etanol, se consideraron insolubles Figura 11). Cuadro 9. Solubilidad de los aceites esenciales en etanol de los oréganos nuevo y viejo.

Solución de etanol/agua (%) Aceite esencial nuevo Aceite esencial viejo 60 6.47 52.6 65 3.43 4.0 70 2.37 2.3 75 1.62 1.5 80 1.22 1.17 85 0.62 0.65 90 0 0.27 95 0 0

100 0 0

12

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9Tipo de orégano

Solu

bilid

ad (%

)

aeV aeN

Figura 11. Solubilidad del aceite esencial de orégano en etanol.

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Aceites esenciales obtenidos en equipos construidos con diferentes materiales Control de calidad En los diferentes equipos de extracción, no se realizó una comparación del rendimiento de los aceites esenciales debido a que cada equipo fue construido en diferentes dimensiones y capacidades, además los resultados no reflejarían una comparación confiable de los datos, puesto que solamente se estandarizó el equipo de acero inoxidable. Análisis Organoléptico El aspecto característico del aceite esencial de orégano, recién destilado, se presentó como un líquido ligeramente viscoso, aceitoso, amarillo claro, ocasionalmente con un ligero tinte verdoso, cuando se destiló en cristalería de laboratorio o en acero inoxidable. Sin embargo, los aceites extraídos en los otros equipos mantuvieron colores distintos: amarillo traslúcido más intenso, rojo o negro en aluminio, cobre y lámina galvanizada respectivamente. Con respecto al olor, el aceite esencial obtenido en los diferentes equipos de extracción, en general no se presentaron cambios en el olor del aceite, a excepción del obtenido en el prototipo de lámina galvanizada, el cual presentó un olor ligeramente más concentrado con respecto a los demás, pero dentro del mismo rango considerado “sui generis”. Color

En la determinación colorimétrica de los aceites esenciales, se trabajó con tres rangos de longitudes de onda debido a que los valores obtenidos de los aceites esenciales oscuro y rojo no se podían comparar en el rango de 400 – 450 nm (Cuadro 10).

La densidad óptica del aceite esencial extraído en vidriería de laboratorio registró una densidad óptica o una transmitancia, similares a la del aceite extraído en los prototipos de acero inoxidable y de aluminio en los tres rangos de longitudes de onda. En cambio, los aceites procedentes de los prototipos de cobre y lámina galvanizada, revelaron valores más altos (bajo porcentaje de transmitancia de luz), lo que es congruente con las tonalidades más oscuras (Figura 12). Cuadro 10. Densidad óptica del aceite esencial de orégano en distintos equipos de extracción

Equipo λ = 400 – 450 nm λ = 520-580 nm λ = 640 - 700 nm Cristalería de laboratorio

1.5 0.9 0.695

Acero inoxidable 1.4 0.87 0.685 Aluminio 1.4 0.85 0.686 Cobre - - 0.95 Lámina galvanizada 2 - 1.85

14

0

0.20.4

0.6

0.8

11.2

1.4

1.6

1.82

Den

sida

d óp

tica

Aceroinoxidable

Aluminio Cobre Láminagalvanizada

Vidrio

Materiales de construcción

λ = 640-700 nm

Figura 12. Densidad óptica de los aceites esenciales obtenidos en diferentes materiales de construcción.

Densidad relativa La densidad relativa obtenida por el método del picnómetro, fue similar a la obtenida con la balanza Mohr Westphal (Figura 13), a excepción del aceite esencial extraído en el equipo de aluminio, en el cual, la densidad es menor que la obtenida por medio del picnómetro. (Cuadro 11). Cuadro 11. Comparación de la densidad relativa del aceite esencial de orégano.

Equipo Balanza Mohr - Westphal Picnómetro Cristalería de laboratorio 0.9371 0.9345 Acero inoxidable 0.9372 0.9371 Aluminio 0.942 0.9438 Cobre 0.9351 0.9341 Lámina galvanizada 0.9272 0.9248

Figura 13. Densidad relativa del aceite esencial de orégano de distintos equipos de extracción. Índice de Refracción El índice de refracción del agua destilada utilizada fue de 1.333 a 17°C, el cual se comparó con los índices obtenidos y corregidos a la temperatura adecuada en los diferentes equipos de extracción. El mayor valor de índice de refracción lo tuvo el aceite obtenido en el prototipo de aluminio y el menor valor fue para el del equipo de lámina galvanizada (Cuadro 12). Probablemente por la reacción de algunos componentes del aceite con los metales presentes en los diversos materiales, por lo que los componentes formados, interfieren en la refracción de la luz y dichos valores son diferentes a los del aceite considerado como estándar.

Cuadro 12. Índice de refracción del aceite esencial de distintos equipos de extracción

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Figura 14. Índice de refracción del aceite esencial obtenido en distintos equipos.

Solubilidad del aceite esencial en etanol Los aceites esenciales fueron solubles generalmente en soluciones alcohólicas de 90 – 95%, poco solubles en las concentraciones etanólicas de 70 – 85 % e insolubles en soluciones alcohólicas superiores al 65 % (Figura 15).

Figura 15. Solubilidad en etanol de los aceites esenciales extraídos en diferentes equipos.

Residuo a la evaporación Las muestras extraídas en los prototipos de cobre y de lámina galvanizada, tuvieron mayores porcentajes, debido a que algunos componentes del aceite esencial de orégano reaccionaron con los metales presentes en los materiales de construcción y los pesos de estas sustancias cambiaron (Cuadro 13). Cuadro 13. Residuo a la evaporación de aceites esenciales

Figura 16. Residuo a la evaporación del aceite esencial de orégano obtenido en distintos equipos de extracción.

Cenizas Los resultados obtenidos demuestran que existen ligeras diferencias entre el aceite de los diferentes equipos de extracción. Sin embargo, son menores de 0.05 %. Así mismo, las cenizas del aceite esencial obtenido en cristalería de laboratorio, resultó ser superior al resto de los aceites, probablemente porque los componentes presentes no tuvieron ninguna reacción con la cristalería utilizada (Cuadro 14; Figura 17).

Cuadro 14. Cenizas de los aceites esenciales de distintos equipos.

Figura17. Cenizas del aceite esencial de orégano obtenido en distintos equipos de extracción.

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Análisis de cromatografía de gases Aceites esenciales nuevo y viejo Bajo las condiciones experimentales del equipo de cromatografía de gases, en el análisis del aceite esencial nuevo, se detectaron 38 compuestos (Figura 18 a), de los cuales solo se identificaron cuatro, por ser los de mayor importancia en estos aceites esenciales y por insuficiencia de estándares. En el aceite esencial viejo, se detectaron 24 compuestos (Figura 18b) y de igual manera, se identificaron cuatro de ellos (Cuadro 15). Esta diferencia se debe a la procedencia de las muestras. En el primer caso, el aceite obtenido proviene de una mezcla de plantas de varios municipios, en cambio, el orégano donado pertenece a un solo municipio del Estado. Cuadro 15. Componentes mayoritarios detectados en el aceite esencial nuevo y viejo.

(a) (b)

Figura 18. Cromatogramas de los aceites esenciales de orégano nuevo (a) y viejo (b).

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Aceites esenciales de orégano extraídos en diferentes equipos Los resultados obtenidos muestran aparentemente pocos cambios en cuanto a la presencia de los componentes mayoritarios del aceite esencial (Cuadro 16). Sin embargo en la composición química de cada uno de los compuestos, si se encontró variabilidad en el número de componente totales presentes y en la concentración de éstos (Figuras 19a,b; 20a,b; 21). Cuadro 16. Componentes mayoritarios detectados en los aceites esenciales obtenidos en los diferentes equipos de extracción. Los valores determinados en los diversos parámetros fisicoquímicos del aceite esencial de orégano extraídos en prototipos construidos de diversos materiales, sientan un precedente para su caracterización dentro de parámetros de calidad que deben exigirse al producto. Solamente el aceite esencial extraído en equipo de acero inoxidable tiene similitud con los parámetros de calidad del equipo estándar y puede recomendarse ampliamente para realizar extracciones a mayor escala, una vez estandarizados los parámetros de calidad para la caracterización del aceite esencial de orégano con el fin obtener un producto que satisfaga los requisitos y necesidades de los consumidores.

(a) (b)

Figura 19. Cromatogramas de los aceites esenciales de Cristalería de Laboratorio y Acero Inoxidable.

(a) (b) Figura 20. Cromatogramas de los aceites esenciales de Aluminio y Cubre.

Figura 21. Cromatogramas de los aceites esenciales de Lámina galvanizada.

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Análisis cromatográfico de las poblaciones de orégano Análisis de cromatografía de gases En esta fase del trabajo solamente se analizaron por cromatografía de gases 11 muestras procedentes de Nuevo León. Tamaulipas, Honduras, Guatemala y 7 muestras de Durango de las colectas de 2007, debido a que la temporada de colecta de esta planta madura inicia a finales de septiembre y termina en la primera quincena de octubre (Cuadro 17, Figuras 22, 23, 24). Cuadro 17. Componentes más importantes identificados en las diversas poblaciones de orégano

Figura 22. Componentes identificados en las diferentes poblaciones

de Lippia graveolens.

19

a) (b)

Figura 23. Cromatograma del aceite esencial de Lippia graveolens de a) Nuevo León; b) Guatemala.

a) (b)

Figura 24. Cromatograma del aceite esencial de Lippia graveolens de Durango 7 y Durango 9. Análisis de cromatografía en capa fina Estos resultados encontrados sirven como precedente para estudios posteriores sobre variación morfológica y fitoquímica del género Lippia. Así, este análisis cromatográfico corrobora la existencia de dos patrones de distribución diferentes (dos quimiotipos) de orégano para Durango. Sin embargo, al comparar el aceite esencial del orégano de Durango con otros estados de la República Mexicana, la mayoría de las muestras analizadas, señalan que sus componentes son muy similares, y también se presentan ciertas diferencias químicas. Obviamente las concentraciones de cada unos de éstos son muy diferentes, pues este parámetro depende de numerosos factores bióticos y abióticos. Es importante destacar que el aceite esencial procedente del orégano de Guatemala, presenta una composición química similar a la de Campeche, al menos así lo manifiesta el análisis de cromatografía en capa fina (Figura 25).

Figura 25. Variación de perfil de terpenoides en diferentes poblaciones de

Lippia graveolens por cromatografía en capa fina.

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CONCLUSIONES

La variabilidad de los componentes encontrados en los aceites esenciales es un factor muy importante que sugiere una posible relación del orégano de Durango con los oréganos de otras localidades vecinas y de Centroamárica. Sin embargo, se observaron marcadas diferencias en algunas zonas, en las cuales se distribuye esta planta, lo que sugiere realizar más colectas para encontrar el patrón de distribución de estos quimiotipos para que sean bien caracterizados con otras herramientas como la citogenética o la biología molecular y dilucidar si realmente se trata de otra especie distinta o es una variedad bien definida. Poro lo que con base en los resultados anteriores, los objetivos planteados indican que cuando el orégano no se almacena en las condiciones adecuadas, el tiempo de almacenamiento si influye en un momento dado, de manera significativa en el rendimiento y composición química de su aceite esencial, comparado con un material de recolección más reciente, además, las características físicas, químicas y biológicas se pueden alterar. Independientemente del origen y tiempo de almacenamiento del orégano, la concentración de los componentes mayoritarios más importantes que contienen este aceite esencial, como son el timol y carvacrol, está garantizada, aún en condiciones extremas de almacenamiento, pues estas sustancias son estables a temperaturas menores de 40°C. De igual forma, la composición química de dicho aceite podrá mantenerse estable por lo menos durante 3 años o más, sin importar su origen geográfico, genético, grado de estrés de la planta, siempre y cuando las condiciones de almacenamiento sean las óptimas. Con respecto al proceso de extracción del aceite esencial de orégano, las condiciones de operación del sistema empleado, independientemente del tamaño del equipo, deben optimizarse con base en las buenas prácticas del proceso para evitar alteraciones en el rendimiento, composición química, concentración de los componentes o de las propiedades fisicoquímicas del aceite. De esta manera se obtendrá un producto de calidad capaz de competir en los mercados Nacional e Internacional. La demanda del aceite esencial del orégano en el mercado internacional, implica necesidad de elaborar una Norma Oficial Mexicana para el aceite esencial de orégano, proveniente de los diversos quimiotipos de este arbusto mexicano, con la finalidad de dar un valor agregado al orégano y conseguir un precio superior al obtenido por la hoja deshidratada.

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IMPACTO SOCIAL Los resultados obtenidos aportarán un precedente con respecto a la información básica útil para contribuir al conocimiento de las diversas formas silvestres en las que se encuentra L. graveolens y coadyuvar en el discernimiento de que L. berlandieri pueda representar un taxón diferente o una variante morfológica, lo que ayudará posteriormente a determinar cuál de estos nombres debe aplicarse al orégano de mayor valor comercial. Así mismo, se pueden proporcionar elementos para su manejo y aprovechamiento óptimos, en la selección de germoplasma para procesos de domesticación. A la vez, se podrá ofrecer una alternativa para extraer el aceite esencial con calidad a nivel casero en equipos adecuados de bajo costo, con el respaldo del análisis de calidad, a través de sus atributos físicos y químicos con base en normas de calidad nacionales y aumentar el valor agregado del orégano.

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LITERATURA CONSULTADA

Alaniz G. L.,F. R. Castro, F. Gómez L. 2000. Contribución al estudio de la calidad del aceite esencial en orégano (Lippia graveolens H.B.K). Revista Chapingo. Serie Zonas Áridas. 1: 13-19. Compadre C., R. A. Hussain; I. León y R. G. Enríquez. 1987. Volatile constituents of Montanoa tomentosa and Lippia graveolens. Planta Medica 53: 495 – 496. Dirección General de Normas. NMX-F-077-1976. Determinación de residuo a la evaporación en aceites esenciales. México, D. F. 2p. Disponible en: http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-077-1976.PDF. Dirección General de Normas. NMX-K-081-1976. Determinación de la solubilidad en etanol en aceites esenciales y productos aromáticos. México, D. F. 4p. Disponible en: www.colpos.mx/bancodenormas/index.php?option=com_bookmarks&Itemid=40&catid=-1&task=view&mode=1&id. Dirección General de Normas. NMX-F-074-S-1981. Determinación del índice de refracción con el refractómetro de Abbé. México, D. F. 6p. Disponible en: http://www.colpos.mx/bancodenormas/index.php?option=com_bookmarks&Itemid=40&catid=4&task=view&mode=0&id=15&search=*. Dirección General de Normas. NMX-F-075-1987. Determinación de la densidad relativa de aceite esencial y productos aromáticos. México, D. F. 3p. Disponible en: www.colpos.mx/bancodenormas/index.php?option=com_bookmarks&Itemid=40&catid=-1&task=view&mode=3&id. Dirección General de Normas. NMX-FF-072-1990. Alimentos - especias y condimentos – terminología. México, D. F. 20p. Disponible en: www.colpos.mx/bancodenormas/index.php?option=com_bookmarks&Itemid=40&catid=-1&task=view&mode=1&id. Dirección General de Normas. NMX-F-607-NORMEX-2002. Determinación de cenizas en alimentos. México, D. F. 5p. Disponible en: http://www.normex.com.mx/Normas-que-Expedimos.html. Fischer U., R. López; E. Pöll; S. Vetter; J. Novak and Ch. M. Franz. 2004. Two chemotypes within Lippia alba populations in Guatemala. Flavour and Fragrance Journal 19: 333 – 335. Gotsiou P., G. Naxakis and M. Skoula. 2002. Diversity in the composition of monoterpenoids of Origanum microphyllum (Labiatae). Bioch. Sys. Ecol. 30: 865 – 879. Guimet F., R. Bouqué and J. Ferré. 2004. Cluster analysis applied to the exploratory analysis of commercial Spanish olive oils by means of excitation-emission fluorescence spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 52: 6673 – 6679. Gunnar, N. 2004. Metales: propiedades químicas y toxicidad. Enciclopedia de salud y seguridad en el trabajo. 4ª Ed. pp 63.1- 63.6. Gutiérrez P. H. 1997. Calidad total y productividad. Ed. Mc Graw Hill. pp. 127- 137. Hernández C.F., G. M. Hernández y V. R. Silva. 2007. Estudio y determinación de parámetros de calidad en el proceso de obtención del aceite esencial de orégano mexicano (Lippia berlandieri Shauer) en el estado de Chihuahua. CIRENA, Salaices, Chihuahua.

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Huerga C. C., A. P. Blanco, G. J. Abad. 2005. Aplicación de los gráficos de control en el análisis textil. pp. 125 -148. Instituto Politécnico Nacional. 1998. Densimetría II y Fotocolorimetría. Manual de prácticas de laboratorio de técnicas instrumentales pp.: 82-83 y 118-122. Oliveira D. R., G. G. Leitão, H. R. Bizzo, D. López, D. S. Alviano, C. S. Alviano and S. G. Leitão. 2007. Chemical and antimicrobial analyses of essential oil of Lippia origanoides H.B.K. Food and Chemistry 101: 236-240. Palacios J. L. 2001. Función y aplicabilidad del control estadístico de la calidad. Universidad complutense de Madrid. Pérez I., M. A. Blázquez and H. Boira. 2000. Chemotaxonomic value of the essential oil in species of Teucrium pumilum agrégate. Phytochemistry 55: 397 – 401. Pino J., A. Rosado; R. Baluja and P. Borges. 1989. Analysis of the essential oils of Mexican orégano (Lippia graveolens HBK). Die Nahrung 3: 289 – 295. Salgueiro L.R., C. Cavaleiro, M.J. Gonçalves; A. Proença da Cunha. 2003. Antimicrobial activity and chemical composition of the essential oils of Lippia graveolens from Guatemala. Letters 80 83. Sánchez G. E., I. M. Leal L., L. Fuentes H., C. Carballo G. y C. A. Rodríguez F. 2004. Investigaciones farmacognósticas en Origanum majorana L. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 9(1). Silva V. R. y A. G. Morales. 2008.

Ensayo de la calidad del aceite esencial de orégano

en el Estado de Chihuahua. RESPYN Edición Especial (1) www.respyn.uanl.mx/especiales/2008/ee-01-2008/documentos/carteles/23_Silva-Vazquez.pdf. Viljoen A.M., S. Subramoney; S.F. van Vuuren, K.H.C. Baser and B. Demirci. 2005. The composition, geographical variation and antimicrobial activity of Lippia javanica (Verbenaceae) leaf essential oils. J. Ethnopharmacol. 96: 271 – 277.