Tema 4 Anticuerpos

7/18/2019 Tema 4 Anticuerpos

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TEMA 4. ANTICUERPOS

Objetivos

-Estructura y función de los anticuerpos

-Caracterización de isotipos

-Unión Ac-Ag

-Anticuerpos monoclonales y policlonales: ventaja ylimitaciones

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Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier medio, así como la distribución y/o difusión a terceros



TEMA 4. ANTICUERPOS

Respuesta humoral: reconocimiento específico de antígenospor las inmunoglobulinas

Inmunoglobulinas: glicoproteínas presentes en suero yfluidos tisulares, en forma soluble (anticuerpos) o en lacubierta de linfocitos B (BCR)

En la fase de reconocimiento de la respuesta humoral seunen antígenos y anticuerpos:

-si en BCR: se produce progenie de linfocitos B queproducen anticuerpos específicos frente al antígeno queinteraccionó

-si libres: se unen a sus antígenos específicos

desencadenando mecanismos efectores

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ESTRUCTURA DE LAS INMUNOGLOBULINAS

2 cadenas pesadas (55-77 kDa) unidas por puentes S-S

2 cadenas ligeras (25 kDa), unidas a pesadas por ptes S-SEn ambos casos idénticas entre ellas

Nomenclatura: cadenas H (pesadas) y L (ligeras); dominios V(variables), y C (constantes); CHO (azúcares)

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Digestión con proteasas (Papaína y Pepsina):

-Fragmento de unión aantígeno (Fab): porción pordonde se une a antígeno

-Fragmento cristalizable (Fc):responsable de lasfunciones efectoras (uniónde otros componentes delsistema inmune)

Papaína origina:

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Cadenas pesadas constituidas por 4 repeticiones de unaunidad estructural o dominio inmunoglobulina (2 en las cadenas ligeras) formado por 2 cadenas

polipeptidicas ß integradas por 3 ó 4 hélices antiparalelas

Región bisagra (10-60 Aas)responsible de la flexibilidad

de Anticuerpos(unión a varios antígenos)

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Superfamilia de las inmunoglobulinasDr R. Toledo




Zonas de gran variabilidaden extremo N-terminal:Región variable (VLy VH)

Secuencias C-terminal:Región constante (CL y CH)

En zona V, 3 regiones de10 aminoácidos: regionesHipervariables (HV) o CDR(complementary determining regions)complementarias al antígenoy por las que se une a éste.Se flanquean por regiones FR(frame regions) que dan elplegamiento adecuado para laexposición de CDR

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CLASES Y SUBCLASES DE INMUNOGLOBULINAS

-A pesar de homogeneidad estructural hay clases y subclases

por regiones C de las cadena pesadas-5 isotipos (5 tipos de cadenas pesadas):

en IgGα en IgAµ en IgMδ en IgDε en IgE

-dentro de algunos isotipos hay diferencias: subclases (IgG1, IgG2, IgG3e IgG4; IgA1 e IgA2)

-2 tipos de cadenas ligeras (Kappa y Lambda)

Además las Igs secretadas (IgA e IgM) forman multímeros, unidos porpolipéptido J de 15 kDa (dímeros o pentámeros)

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cadena H

según laporción C

longitud de la porción C (en

aminoácidos)

clase o isotipo de Ig

330 IgG

440 IgM

330 IgA

330 IgD

e 440 IgE

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D R T l d



ISOTIPOS DE INMUNOGLOBULINASDr R. Toledo

D R T l d



IgG-Predominante en sangre y líquidos linfáticos,

cerebroespinal y peritoneal

-Pm 150 kDa-cadenas pesadas gamma (), ligeras ( o )-4 subclases IgG1>IgG2 (a y b)>IgG3>IgG4

Funciones biológicas:1- aglutinación y precipitación2-inmovilización de bacterias3-opsonización (IgG1 e IgG3)

4-ADCC5-neutralización toxinas y m.o.6-activación del complemento (IgG3)7-paso transplacentario (IgG1, IgG3, IgG4)8-inmunidad neonatal9-inhibición por retroalimentación

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S b l d I G í i Dr R Toledo



IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 % IgG total 70 20 7 3

Vida media(días)

23 23 7 23

Fijación delcomplemento

+ + +++ -

Pasotransplacentario

++ + ++ ++

Une FcR demacrófagos

+++ + +++ +

Subclases de IgG: características Dr R. Toledo


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IgM

-Macroglobulina (900 kDa) de

sueros y espacios intravasculares-Primera que aparece en reaccióninmune

-Vida media corta (5 días)-Pentámero unido por cadena J

y ptes S-S-En feto aparece 5º mes gestación

Funciones biológicas:1-Aglutinación2-Activación del complemento (fija C1q en CH1)

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Prohibida la reproducción total o parcial por cualquiermedio, así como la distribución y/o difusión a

terceros

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terceros

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IgA

-Dimérica de Pm 165 kDa

-Más abundante en mucosas (saliva, fluidogástrico, moco, lágrimas, sudor, leche)-Muy baja en suero (monómeros)-Principal Ig del calostro-2 clases (IgA1-93%- e IgA2-7%)-vida media 5.5 dias

Funciones biológicas:1-Neutralización toxinas y m.o.2- Inmunidad de mucosas

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IgE

-Una de las menos abundantes

en suero-Pm 200 kDa-Vida media 2 días

Funciones biológicas:1-ADCC2-Reacciones de hipersensibilidad3-Antiparasitarios

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IgD

-Poco abundante en suero

-Pm 180 kDa-No secretada por Linfocitos B-Formaría parte del BCR junto IgM(marcador de diferenciación de células B)

Funciones biológicas:No claramente definidasEliminación de células B que producen anticuerposautorreactivos durante desarrolloEn células B maduras sirve como Ig de superficie (junto IgM)que une antígeno.


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Isotipo IgG IgM IgA IgE IgD

Peso molecular (kDa) 150 900 160 ó500

190-200 150-200

Valencia 2 10 2 ó 4 2 2

Contenido en

carbohidratos

3% 12% 7-8% 12% 12-13%

Cadena pesada μ α ε δ

Clases 4 (2 Subcl.) 1-2 2 - -

Cadena J - Si Si - -

Componentesecretor

- - Si - -

Presente en mucosas - - Si - -Nivel sérico (mg/dL) 600-800 50-210 70-500 0,01-09 0,1-4

% Ig total 70-80 5-10 10-15 0,01 1

Síntesis (mg/Kg pesocorporal/día)

20-40 3-17 3-55 ¿ 0,4

% intravascular 45 76 42 52 75

Pasotransplacentario

Si No No No No

Fijación delcomplemento

++ +++ + - -

Une FcR demacrófagos

+++ - - - -

Unemastocitos/basófilos

- - - + -

Une NK + - - - -

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GENERACIÓN DE DIVERSIDAD DERECONOCIMIENTO DE ANTICUERPOS

La eficacia de la respuesta inmune depende de sucapacidad de reconocer antígenos de forma específica, ypara ello los receptores para Ag y los anticuerpos han deser capaces de reconocer muchos y muy diferentes Ags.

El nº total de especificidades (Inmunoglobulinas y TCRsdiferentes) puede ser 1015-1018

Para dar esta enorme diversidad, un numero limitadode genes se reordenan de forma aleatoria medianterecombinación somática


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PROCESO DE EXPRESION GÉNICA(NO INMUNOGLOBULINAS)


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EXPRESIÓN GÉNICA INMUNOGLOBULINASOrganización génica característica:a) Cadenas ligeras:

-genes C (regiones constantes)-genes V y J (variables)

b) Cadenas pesadas:-genes C (regiones constantes)

-genes V, D y J (variables)

Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier

medio, así como la distribución y/o difusión a

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Genes separados en el genoma y recombinasa cortaDr R. Toledo



Genes separados en el genoma, y recombinasa cortasegmentos al azar: CADENAS PESADAS

Variabilidad cadenas pesadas: 50Vx20Dx6J= 6000 cadenas H distintas



terceros

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terceros

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VARIABILIDAD CADENA LIGERA: EJEMPLO KAPPA

40 V x 5 J= 200 cadenas Kappa

40 V x 4 J= 160 cadenas lambda


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Genes V son múltiples en líneasgerminales

1) Diversidad de unión (adición de nt,que se arrastran al recombinar: nt P;Enzima TdT: deoxinucleotidiltransferasa terminal )

2) Hipermutación somática (mutacionespuntuales en H y L durante la vida deLinfocitos B). Más mutaciones tras 2ºcontacto con Ag zona VDJ 105 veces más

probable mutación

Ó Í

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UNIÓN DE LOS ANTICUERPOS A LOS ANTÍGENOSReconocen los epítopos y se unen a ellos por la regionhipervariable (CDR)

La unión es reversible, no covalente (ptes. H; van der Waals;interacciones hidrofóbicas)

K1(asociación)Ac+Ag Ac-Ag

<--

K2 (disociación)

K1= __[Ag-Ac]__[Ag] [Ac]


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CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS CON LADr R. Toledo



CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS CON LAUNIÓN ANTICUERPO-ANTÍGENO

Unión compleja, con diferentes anticuerpos, y algunos

(pentámeros) pueden unir hasta 10 epítopos (reg. bisagra)PARÁMETROS QUE CARACTERIZAN LA UNIÓN:

1. ESPECIFICIDAD:-Ac capaces de detectar pequeñas diferencias entre Ag, así:

-un anticuerpo solo se unirá al epítopo que lo genera o a otrosmuy similares.-Es necesaria para evitar que Ac reaccionen frente a moléculas propiasEn ocasiones Ac inducido por un Ag1 reacciona con un Ag2, diferentepero relacionado estructuralmente: Reacción cruzada

Inmunidad homóloga: inducida por Acs formados frente a Ag.Los Acs son capaces de neutralizar a los Ag que los han generado

Inmunidad heteróloga: donde en ocasiones los Acs pueden neutralizar Agdiferentes, pero estructuralmente relacionados, a los que los generaron.


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Reacción cruzada: anticuerpo (Ab) de una especificidad

dada puede unirse a 2 epítopos diferentes


terceros

PARÁMETROS QUE CARACTERIZAN LA UNIÓN Ac Ag:

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PARÁMETROS QUE CARACTERIZAN LA UNIÓN Ac-Ag:

2. AFINIDAD Y AVIDEZ

Afinidad: fuerza del enlace entre un único sitio de combinación deun anticuerpo y un epítopo de un antígeno.Es directamente proporcional a la K de asociación

Avidez: fuerza total de la unión del Acal Ag, que tiene en cuenta la unión detodos los sitios a todos los epítoposdisponibles

La avidez aumenta casi geométricamente

para cada lugar ocupado


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terceros

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Interacciones multivalentes son importantes biológicamente.En concentración adecuada de Ac y Ag se forma red, concomplejos que pueden precipitar o aglutinar en lazona de equivalencia.

Si hay exceso de uno de ellos: Fenómeno de zona

ANTICUERPOS ANTI-INMUNOGLOBULINAS:Dr R. Toledo



ANTICUERPOS ANTI-INMUNOGLOBULINAS:ALOTIPOS E IDIOTIPOS

Las inmunoglobulinas al ser proteínas son capaces deprovocar respuesta inmune. Son inmunógenas, e inoculadasinducen la producción de anticuerpos anti-IgSe inmuniza una especie animal con Ig de otra especie: elconjunto de anticuerpos generados se llama antisuero

Utilidad:-diagnóstico (anticuerpos secundarios)-determinación de isotipos de Ig-utilidad en Biología (frente a cualquier proteína)


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Anticuerpos anti-inmunoglobulinas se pueden producir frente

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Anticuerpos anti-inmunoglobulinas se pueden producir frentea diferentes epítopos:

Isotopos: epítopos en regiones

constantes (CH). Conjunto demoléculas con misma especificidad esisotipo = clase de anticuerpo.

Alotopos: misma Ig, variaciones (1-4 Aa)

en CH y CL (variantes alélicas). Conjuntode moléculas comparten especificidadse llama alotipo.

Idiotopos: variaciones en determinantesantigénicos de las regiones variables(VH, VL). Pueden o no coincidir conparatopo (lugar unión a epítopo).Conjunto de moléculas con estaespecificidad son idiotipo.


terceros

DIFERENCIAS INMUNOGLOBULINASDr R. Toledo



DIFERENCIAS INMUNOGLOBULINAS

ISOTÍPICAS ALOTÍPICAS IDIOTÍPICAS


terceros

ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES

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ANTICUERPOS POLICLONALES Y MONOCLONALES

Frente a un Ag se produce un conjunto

de anticuerpos con especificidadesdiferentes por diferentes epítopos:Anticuerpos policlonales

Anticuerpos monoclonales: específicosde un epítopo (un clon de linfocitos B).

Se producen experimentalmente encantidades ilimitadas


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OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

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OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

(Köhler y Milstein, 1975)

Se fusionan linfocitos B con células de mieloma: hibridomasProhibida la reproducción total o parcial por cualquier medio, así como la distribución y/o difusión a terceros

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Células mieloma: -son células tumorales inmortales-son plasmáticas y se da fusión facilmente con linfo B-no producen Ac

-tienen defecto en enzima Hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) (vía de rescate de purinas)

Aminopterina bloquea síntesis de

purinas, así células no fusionadasmueren en HAT

Linfo B no fusionados no soninmortales y mueren naturalmente


terceros

FASES PRODUCCIÓN MAc:Dr R. Toledo



FASES PRODUCCIÓN MAc:

1. Inocular Antígeno a ratón2. Evaluar policlonal (Pac)

3. Fusionar cél. bazo (Linfo B+)con mielomas en PEG4. Selección en HAT placas5. Evaluar sobrenadantes y

localizar clones positivos6. Expandir cultivo7. Opcional: inocular cultivo en

raton y producir tumor (ascitisrico en Acs)

Hibridomas:-inmortales-no producen Ac

autorreactivos

-HGPRT+ Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier


terceros

APLICACIONES DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

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APLICACIONES DE ANTICUERPOS MONOCLONALES

-Identificación de los marcadores fenotípicos dediferentes tipos celulares (Ej: CD).

-Inmunodiagnóstico: las técnicas más avanzadas estánbasadas en la detección de antígenos de agentesinfecciosos o anticuerpos con ellos-Diagnóstico y tratamiento de tumores: los

monoclonales específicos de tumores e inmunoterapia(Erzetina el mas reciente).-Análisis funcional. Moléculas de superficie celular yproteínas secretadas: la unión del monoclonal aproteínas de superficie celular es útil para determinar sufunción.Los anticuerpos monoclonales frente a moléculasbloquean su función y se pueden utilizar paradeterminar esta (Ej: conocimiento de la función de

citocinas)Prohibida la reproducción total o parcial por cualquier


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IFI

MAc anti-manoproteínas pared celular de Cand ida albicans

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MAc anti-manoproteínas pared celular de Cand ida albicans

IHC

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C ti



Cuestiones:

-¿Porqué las inmunoglobulinas libres no activan células conreceptores para Fc?

-¿La presencia de IgG en suero de un recién nacido implica que hasufrido la infección? ¿y la de IgM?

-¿Qué anticuerpo temdrá mas sensibilidad, un monoclonasl o un

policlonal? ¿y más especificidad?

-¿Cómo puedo detectar la presencia específica de un isotipo enuna muestra?

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