ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus

Copyright 2018 Carolina González Camacho

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus EN LA

DESLIGNIFICACIÓN DE CASCARILLA DE ARROZ EN CULTIVO

SEMISÓLIDO

Proyecto de grado

Por

CAROLINA GONZÁLEZ CAMACHO

Presentado a la facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERA QUÍMICA


Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química

Bogotá D.C

Junio 2018


ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus EN LA

DESLIGNIFICACIÓN DE CASCARILLA DE ARROZ EN CULTIVO

SEMISÓLIDO

Proyecto de grado

Por

CAROLINA GONZÁLEZ CAMACHO

Presentado a la Facultad de Ingeniería de la


En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERA QUÍMICA

Aprobado por:

Asesora, Rocío Sierra Ramírez, PhD. Co-asesores, Luis Jorge Cruz Reina, BSc Juan Sebastián Chiriví Salomón, MSc Jurado, Luis Humberto Reyes, PhD. Director del departamento: Andrés González Barrios, PhD.

Departamento de Ingeniería Química

Junio 2018

iii


ABSTRACT

Study of the Enzymatic Activity of Pleurotus ostreatus in the delignification of risk husk

in semi-solid culture.

Carolina González Camacho, BSc.

Universidad de los Andes, Colombia

Adviser: Rocío Sierra Ramírez, PhD.

Co-Advisers: Luis Jorge Cruz Reina, BSc,. and Juan Sebastián Chiriví Salomón, MSc.

The production of ethanol from agro-industrial waste has been widely studied in recent years as a

source of renewable energy. The rice husk is an agro-industrial waste with a large amount of

fermentable sugars for the production of biofuels, however, it is necessary to release those sugars

with a pretreatment due to the content of lignin in the rice husk. In this study, the activity of the

lignocellulolytic enzymes (laccase, manganese peroxidase, lignin peroxidase, exoglucanase, and

endoglucanase) were quantified from the liquid fraction of the semi-solid culture of Pleurotus

ostreatus, which is used as a biological pretreatment for the delignification of rice husks. After the

pre-treatment, the delignification and the loss of dry weight and carbohydrates of the rice husk were

evaluated. Finally, the comparison of three methods of quantification of sugars from enzymatic

hydrolysis: High Performance Liquid Chromatography, Miller's method and the Trinder’s method,

was carried out.

As a result of the pretreatment, 11.85% of delignification was obtained. In addition, a cellulose and

hemicellulose losses of 28.35% and 32.78% were achieved, respectively. A weight loss of 16.65%

was also obtained. The achieved delignification is attributed mainly to the action of the laccase

which reached an enzymatic activity of 14170.65 U/L, being more than 15 times greater than the

maximum activity of manganese peroxidase registered (868.11 U/L). No activity of lignin

peroxidase was found, whereby the absence of this enzyme was confirmed. The loss of cellulose

was mainly due to the activity of the exoglucanase which remained constant during the pretreatment

and reached a maximum value of 1305.47 U/L. In addition, the endoglucanase was not quantified

in the semi-solid culture but a qualitative screening was performed in a different culture, using

carboxymethylcellulose as the sole carbon source.

From the comparison of the three methods of quantification of sugars studied, we concluded that

the methods that best describe the profile of production of sugars with greater precision are HPLC

iv


and the Miller’s method. On the other hand, we do not recommend the Trinder’s method for the

quantification of glucose in this type of culture.

Key words: Biological pretreatment, lignocellulose, quantification methods, sugars.

v


RESUMEN

Estudio de la actividad enzimática de Pleurotus ostreatus en la deslignificación de

cascarilla de arroz en cultivo semisólido.

Carolina González Camacho, BSc.

Universidad de los Andes, Colombia

Asesor: Rocío Sierra Ramírez, PhD.

Co-Asesores: Luis Jorge Cruz Reina, BSc,. and Juan Sebastián Chiriví Salomón, M.Sc

La producción de etanol a partir de residuos agroindustriales ha sido altamente estudiada en los

últimos años como una fuente de energía renovable. La cascarilla de arroz es un residuo

agroindustrial con una gran cantidad de azúcares fermentables para la producción de

biocombustibles, sin embargo, su contenido de lignina hace necesario un pretratamiento para la

liberación de dichos azúcares. En el presente estudio se realizó la cuantificación de la actividad de

las enzimas lignocelulolíticas: lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, exoglucanasa y

endoglucanasa, en la fracción líquida del cultivo semisólido de Pleurotus ostreatus como

pretratamiento biológico para la deslignificación de cascarilla de arroz. Posterior al pretratamiento

realizado, se evaluó la deslignificación y la pérdida de peso seco y de carbohidratos de la cascarilla

de arroz. Adicionalmente, se realizó la comparación de tres métodos de cuantificación de azúcares

provenientes de hidrólisis enzimática: cromatografía líquida de alta resolución, método de Miller y

método de Trinder.

Gracias al pretratamiento realizado, se obtuvo una deslignificación de 11,18% además de una

pérdida de celulosa y hemicelulosa del 28,35% y 32,78%, respectivamente, y una pérdida de peso

seco de 16,65%. La deslignificación obtenida se atribuye principalmente a la acción de la lacasa,

la cual alcanza una actividad enzimática de 14170,65 U/L, superando más de 15 veces la actividad

máxima de manganeso peroxidasa registrada la cual fue de 868,11 U/L, y en contraparte, no se

encontró actividad de lignina peroxidasa, por lo cual se confirmó la ausencia de esta enzima. La

pérdida de celulosa se debió principalmente a la acción de la exoglucanasa, la cual registró una

actividad constante durante el tratamiento y alcanzó un valor máximo de 1305,47 U/L. Además, no

se logró cuantificar la endoglucanasa en el cultivo semisólido, pero se realizó un rastreo cualitativo

de la misma en un cultivo diferente, usando carboximetilcelulosa como única fuente de carbono.

vi


A partir de la comparación de los tres métodos de cuantificación de azúcares estudiados, se

concluyó que los métodos que mejor describen el perfil de producción de azúcares con una mayor

precisión son el HPLC y el método de Miller. Por su parte, el método de Trinder no se recomienda

para la cuantificación de glucosa en este tipo de cultivo.

Palabras clave: Pretratamiento biológico, lignocelulosa, métodos de cuantificación, azúcares.

vii


AGRADECIMIENTOS

A mi hermana y mis padres por su paciencia, apoyo y amor incondicional. A mis amigos

por acompañarme y ser mi segunda familia. Agradezco a mi asesora y co-asesores por sus

consejos, especialmente a Luis Cruz quien fue mi mano derecha, me motivó, me apoyó y

me dejó múltiples enseñanzas para la vida.

viii


NOMENCLATURA

HPLC High performance liquid chromatography

DNS Ácido 3,5-dinitrosalicílico

CMC Carboximetilcelulosa

ABTS Ácido 2-,2-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)

PO Pleurotus ostreatus

pH Potencial de Hidrógeno

U/L Unidades de actividad enzimática por litro

LiP Lignina peroxidasa

VA Alcohol veratrílico

MnP Manganeso proxidasa

VP Versátil peroxidasa

ix


TABLA DE CONTENIDO ABSTRACT…………………………………………………………………… iii RESUMEN……………………………………………………………………. v AGRADECIMIENTOS……………………………………………………….. vii NOMENCLATURA………………………………………………………….. viii TABLA DE CONTENIDO…………………………………………………… ix LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………. xi LISTA DE TABLAS………………………………………………………….. xiii OBJETIVOS………………………………………………………………….. xiv CAPÍTULOS I INTRODUCCIÓN…………………………………………….…………1 1.1. Material lignocelulósico……………………………………………2 1.1.1. Celulosa…………………………………………………...3 1.1.2. Hemicelulosa……………………………………………...5 1.1.3. Lignina…………………………………………………….5 1.2 Degradación microbiológica………………………………………..7 1.3 Pleurotus ostreatus………………………………………………….8 1.4. Complejo enzimático lignocelulolítico…………………………….9 1.4.1. Enzimas celulolíticas……………………………………..9 1.4.2. Enzimas ligninolíticas……………………………………10 1.4.2.1. Lacasa (EC.1.10.3.2)…………………………...11 1.4.2.2. Manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13)………...13 1.4.2.3 Lignina peroxidasa (EC.1.11.1.14)……………..15 1.5. Deslignificación biológica…………………………………………17 II METODOLOGÍA……………………………………………................20 2.1. Preinóculo y cultivo………………………………………………..20 2.2 Métodos de cuantificación de azúcares…………………………….21 2.2.1. HPLC……………………………………………………...21 2.2.2. Método de Miller o DNS…………………………………21 2.2.3. Glucosa libre por método de Trinder…………………….22 2.3. Evaluación de la actividad enzimática…………………………….23 2.3.1. Actividad de la lacasa…………………………………….23 2.3.2. Actividad de la manganeso peroxidasa…………………..24 2.3.3. Actividad de la lignina peroxidasa……………………….24 2.3.4. Actividad de la exoglucanasa…………………………….25 2.3.5. Rastreo de actividad de la endoglucanasa……………….25 2.4 Medición de lignina y carbohidratos……………………………….26 III RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………….............28

3.1 Comparación de técnicas de cuantificación de azúcares……………..28

x


3.2 Medición de actividad enzimática……………………………………..34 3.2.1 Lignina peroxidasa…………………………………………..34 3.2.2 Lacasa………………………………………………………..36 3.2.3 Manganeso Peroxidasa………………………………………37 3.2.4 Exo-1,4-B-D-glucanasa……………………………………...40 3.2.5 Endo-1,4-B-D-glucanasa…………………………………….42 3.3 Medición de lignina y carbohidratos…………………………………..45

IV CONCLUSIONES …………………….……………………..………….47 V TRABAJO FUTURO …………………….…………………….. ………49 REFERENCIAS…………………………………………………………………50 ANEXOS………………………………………………………………………...54

xi


LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de los materiales lignocelulósicos…………………………………3

Figura 2. Estructura de la celulosa amorfa y cristalina………………………………….4

Figura 3. Estructura molecular de la celulosa…………………………………………...4

Figura 4. Estructura molecular de la lignina…………………………………………….6

Figura 5. Representación esquemática del complejo celulolítico………………………10

Figura 6. Ciclo catalítico de la lacasa……………………………………………...……12

Figura 7. Esquema de la acción del sistema lignocelulolítico…………………………..18

Figura 8. Cultivo de P. ostreatus en medio semisólido…………………………………20

Figura 9. Comparación de resultados de técnicas de cuantificación de azúares. a. HPLC,

DNS y método de Trinder. b. HPLC y método de Trinder. c. DNS y HPLC……………30

Figura 10. Gráfica de efectos principales para la desviación estandar, tienendo en cuenta

los métodos HPLC y Trinder…………………………………………………………….31

Figura 11. Gráficas de intervalos obtenidas en Minitab, se resaltan los datos

significativamente diferentes tras pruebas de Tukey. a. DNS. b. HPLC. c. Kit de glucosa

(método de Trinder)……………………………………………………………………...34

Figura 12. Absorbancia obtenida en el ensayo para cuantificación enzimática de la

lignina peroxidasa………………………………………………………………………..35

Figura 13. Actividad enzimática de la lacasa……………………………………………37

Figura 14. Actividad enzimática de la manganeso peroxidasa………………………….38

Figura 15. Curva de pH del extracto enzimático………………………………………..40

Figura 16. Actividad enzimática de la exoglucanasa……………………………………42

Figura 17. Resultado de la decoloración del rojo congo por el extracto enzimático

del día 27…………………………………………………………………………………43

xii


Figura 18. Resultados de la prueba de decoloración del rojo congo. a. Prueba con P.

ostreatus. b. Control negativo con P. ostreatus. c. Prueba con Ganoderma lucidum d.

Control negativo con Ganoderma lucidum……………………………………………....44

xiii


LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Porcentajes perdidos después del pretratamiento………………………………45

Tabla 2. Relaciones de selectividad……………………………………………………..46

xiv


OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la actividad de las enzimas ligninolíticas manganeso peroxidasa, lignina

peroxidasa y lacasa, y de las enzimas celulolíticas del cultivo semisólido en la

deslignificación de cascarilla de arroz usando Pleurotus ostreatus.

Objetivos específicos

• Comparar tres metodologías de cuantificación de azúcares para la evaluación de

actividad celulolítica en el cultivo semisólido.

• Cuantificar la actividad de las enzimas ligninolíticas manganeso peroxidasa, lignina

peroxidasa y lacasa, y las enzimas celulolíticas endo-b-D-1,4-glucanasa y exo-b-

D-1,4-glucanasa, producidas por Pleurotus ostreatus en cultivo semisólido.

• Evaluar la relación entre la deslignificación obtenida en el cultivo semisólido y la

actividad enzimática observada.


CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

El agotamiento de los combustibles fósiles y las desventajas que estos conllevan como la

emisión de gases de efecto invernadero, conduce a la búsqueda de fuentes de energía

alternativas que sean renovables como la biomasa lignocelulósica (Sindhu, Binod, &

Pandey, 2016), la cual constituye la base para la producción de los llamados

biocombustibles de segunda generación, que se caracterizan por ser subproductos de la

industria alimentaria sin valor económico. La conversión de material lignocelulósico a

bioetanol es una alternativa que contribuye a frenar la concentración de gases de efecto

invernadero en la atmósfera, además de proveer una alternativa barata, renovable y

accesible al obtenerse a partir de residuos agroindustriales tales como el bagazo, la

cascarilla de arroz, la cascarilla de trigo, entre otros, los cuales de no ser utilizados terminan

quemándose en grandes cantidades (Ghorbani, Karimi, Biria, Kariminia, & Jeihanipour,

2015). Esta biomasa está conformada por: celulosa (un polímero de D-glucosa),

hemicelulosa (un azúcar heteropolimérico) y lignina (una unidad polimérica no

fermentable). Estos compuestos se encuentran unidos en una matriz con minerales, aceites,

azúcares solubles y otros componentes en menor proporción (Mohanram, Rajan, & Carrier,

2015).

Según Agrocadenas, el arroz es el tercer producto agrícola en extensión en Colombia

después del café y el maíz, y por cada tonelada de arroz producida se generan tres toneladas

de residuos (Muñoz, 2012). Por lo tanto, la cascarilla de arroz es un abundante residuo

agroindustrial generado en Colombia, y en la actualidad, el alto potencial de utilización de

los carbohidratos poliméricos de la cascarilla de arroz aún permanece sin explotar debido

2


a su naturaleza recalcitrante, lo que conlleva una difícil degradación para el

aprovechamiento de sus azúcares. (Mohanram, Rajan, & Carrier, 2015). La composición

de la cascarilla de arroz reportada por la bibliografía es: celulosa entre 28,7% y y 35,6%,

hemicelulosa entre 12,0 y 29,3% y lignina entre 15,4 y 20% (Furkan & Remzi).

Para liberar los carbohidratos de la pared celular, que posteriormente pueden ser

convertidos en etanol por medio de fermentación alcohólica, primero se debe realizar un

pretratamiento para romper los complejos componentes de la lignina. Varios tipos de

pretratamiento han sido investigados, y pueden ser categorizados en: físicos, químicos,

fisicoquímicos y biológicos (R, Shukla, Tiwari, & Srivastava, 2014). El objetivo común

de estos pretratamientos es reducir el tamaño de la biomasa y abrir su estructura física.

El pretratamiento biológico se realiza empleando hongos de podredumbre parda y blanca,

que tienen gran preferencia por la biomasa lignocelulósica y son capaces de degradar la

lignina a un bajo costo, menor impacto ambiental y menor producción de sustancias tóxicas

que el resto de pretratamientos. Sin embargo, aún es necesario mejorar este proceso, para

hacerlo más eficiente y a mayor escala (Montoya, 2012). Este proyecto de grado se enfocó

en un pretratamiento biológico para la deslignificación de la cascarilla de arroz usando un

hongo de podredumbre blanca.

1.1. Material lignocelulósico

La biomasa lignocelulósica se encuentra compuesta principalmente por tres polímeros:

celulosa, hemicelulosa y lignina; junto con pequeñas cantidades de otros componentes

como grupos acetilo, minerales y grupos fenólicos. Dependiendo del tipo de biomasa

3


lignocelulósica, estos polímeros se organizan en estructuras tridimensionales, no uniformes

y complejas de diferentes grados variando la composición relativa.

En la Figura 1 se aprecia la conformación de los materiales lignocelulósicos en los cuales

la lignina se envuelve a la hemicelulosa y la celulosa para protegerlas.

Figura 1. Estructura de los materiales lignocelulósicos. (Martinez, 2014)

1.1.1. Celulosa

Es el material orgánico más abundante del planeta y las plantas la sintetizan como material

estructural para sostener su peso. Es un biopolímero compuesto de unidades de D-glucosa,

las cuales están unidas por enlaces glucosídicos b(1,4) que le confieren estabilidad.

Las estructuras longitudinales de celulosa son llamadas microfibrillas y están conformadas

por zonas cristalinas en las cuales se encuentran ordenadas debido a una gran red de puentes

de hidrógeno intramoleculares e intermoleculares que unen las unidades de glucosa

(Furkan & Remzi) y por zonas amorfas en donde se encuentran desorganizadas porque la

mayoría de grupos hidroxilo en la glucosa se encuentran amorfos (Chen, 2014). En la

Figura 2 se aprecia la estructura amorfa y cristalina de la celulosa.

4


Figura 2. Estructura de la celulosa amorfa y cristalina. (Martinez, 2014)

La celulosa se ha convertido en una materia prima muy importante en la industrial del

papel, textiles e industria química. Además de la relevancia de la energía limpia que se

puede generar a partir de materiales lignocelulósicos, lo cual será la energía del futuro.

(Chen, 2014)

En la Figura 3, se muestra la estructura molecular de la celulosa, la unidad de glucosa y el

dímero de glucosa llamado celobiosa.

Figura 3. Estructura molecular de la celulosa (Chen, 2014)

5


1.1.2. Hemicelulosa

Las hemicelulosas son polisacáridos con grupos heterogéneos constituidos de diferentes

unidades de azúcares, siendo el segundo polisacáridos más abundante en la pared celular

de las plantas. Las clasifican según los principales azúcares de su cadena principal en

xilanos, xiloglucanos, mananos y glucomananos. Las ramificaciones de hemicelulosas

consisten en oligosacáridos, una cadena pequeña típicamente entre 1 y 4 unidades de D-

galactosa, D-manosa, L-arabinosa, D-xilosa, L-fucosa, L-ramnosa y/o D-ácido

glucurónico. Sin embargo, las unidades constituyentes, la estructura y el contenido de

hemicelulosa varía dependiendo de cada especie. Su función principal es unirse a las

microfibrillas de celulosa para proporcional rigidez a la planta (Prinsen, 2010).

1.1.3. Lignina

Es un biopolímero aromático no polisacárido que se encuentra principalmente en la pared

celular de las plantas, formando parte de una pared ordenada junto con las microfibrillas

de la celulosa y le da una gran resistencia a ataques microbianos, además de evitar la

degradación de la celulosa.

La lignina está compuesta por tres monómeros los cuales son: alcohol p-cumarílico, alcohol

coniferífilo y alcohol sinapílico, a partir de los cuales resultan las tres unidades de lignina:

p-hidroxifenil, guaiacil y siringil (Chen, 2014).

En la Figura 4, se puede observar una conformación aproximada de la molécula de lignina.

6


Figura 4. Estructura molecular de la lignina. (Chen, 2014)

A través del estudio de diferentes tipos de modelos estructurales de la lignina, se ha

establecido que es un polímero amorfo complejo con una red tridimensional que se

compone básicamente de unidades de fenilpropano unidas entre sí por enlaces C-C y C-O.

Estos modelos estructurales solo describen una estructura hipotética que se infiere de los

resultados obtenidos en los estudios. Además, diferentes plantas o incluso la lignina aislada

7


de la misma planta podría tener diferentes tipos de enlaces y diferente composición de

grupos funcionales, resultando en una estructura muy compleja (Chen, 2014).

1.2 Degradación microbiológica

En la naturaleza, diferentes microorganismos desarrollaron durante su evolución,

mecanismos fisiológicos para enfrentar diversos factores ambientales. La adquisición de

nutrientes representa un desafío especialmente importante para los microorganismos. El

saprofitismo, uno de los estilo de vida más comunes de los microorganismos, involucra

vivir en materia orgánica muerta. En este contexto, los microorganismos desarrollaron

mecanismos para obtener energía a partir de la biomasa de las plantas, y uno de estos

mecanismos involucra la producción y secreción de enzimas que trabajan sinérgicamente

para degradar la pared celular de las plantas. (de Souza, 2013)

Respecto a la degradación de lignina, muchos basidiomicetos de pudrición blanca y

algunos actinomicetos son capaces de producir enzimas degradadoras de lignina,

especialmente peroxidasas y lacasas que solubilizan la lignina trabajando sinérgicamente.

La degradación microbiológica de lignina es usualmente complicada, ya que se tienen tres

grandes retos respecto a la estructura de la lignina: (1) la lignina es un polímero muy

grande, por lo tanto, el sistema enzimático debe ser esencialmente extracelular, (2) el

mecanismo de degradación enzimática debe ser oxidativo en lugar de hidrolítico ya que la

estructura de la lignina tiene enlaces C-C y éter, y (3) la estereoquímica de la lignina es

irregular, requiriendo enzimas con menor especificidad que las enzimas hidrolíticas

requeridas para la degradación de la celulosa y hemicelulosa. Las enzimas mejor

caracterizadas hasta ahora, capaces de degradar el polímero de lignina son lignina

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peroxidasa (EC.1.11.1.14) lacasa (EC.1.10.3.2), manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13) y

versátil peroxidasa (EC.1.11.1.16) (de Souza, 2013).

1.3 Pleurotus ostreatus

Pleurotus ostreatus es un hongo basidiomiceto de podredumbre blanca, el cual tiene alto

valor nutricional, además de propiedades terapéuticas y aplicaciones biotecnológicas,

especialmente por su alta capacidad de biodegradación. (Córdoba & Cultid, 2015)

El crecimiento de los hongos de pudrición blanca requiere de sustratos que les

proporcionen características físicas y composición química adecuada para su desarrollo y

los materiales lignocelulósicos cumplen a cabalidad con estas condiciones. (Montoya,

2012). Las hifas invaden rápidamente las células de la madera y secretan enzimas y

metabolitos que provocan la despolimerización de la hemicelulosa, celulosa y la

fragmentación de la lignina. (Gaitan & Perez, 2007)

Existen ciertos factores que afectan el crecimiento de Pleurotus ostreatus tales como la

temperatura, pH, aireación, humedad y luz. El rango de temperatura óptima se encuentra

entre 25ºC y 33ºC para crecimiento micelial. El crecimiento máximo del micelio de la

mayoría de especies de Pleurotus ocurre a una humedad relativa entre 60-95%. El pH

adecuado de oscila entre 6,0-7,0. Estas especies requieren oscuridad para el crecimiento

miceliar e iluminación para la fructificación. La concentración de dióxido de carbono es

muy importante para el desarrollo de Pleurotus, además se debe tener una buena

ventilación (Córdoba & Cultid, 2015).

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1.4. Complejo enzimático lignocelulolítico

El complejo de enzimas lignocelulíticas, producidas por los hongos de pudrición blanca,

se conforma por las enzimas celulolíticas, que degradan la celulosa; las ligninolíticas, que

degradan la lignina y las xilanolíticas que degradan xilanos (hemicelulosa).

1.4.1. Enzimas celulolíticas

El complejo de celulasas se conforma por tres enzimas las cuales son: endo-1,4-b-D-

glucanasa (E.C.3.2.1.4), exo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91) y b-glucosidasa

(EC.3.2.1.21); las cuales trabajan sinérgicamente para degradar la celulosa (Montoya,

2012).

La endo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4) actúa en primer lugar produciendo una

disminución en el grado de polimerización de la celulosa al realizar cortes al azar en la

parte amorfa de la molécula (Montoya, 2012) y en regiones no terminales, produciendo

glucosa, celobiosa y celotriosa (Gupta & Lee, 2008). Gracias a la acción de la endo-1,4-b-

D-glucanasa (E.C.3.2.1.4), se generan sitios para que la exo-1,4-b-D-glucanasa

(E.C.3.2.1.91) actúe en los extremos no reductores, generando cortes secuenciales en la

parte cristalina de la celulosa y de esta forma libera unidades de glucosa y celobiosa y otros

oligosacáridos de cadena corta (Gupta & Lee, 2008). Debido a lo anterior, se puede

destacar que la endo-1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.4) actua en sustratos con baja

cristalinidad tales como celulosa amorfa y carboximetilcelulosa (Montoya, 2012) y la exo-

1,4-b-D-glucanasa (E.C.3.2.1.91) actúa en sustratos cristalinos como Avicel y papel de

filtro (Montoya, 2012). Finalmente la b-glucosidasa (E.C.3.2.1.21) emplea como sustrato

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las celobiosas y oligosacáridos de bajo grado de polimerización resultantes de la acción de

las endo y exo glucanasas, hidrolizando sus enlaces para liberar glucosa, el cual es el

producto final de la acción de las celulasas que sirve como fuente de energía para el hongo

(Gupta & Lee, 2008).

Figura 5. Representación esquemática del complejo celulolítico (de Souza, 2013)

1.4.2. Enzimas ligninolíticas

Como su nombre lo indica, este grupo de enzimas producidas por los hongos de pudrición

blanca se encarga de la biodegradación de la lignina generando tanto la despolimerización

de la molécula como la transformación de las sustancias derivadas para incorporarlas en

las rutas generales del metabolismo. El sistema ligninolítico es poco específico y está

compuesto por peroxidasas y oxidasas; las principales enzimas de este complejo son:

lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa. Sin embargo, no todos los hongos de

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pudrición blanca contienen el total de enzimas ligninolíticas (Córdoba & Cultid, 2015).

Además de estas enzimas, se ha reportado otro tipo de enzima ligninolítica llamada versátil

peroxidasa, la cual se encuentra dentro del complejo ligninolítico de P. ostreatus. La

versátil peroxidasa es específica para Mn+2 al igual que la manganeso peroxidasa y además

oxida sustratos fenólicos y no fenólicos que son típicos de la lignina peroxidasa (Wong,

2009).

1.4.2.1. Lacasa (E.C.1.10.3.2)

La lacasa es una oxidoreductasa que actúa en difenoles y sustancias afines como donantes

y utiliza oxígeno como aceptor. Esta enzima requiere cobre y oxígeno para realizar la

oxidación de los sustratos mediante la transferencia de un electrón resultando en la

formación de radicales libres. (Córdoba & Cultid, 2015).

La ecuación general del ciclo catalíco de la lacasa es la siguiente:

4𝑅𝐻 + 𝑂& → 4𝑅 + 𝐻&𝑂(1)

RH: Sustrato, donador de electrones

El sitio activo de cada molécula de lacasa tiene cuatro iones cobre, uno tipo 1 (T1), uno

tipo 2 (T2) y dos tipo 3 (T3). Los sitios T2 y T3 están organizados en un único grupo.

(Córdoba & Cultid, 2015)

La siguiente figura esquematiza el ciclo catalítico de la lacasa, el cual consta de cuatro

pasos.

12


Figura 6. Ciclo catalítico de la lacasa. (Wong, 2009)

Como lo establece (Wong, 2009), el ciclo catalítico de la lacasa se lleva a cabo en los

siguientes pasos:

1. En el primer paso ocurre la reducción del sustrato por el cobre en el sitio T1. Los

electrones tomados del sustrato son transferidos a los sitios T2/T3 resultando en la forma

totalmente reducida de la enzima. Para esto se requiere la oxidación de 4𝑒 tomados de

cuatro moléculas diferentes de sustrato.

2. Ocurre la reducción de O2, en la cual se genera la formación de enlaces con los sitios T2

y T3, generando un intermediario peróxido y la transferencia de electrones desde T3.

13


3. Se produce el rompimiento del enlace O-O por reducción de 2𝑒 que genera una molécula

de agua. Se obtiene un radical oxi intermediario.

4. Finalmente, se oxidan los cuatro iones de cobre y se libera O-2 en forma de una segunda

molécula de agua.

La acción de la lacasa por si sola se restringe a los compuestos fenólicos de la lignina,

debido a que las unidades no fenólicas tienen un potencial redox mayor. Por lo tanto, la

lacasa solo es capaz de romper los enlaces de los compuestos no fenólicos de la lignina con

la acción de un mediador; el cual es una molécula que actúa como un transportador de un

electrón entre la lacasa y el sustrato a ser oxidado. (Munk, Sitarz, Kalyani, Mikkelsen, &

Meyer, 2015)

El mediador más estudiado es el ABTS (ácido 2,2'-azino-bis-(3-etillbenzotiazolin-6-

sulfonico), el cual es capaz de ser oxidado por la lacasa además de oxidar las estructuras

de la lignina. Además, su tamaño reducido le permite ingresar a la pared celular para actuar

en grupos fenólicos y no fenólicos presentes en su interior. El mecanismo de acción del

sistema lacasa-mediador sugiere que inicialmente el oxígeno oxida la enzima, la cual

posteriormente oxida al mediador generando un radical libre y, finalmente, el mediador

oxidado se difunde dentro de la molécula de lignina y la oxida (Córdoba & Cultid, 2015).

1.4.2.2. Manganeso peroxidasa (EC.1.11.1.13)

La manganeso peroxidasa (E.C.1.11.13) es una oxidoreductasa que actua con peróxido de

hidrógeno como primer aceptor de electrones. Es una hemoproteína con fuerte preferencia

por el Mn+2 como sustrato, oxidándolo a Mn+3. El Mn+3 se libera del sitio activo en

presencia de un quelante que lo estabiliza. El ion acomplejado de Mn+3 se difunde en la

14


pared de lignina en donde oxida compuestos fenólicos de la lignina y otros sustratos

orgánicos.

La principal reacción catalizada por la MnP es la oxidació del Mn2+ a Mn3+ por el H2O2

como se muestra a continuación:

2𝑀𝑛&0 + 2𝐻0 + 𝐻&𝑂& → 2𝑀𝑛10 + 2𝐻&𝑂(2)

El ciclo catalítico, según (Wong, 2009) se explica a continuación:

Inicia con la generación del compuesto MnP-I por la acción del peróxido de hidrógeno

𝑀𝑛𝑃 + 𝐻&𝑂& → 𝑀𝑛𝑃3 + 𝐻&𝑂(3)

Posteriormente, se genera la oxidación de Mn2+ por el compuesto MnP-I

𝑀𝑛𝑃3 + 𝑀𝑛&0 → 𝑀𝑛𝑃33 + 𝑀𝑛10(4)

El ciclo termina con una segunda oxidación de Mn2+, lo cual vuelve a generar la enzima

nativa

𝑀𝑛𝑃33 + 𝑀𝑛&0 → 𝑀𝑛𝑃 +𝑀𝑛10 + 𝐻&𝑂(5)

El Mn3+ formado media la oxidación de sustratos orgánicos con el siguiente mecanismo

𝑀𝑛10 + 𝑅𝐻 → 𝑀𝑛&0 + 𝐻0(6)

Sin embargo, el ion Mn3+ es un oxidante con una vida media corta en medios acuosos

(Córdoba & Cultid, 2015), por lo cual es necesario la acción de un quelante para formar un

complejo estable. Oxalato y malonato son óptimos quelantes secretados en grandes

cantidades por los hongos. Otras funciones fisiológicas se han atribuido a estos quelantes

15


incluyendo el mejoramiento de la actividad enzimática por su habilidad de facilitar la

disociación del ion Mn3+ de la enzima. Por otro lado, el complejo Mn3+-quelante, actúa

como un oxidante de sustratos fenólicos, ya que tiene la capacidad de difundirse fácilmente

para producir intermediarios radicales que llevan a ruptura de enlaces y reordenamientos

en la molécula de lignina. Sin embargo, para la oxidación de sustratos no fenólicos, es

necesaria la formación de radicales en presencia de un segundo mediador. En estos casos,

el ion Mn3+ en presencia de tioles, media la oxidación de estructuras como benzil alcoholes

a sus respectivos aldehídos generando radicales tiilo los cuales pueden substraer un

hidrógeno del sustrato y mediante reacciones no enzimáticas generar los productos finales.

(Wong, 2009)

1.4.2.3. Lignina peroxidasa (EC.1.11.1.14)

La lignina peroxidasa (LiP) (E.C.1.11.1.14), al igual que la MnP es una oxidoreductasa que

actúa con peróxido de hidrógeno como primer aceptor de electrones. La reacción catalítica

se da inicialmente con una oxidación del grupo hemo formando un radical catión de Fe en

el sitio activo que posteriormente se reduce. La LiP no puede difundirse en la lignina para

actuar directamente sobre esta debido a su gran tamaño molecular, pero puede usar alcohol

veratrílico como sustrato, oxidándolo para generar un radical libre que puede difundirse en

la lignina para oxidarla (Córdoba & Cultid, 2015). La LiP puede actuar tanto en sustratos

fenólicos como en sustratos no fenólicos los cuales incluyen Azure B y alcohol veratrílico

(Montoya, 2012).

La reacción catalítica global es la siguiente:

16


1,2𝑏𝑖𝑠 3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑓𝑒𝑛𝑖𝑙 𝑝𝑟𝑜𝑝𝑎𝑛𝑜– 1,3– 𝑑𝑖𝑜𝑙 + 𝐻&𝑂&

3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑏𝑒𝑛𝑧𝑎𝑙𝑑𝑒ℎí𝑑𝑜

+ 1– 3,4– 𝑑𝑖𝑚𝑒𝑡𝑜𝑥𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜– 1,2– 𝑑𝑖𝑜𝑙 + 𝐻&𝑂(7)

Según (Wong, 2009), el ciclo catalítico de la LiP conlleva los pasos explicados a

continuación: Primero, se da la oxidación de 2𝑒 de LiP gracias a la acción de H2O2, lo cual

genera el compuesto LiP-I

𝐿𝑖𝑃 + 𝐻&𝑂& → 𝐿𝑖�3 + 𝐻&𝑂(8)

Seguido, se lleva a cabo una reducción por un sustrato reductor, como el alcohol veratrílico

(VA) lo cual genera el compuesto LiP-II y un radical catiónico.

𝐿𝑖𝑃3 + 𝑉𝐴 → 𝐿𝑖𝑃33 + 𝑉𝐴.0(9)

Finalmente, el ciclo acaba con una segunda reducción mediante la cual la enzima vuelve a

su forma nativa y se genera un segundo radical catiónico.

𝐿𝑖𝑃33 + 𝑉𝐴 → 𝐿𝑖𝑃 + 𝑉𝐴.0(10)

La lignina peroxidasa se asocia en gran medida con el rompimiento de la lignina porque es

capaz de oxidar compuestos aromáticos asociados a la lignina tales como guaiacol, ácido

vainíllico, ácido siríngico, entre otros. Estos compuestos tienen enlaces b-O-4, el cual es el

más abundante en la lignina, representando el 50% de los enlaces en gimnospermas y el

60% en angiospermas. (Wong, 2009)

La LiP, puede oxidar tanto sustratos fenólicos como no fenólicos. La oxidación de sustratos

fenólicos ocurre por la reducción de LiP-I a LiP-II en la cual se crean radicales fenoxi a

17


partir del sustrato, que en presencia de oxígeno pueden reaccionar para generar productos

por el rompimiento de sus enlaces. A diferencia del alcohol veratrílico, los radicales fenoxi

no pueden generar la enzima nativa de la forma en la que se muestra en la ecuación 10, lo

cual puede generar un rápido decaimiento en la actividad enzimática. Sin embargo, se le

ha atribuido al alcohol veratrílico la tarea de cerrar este ciclo catalítico para generar enzima

nativa ya que es un metabolito que se genera en la hifa del hongo al mismo tiempo que la

LiP. Por otro lado, para la oxidación de sustratos no fenólicos, se requiere la formación de

un catión radical por medio de la oxidación de 1𝑒, seguido por el rompimiento de enlaces

y otras reacciones no enzimáticas para generar los productos finales. (Wong, 2009)

La macromolécula de lignina se compone de 10 a 20% de compuestos fenólicos y de 80 a

90% por compuestos no fenólicos, por esta razón los hongos de podredumbre blanca deben

contar con mecanismos con alto potencial de oxidoreducción mediante el cual las unidades

de lignina puedan ser convertidas a compuestos fenólicos para fomentar la oxidación por

la acción de lacasa y MnP. (Montoya, 2012)

1.5 Deslignificación biológica

La deslignificación biológica modera las condiciones de reacción, genera mayor

rendimiento, menos reacciones secundarias y menor demanda energética que la

deslignificación química, sin embargo requiere mucho más tiempo. (Sanchez, Sierra, &

Alméciga, 2011)

La deslignificación tiene un efecto directo en la disponibilidad de los azúcares

fermentables, lo cual aumenta significativamente el rendimiento de la producción de

18


bioetanol. Se ha demostrado que una deslignificación de apenas 8% puede incrementar la

disponibilidad de azúcares en hasta un 20%. (Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011)

La Figura 7 esquematiza la acción del sistema ligninolítico de los hongos, encargado de la

deslignificación biológica. Sobre la lignina actuan las lacasas, lignina peroxidasa y

manganeso peroxidasa, entre otras, generando radicales producto de la despolimerización

de la lignina. Las enzimas MnP y LiP requieren peróxido de hidrógeno para poder realizar

su ciclo catalitico, esta sustancia la encuentran como producto de otras reacciones

catalíticas del complejo enzimático lignocelulítico tales como la oxidación de la glucosa

por la enzima glucosal oxidasa (GOX) y la oxidación de un metabolito llamado glioxal por

la enzima glioxal oxidasa (Glox) (Montoya, 2012). Lo anterior demuestra como las

enzimas celulolíticas y ligninolíticas se complementan para trabajar sinérgicamente en la

degradación de los polímeros de la pared celular de las plantas.

Figura 7. Esquema de la acción del sistema lignocelulolítico. (Montoya, 2012)

19


Es importante la selección de un microorganismo con baja actividad celulolítica ya que la

hidrólisis de la celulosa se considera como una reacción secundaria indeseable cuando se

realiza un pretratamiento con el objetivo de disponibilizar azúcares para producir bioetanol.

(Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011). La deslignificación biológica se ha combinado con

tratamientos químicos, obteniendo hasta un 80% de deslignificación, lo cual sugiere que la

combinación de ambos métodos es una gran alternativa para aumentar la disponibilización

de azúcares, promoviendo la producción de combustibles amigables con el medio ambiente

(Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011).

20


CAPÍTULO II

METODOLOGÍA

2.1. Preinóculo y cultivo

El preinóculo se preparó colocando 5 mL de medio Sabouraud con dextrosa y extracto de

levadura (SDY) en tubos de ensayo y añadiéndole 15 plugs de P. ostreatus. Posteriormente,

se incubó a 25ºC en la oscuridad durante 5 días.

En un frasco de mermelada previamente esterilizado en autoclave con capacidad de 500

mL se agregaron 26,5g de cascarilla de arroz molida, el contenido del preinóculo y 85 mL

de medio basal. Se cubrió con aluminio y se dejó en la incubadora a 25ºC. Al quinto día de

incubación se añadió una solución 1M de CuSOR.

Se tomaron 2 muestras de extracto enzimático cada semana durante 4 semanas por

triplicado, para un total de 24 cultivos.

Figura 8. Cultivo de P. ostreatus en medio semisólido.

21


2.2. Métodos de cuantificación de azúcares

Se emplearon tres técnicas diferentes para cuantificar azúcares, las cuales son el uso de

cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC), el método de Trinder empleando un kit de

glucosa y el método de Miller que usa ácido 3,5-dinitrosalicílico, mejor conocido como

DNS.

2.2.1. HPLC

El HPLC cuantifica la concentración de glucosa en los viales que se le introduzcan usando

un detector de Índice de Refracción y una columna HPX-87P. De esta manera se puede

tener la curva de glucosa libre en el medio, lo cual permite estudiar el comportamiento de

Pleurotus ostreatus en los días de cultivo.

2.2.2. Método de Miller o DNS

El método del DNS se basa en la oxidación del ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3,5-

amino-nitrosalicílico en la presencia de un azúcar reductor. Cuando se da esta reacción se

produce una coloración naranja-marrón por lo que se pueden cuantificar los azúcares

reducidos por espectrofotometría (Miller, 1959) ; para esto, se agregan 3mL de DNS a la

solución que se quiere medir y se coloca por 5 minutos en agua en ebullición y

posteriormente se detiene la reacción con un baño de hielo por otros 5 minutos y se mide

la absorbancia a una longitud de onda de 540nm. Para conocer la concentración de azúcares

teniendo la absorbancia se debe hacer una curva de calibración empleando glucosa (Adney

& Baker, 2008).

22


Á𝑐𝑖𝑑𝑜3,5– 𝑑𝑖𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + 𝐷–𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎

→ Á𝑐𝑖𝑑𝑜3,5– 𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜– 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑠𝑎𝑙𝑖𝑐í𝑙𝑖𝑐𝑜 + Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜(11)

La ecuación 11 muestra la reacción entre el DNS y una molécula de D-glucosa

2.2.3 Glucosa libre por método de Trinder

El kit de glucosa que emplea el método de Trinder contiene una enzima llamada glucosa

oxidasa (GOD) la cual cataliza la reacción de oxidación de glucosa, que genera peróxido

de hidrógeno. Este peróxido de hidrógeno se detecta mediante un aceptor cromogénico de

oxígeno en presencia de peroxidasa (POD). De esta manera se cuantifica la concentración

de glucosa presente en un medio con la absorbancia a una longitud de onda de 505nm; para

esto se adicionó 1mL de reactivo RT (que viene en el kit) y 10µL de extracto enzimático,

posteriormente se agitó con un vortex y se incubó a 37ºC por 10 minutos y finalmente se

midió la absorbancia. El kit contiene una solución patrón para convertir la absorbancia a

concentración en g/L. (spinreact, s.f.)

Las ecuaciones 12 y 13 muestran las reacciones del método

𝐻&𝑂 + 𝑂& + 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎Z[\

𝐻&𝑂& + Á𝑐𝑖𝑑𝑜𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜(12)

𝐻&𝑂& + 𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙 + 𝐴𝑚𝑝𝑖𝑟𝑜𝑛𝑎^[\

𝑄𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 + 𝐻&𝑂(13)

23


2.3. Evaluación de la actividad enzimática de complejo lignocelulolítico de P.

ostreatus

2.3.1 Actividad de la lacasa (E.C.1.10.3.2)

Se preparó una solución de ABTS 1mM en buffer acetato de sodio con pH 4,5 y se

adicionaron 50 µL de extracto enzimático en 950 µL de solución y se registró el incremento

de la absorbancia por espectrofotometría por 10 minutos tomando la absorbancia cada

minuto a una longitud de onda de 436 nm. La actividad se cuantificó siguiendo la ley de

Beer-Lambert:

𝑈𝐿 =

𝐴𝑉b𝐹c𝑡𝜀𝑉e𝑙

14

Donde,

𝐴𝑡

= Pendienteobtenidaallinealizarlosresultadosdeabsorbanciadurantelos10minutosdereacción

Vw = Volumendelacelda(1mL)

Fz = Factordedilución

ε = Coeficientedeextinciónmolara436nm. 29.3mM��cm��

V� = Volumendelamuestra. 50µL

l = longituddelacelda. 1cm

Se usaron 950 µL de solución con 50 µL de agua destilada como blanco.

24


La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima requerida para

oxidar 1µmol de ABTS en un minuto. (Kyung & Park, 2008)

2.3.2 Actividad de la manganeso peroxidasa (MnP) (E.C.1.11.1.13)

Se utilizó una solución 0,01% de rojo fenol en buffer succinato de sodio 0,2M con pH 4,5

y sulfato de manganeso (0,22 g/L) como sustrato. A una celda de cuarzo para

espectrofotómetro se agregaron 500µL de sustrato con 500µL de extracto enzimático y

10µL de peróxido de hidrógeno como iniciador de la reacción y se incubó por 10 minutos

a 30ºC. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 430nm (Gomaa, 2005). Se hizo

una prueba control en la cual no se agregó sulfato de manganeso al buffer (Vares, Kalsi, &

Hatakka, 1995). El blanco de las pruebas fue 500µL de agua destilada y 500µL de buffer.

Usando la diferencia de absorbancias entre la prueba control y la prueba con MnSO4 se

calculó la actividad con la ley de Beer-Lambert. La unidad de actividad enzimática se

define como la cantidad de enzima requerida para oxidar 1µmol de rojo fenol en un minuto.

2.3.3 Actividad de la lignina peroxidasa (LiP)(E.C.1.11.1.14)

Se midió la actividad siguiendo la oxidación del alcohol veratrílico. En una celda de cuarzo

se agregaron 200µL de buffer tratrato de sodio 0,25M con pH 3, 40µL de alcohol

veratrílico, 750µL de extracto enzimático y 10µL de peróxido de hidrógeno para un

volumen de reacción de 1mL. El blanco constó de la misma preparación reemplazando el

peróxido de hidrógeno por agua destilada (Córdoba & Cultid, 2015). Se midió la

absorbancia a una longitud de onda de 310nm durante 4 minutos y se calculó la actividad

25


con la ley de Beer-Lambert. La unidad de actividad enzimática se define como la cantidad

de enzima requerida para oxidar 1µmol de alcohol veratrílico en un minuto.

2.3.4 Actividad de la exoglucanasa (E.C.3.2.1.91)

Se usaron 500µL de celulosa cristalina Avicel al 1% en buffer citrato de sodio 50 mM con

pH=5,0 en reacción con 500µL de extracto enzimático a 50ºC por 60 minutos. La reacción

se detuvo con la adición de DNS y se empleó esta técnica para determinar la concentración

de azúcares reductores. Una unidad de actividad enzimática (UE) está definida como la

producción de 1µmol de azúcares reductores en un minuto. (Montoya S. , 2008)

Se usó como blanco 3mL de DNS con 1mL de agua destilada. Además, se realizó un control

negativo reemplazando extracto enzimático con agua y con control positivo con enzimas

celulasas de laboratorio.

2.3.5. Rastreo de actividad de la endoglucanasa (E.C.3.2.1.4)

La carboximetilcelulosa (CMC), es el sustrato para la endoglucanasa y por lo tanto puede

ser utilizada para determinar su actividad. Para la determinación cuantitativa de la

endoglucanasa se realizó el mismo protocolo empleado para la evaluación de la

exoglucanasa reemplazando Avicel por CMC. Para el rastreo cualitativo, se cultivó el

hongo en un medio con CMC y posteriormente se agregó una solución con rojo congo el

cual forma un complejo con la CMC, diferenciando las zonas en las cuales esta se encuentra

intacta y degradada. Para esto, se preparó un medio de cultivo con CMC 0,1% P/V, y en

condiciones asépticas se transfirió a cajas de petri y se inoculó, posteriormente se incubó a

25ºC en la oscuridad hasta que el diámetro de la colonia fue de aproximadamente 30mm.

26


Seguido, se inundaron las cajas de petri con una solución de rojo congo 0,15% P/V y se

dejaron reposar por 15 minutos. Pasados los 15 minutos, se vaciaron las cajas de petri y se

lavaron con agua destilada y luego, se inundaron con la solución desmanchante que consta

de NaCl 1M, por otros 15 minutos. Finalmente, pasados los 15 minutos, se vació el

contenido de las cajas y se observó el halo de decoloración. (Pointing, 1999)

Se realizaron 7 cajas de petri para Pleurotus ostreatus de las cuales 2 pertenecían a

controles negativos para los cuales se omitió la CMC del agar. Además se realizaron

controles positivos utilizando el hongo Ganoderma lucidum..

Con el fin de rastrear la actividad del cultivo semisólido cualitativamente, se realizó un

agar con CMC pero en lugar de inocular con el hongo, se agregaron 50µL de extracto

enzimático en un agujero creado en la mitad de la caja de petri con un pitillo y se dejó

incubar por 24 horas. Posteriormente se realizó el procedimiento de manchado y

desmanchado como se explicó anteriormente. En este procedimiento se evaluaron extractos

enzimáticos tomados en 5 días de cultivo diferentes y por duplicado.

2.4 Medición de lignina y carbohidratos

Se cuantificó la cantidad de lignina y carbohidratos presentes en la cascarilla de arroz antes

y después del pretratamiento, utilizando el protocolo NREL/TP-510-42-618

“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass” (Sluiter, y otros,

2011). Siguiendo este protocolo, se realizó una separación de la lignina, la hemicelulosa y

la celulosa por medio de una hidrólisis ácida. La cuantificación de lignina fue gravimétrica,

y la cuantificación de hemicelulosa y celulosa se realizó en fase acuosa con HPLC.

27


Para saber la selectividad del hongo para degradar lignina o carbohidratos, se empleó la

siguiente ecuación:

𝑅𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎

%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑜(15)

Además se conoció la selectividad del hongo entre carbohidratos con la siguiente ecuación:

𝑅𝑒𝑙𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝐶 =%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐻𝑒𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎%𝑃𝑒𝑟𝑑𝑖𝑑𝑜𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 (16)

28


CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Comparación de técnicas de cuantificación de azúcares

La Figura 9.a muestra el perfil obtenido para la concentración de azúcares durante 27 días

de cultivo por medio de las tres técnicas estudiadas. Se puede observar que las tres técnicas

difieren en la concentración de azúcar reportada, siendo el método del DNS el que reporta

mayor cantidad de azúcares, seguido de HPLC y finalmente el método de Trinder.

La técnica del DNS tiene varios defectos comprobados, siendo el mayor de estos la pérdida

de una parte de los azúcares reductores que se están analizando; esta complicación puede

ser asociada a reacciones de descomposición del azúcar en la solución alcalina. Si esta

hipótesis es correcta, la reacción del grupo aldehído del azúcar con el reactivo DNS puede

verse como una reacción secundaria en competencia. Además, diferentes azúcares pueden

generar diferente intensidad de color y diferentes concentraciones de los constituyentes del

reactivo DNS también pueden generar diferentes cantidades de coloración, así como

pueden destruir la glucosa presente en el medio (Miller, 1959).

Diferencias entre los resultados de HPLC y el método de Trinder

En la Figura 9.b se pueden observar las discrepancias entre HPLC y el método de Trinder.

En primer lugar, es posible notar que el comportamiento de ambas gráficas es diferente ya

que la gráfica obtenida con el método de Trinder muestra inicialmente una disminución de

la concentración de glucosa en el extracto enzimático, seguido de un aumento leve y

posteriormente otra disminución hasta llegar a una concentración final de glucosa menor

29


que la inicial. Por otro lado, el HPLC muestra un aumento de glucosa hasta el día 15 y

posteriormente un decrecimiento.

Es importante notar que la desviación estándar es muy diferente entre los resultados de los

dos métodos de cuantificación graficados en la Figura 9.b, ya que la desviación obtenida

con el método de Trinder es muy alta, lo cual podría explicar la diferencia en la

cuantificación de glucosa entre los resultados de ambos métodos. Para comprobar

estadísticamente la precisión de los métodos, se realizó un Análisis de Varianza one-way

(ANOVA) usando los métodos de cuantificación como factor y los resultados obtenidos

por estos como respuesta, y se obtuvo un p-value < 0,05, lo cual ratifica que la

concentración es significativamente diferente dependiendo del método empleado. Además,

se compararon las desviaciones estándar de ambos métodos, obteniendo que estas sean

significativamente diferentes. Este resultado se ve reflejado en la gráfica de efectos

principales en la Figura 10.

Para entender el origen de estas diferencias, es necesario estudiar el método de Trinder,

este método propuesto por Trinder en 1969 como un forma para medir glucosa en sangre

usando glucosa oxidasa y un aceptor de oxígeno alternativo a los que se usaban en la época

(Trinder, 1969). Es decir, es un método originalmente creado para un propósito diferente

al que está siendo empleado ya que se estudiaron las posibles interferencias que pudiera

tener con elementos que se encuentran en la sangre tales como hemoglobina, drogas,

anticoagulantes, entre otros. Sin embargo, no se conocen los efectos que pueda tener todos

los metabolitos y demás sustancias presentes en el extracto enzimático trabajado.

30


a. H

PLC

, DN

S y

Mét

odo

de

Tri

nder

b. H

PLC

y M

étod

o de

Tri

nder

c. D

NS

y H

PLC

Figura 9. Comparación de resultados de técnicas de cuantificación de azúares. a. HPLC,

DNS y método de Trinder. b. HPLC y método de Trinder. c. DNS y HPLC.

02468

10121416

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Con

cent

raci

ón (g

/L)

Días

DNS HPLC Trinder

1,86

3,373,91

4,845,68

4,83

2,692,262,26

1,491,91

3,59 3,322,63 2,28

0,94

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Con

cent

raci

ón (g

/L)

Días

HPLC Trinder

2,35

6,468,45 8,51

13,44

8,68

4,473,28

1,863,37 3,91

4,84 5,68 4,832,69 2,26

02468

10121416

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Con

cent

raci

ón (g

/L)

Días

DNS HPLC

31


Figura 10. Gráfica de efectos principales para la desviación estandar, tienendo en cuenta

los métodos HPLC y Trinder.

El método de Trinder no es recomendable para medir glucosa en un extracto

enzimático

En el estudio llamado “Evaluation of Trinder’s Glucose Oxidase Method for Measuring

Glucose in Serum and Urine”, se evaluaron diferentes posibles fuentes de interferencias

con el método y se encuentra que sustancias tales como ácido ascórbido, ácido gentísico,

glutatión, levadopa y maltosa, generan errores en la concentración de glucosa medida. Sin

embargo, se estudiaron también las posibles interferencias con otros azúcares tales como

xilosa, fructosa y galactosa y no se encontraron interferencias, confirmando la gran

especificidad del método por la glucosa (Lott & Turner, 1975). En el estudio “Evaluation

and Comparison of 10 Glucose Method and the Reference Method Recommended in the

Proposed Product Class Standard”, se evaluaron diez métodos de cuantificación de glucosa

32


incluyendo el método de Trinder y se concluye que este método muestra un error

sistemático inaceptable (Passey, Gillum, Fuller, Urry, & Giles, 1977). Gracias a lo anterior

es posible concluir que se requieren técnicas más precisas si lo que se desea hacer es una

cuantificación enzimática a partir de un extracto enzimático.

Las discrepancias entre los resultados de HPLC y el método del DNS

En la Figura 9.c, se observa que a pesar de que ambos muestran la misma tendencia, la

curva obtenida con DNS muestra una concentración mucho más grande de azúcares, la

discrepancia entre los resultados obtenidos por los métodos HPLC y DNS se encuentran

en un rango que va desde 21% hasta 58% en el día 15 . Generalmente, cuando se

cuantifican hidrolizados por acción enzimática, la suma de las concentraciones de los

azúcares analizados con HPLC es menor a la cantidad de azúcares resultantes de los

ensayos con DNS. Este fenómeno ha sido altamente reportado y se ha demostrado que

depende mucho del sustrato empleado, ya que cuando el sustrato es una fuente purificada

como Sigmacell® la diferencia es poco significativa, pero cuando se emplean sustratos

impuros como bagazo o en este caso, cascarilla de arroz, la diferencia entre ambos métodos

puede superar el 20%. Debido a lo anterior, David Fox, Peter Gray, Noel Dunn y Warwick

Marsden, realizaron un estudio para conocer si la diferencia entre los resultados obtenidos

con HPLC y DNS se debía a la presencia de oligómeros o a efectos del reactivo DNS, como

reacciones secundarias. Realizaron pruebas en sustratos puros y naturales y la diferencia

fue importante ya que en los sustratos naturales se encontraban las diferencias más

marcadas. Posteriormente, realizaron una hidrólisis ácida para volver a cuantificar los

azúcares con HPLC y encontraron que después de la hidrólisis ácida los azúcares

cuantificados con HPLC y con DNS eran practicamente iguales lo cual les llevó a concluir

33


que la diferencia entre ambos métodos se debe a la presencia de oligosacáridos que no son

cuantificables en HPLC (Fox, Gray, Dunn, & Marsden, 1984). Por lo tanto, se podrían

atribuir las diferencias encontradas en la Figura 9.c a la presencia de azúcares de cadena

mediana que no son cuantificables por HPLC pero si con el método de Miller. Gracias a

esto, el método de DNS se considera una buena opción para cuantificar azúcares

provenientes de la hidrolización enzimática y el HPLC también puede ser empleado para

este fin pero es necesario una hidrólisis química previa a la cuantificación final.

Análisis estadístico

En general, es posible observar que las curvas de la Figura 9 comienzan en una baja

concentración de azúcares y con el tiempo esta concentración tiende a aumentar hasta

alcanzar un pico y posteriormente vuelve a disminuir hacia los últimos días de cultivo. En

la Figura 11.a, se observa la curva de DNS obtenida en Minitab; tras realizar un ANOVA

y una prueba de Tukey con una confianza del 95%, fue posible concluir que la

concentración de azúcares en los puntos señalados en amarillo es significativamente

diferente a la concentración del día 15 y a las demás concentraciones de los primeros y

últimos días de cultivo. Igualmente, se aplicaron las mismas pruebas estadísticas a los

resultados reportados por HPLC y se obtuvo la Figura 11.b, en la cual se resaltan en rojo

los puntos significativamente diferentes. Gracias a lo anterior, se puede observar que

inicialmente el hongo está liberando glucosa en grandes cantidades hasta el día 15

aproximadamente. La Figura 11.c, es la curva obtenida en Minitab para el método de

Trinder; debido a la alta desviación estandar agrupada que se tiene en este método se

concluye que ningún día es significativamente diferente de otro durante todo el tiempo de

cultivo.

34


Figura 11. Gráficas de intervalos obtenidas en Minitab, se resaltan los datos

significativamente diferentes tras pruebas de Tukey. a. DNS. b. HPLC. c. Kit de glucosa

(método de Trinder).

3.2 Medición de actividad enzimática

3.2.1 Lignina Peroxidasa

35


Figura 12. Absorbancia obtenida en el ensayo para cuantificación enzimática de la

lignina peroxidasa

Se cuantificó la actividad de la enzima LiP en el extracto enzimático proveniente del cultivo

semisólido siguiendo la oxidación de alcohol veratrílico que se observa mediante un

incremento en la absorbancia en el tiempo. En la Figura 12 se presenta el resultado obtenido

para la absorbancia en el tiempo durante los ensayos realizados en ocho muestras de

extracto enzimático diferentes. Debido a que no se encontró cambios en la absorbancia, se

concluye que no hay actividad.

Existen estudios como los realizados por (Fernández & Henao, 2007) y (Moreno & Ospina,

2008) en los cuales se encontró una pequeña actividad de LiP. Sin embargo, también hay

estudios en donde intentaron cuantificar la actividad de la LiP de Pleurotus ostreatus sin

éxito, concluyendo que Pleurotus ostreatus no es un hongo productor de esta enzima. En

el estudio titulado “Evaluación de actividades endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y

lignina peroxidasa en diez hongos de pudrición blanca” (Montoya, Sanchez, & Levin,

Evaluacion de actividades endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 1 2 3 4 5

Abs

orba

ncia

Tiempo (min)

1,1

1,2

1,3

5,1

5,2

5,3

8,1

8,2

36


diez hongos de pudrición blanca, 2012), Pleurotus ostreatus no decoloró el sustrato Azure

B comprobando cualitativamente la ausencia de actividad de LiP. También en el estudio

titulado “Estudio comparativo de la lacasa, LiP y MnP de Pleurotus ostreatus” (Córdoba

& Cultid, 2015), se realizó la prueba del alcohol veratrílico para LiP sin encontrar cambios

en la absorbancia del volumen de reacción. Los resultados obtenidos comprueban los

trabajos mencionados anteriormente, además del estudio realizado por (Fernandez-Fueyo,

y otros, 2016), en el cual se analizó el secretoma de Pleurotus ostreatus identificando

lacasas, MnP y Versatil peroxidasa pero no lignina peroxidasa.

3.2.2 Lacasa

En la Figura 13, se observa la curva de actividad de la lacasa, en la cual se evidencia un

periodo inicial de baja actividad enzimática que llega hasta el día 12, seguido de un rápido

incremento de la actividad a partir del día 15 que parece estabilizarse hasta el último día de

cultivo. El día de actividad máxima se encontró el día 23 con una actividad de 14170,65

U/L.

Se realizó un ANOVA y una prueba de Tukey con la cual se concluye con una confianza

del 95% que la actividad enzimática registrada a partir del día 15 es significativamente

diferente de la actividad registrada en los primeros días de cultivo. Sin embargo, en otros

trabajos, como el realizado por Cordoba y Cultid, se ha encontrado que la actividad de la

lacasa va en aumento hasta encontrar un pico en el día 14 y posteriormente disminuye

significativamente (Córdoba & Cultid, 2015).

37


Figura 13. Actividad enzimática de la lacasa

3.2.3 Manganeso Peroxidasa

La actividad de la manganeso peroxidasa solo pudo ser cuantificada en cinco días

diferentes. En la Figura 14 se tiene la curva de actividad enzimática encontrada para esta

enzima. El máximo valor encontrado fue de 868,11 U/L en el día 15 de cultivo. Debido a

que se tienen muy pocos puntos analizados, es difícil concluir sobre el comportamiento de

esta enzima. En la medición de actividad enzimática realizada por Córdoba y Cultid usando

como sustrato dimetoxifenol (DMP), tampoco se logró establecer un patrón para la

actividad de esta enzima, sin embargo, la mayor actividad encontrada fue de 80 U/L

(Córdoba & Cultid, 2015), lo cual representa una actividad 10 veces menor a la encontrada

en el presente estudio. Estadísticamente, la actividad enzimática obtenida entre los días 12

y 15 es significativamente diferente del resto de días, con una confianza del 95%.

363,14 440,961391,35

2705,35

13351,54

12443,69

14170,65

12843,00

02000400060008000

100001200014000160001800020000

2 5 8 12 15 19 23 27

Act

ivid

ad U

/L

Días

38


Figura 14. Actividad enzimática de la manganeso peroxidasa.

Es evidente que la mayor actividad ligninolítica se debe a las lacasas. Esto puede deberse

a que los iones de Mn y Cu inducen la actividad de MnP y lacasa (Janusz, Kucharzyk,

Pawlik, Staszczak, & Paszczynski, 2012) y en el medio basal se agrega cobre para

incentivar la actividad de la lacasa, pero no se agregan iones Mn para incentivar la MnP.

La adición de Mn2+ es estrictamente requerida para la estimulación de la producción de

MnP en Pleurotus ostreatus. Además, el ion Mn2+ juega un papel importante como un

factor post-transcripcional esencial para la producción y secreción de MnP activa en el

líquido extracelular (Janusz, Kucharzyk, Pawlik, Staszczak, & Paszczynski, 2012).

Adicionalmente, es necesario controlar la cantidad de peróxido de hidrógeno en el medio,

ya que todas las hemoproteínas incluyendo MnP pueden inactivarse en presencia de una

concentración catalítica de peróxido de hidrógeno, este fenómeno se conoce como

inactivación suicida (Valderrama, Ayala, & Vazquez-Duhalt, 2002).

Factores ambientales y pH son piezas clave para la actividad enzimática

430,27

841,62868,11

407,03

102,70

0

200

400

600

800

1000

1200

2 12 15 23 27

Act

ivid

ad (U

/L)

Días

39


La regulación de los genes que codifican para la producción de lacasas y peroxidasas

involucra factores ambientales, tales como la concentración de carbono y nitrógeno,

presencia de iones metálicos, temperatura y pH. Se ha determinado que la composición del

medio y las condiciones de cultivo afectan fuertemente los patrones de expresión de

isoenzimas en hongos de podredumbre blanca (Janusz, Kucharzyk, Pawlik, Staszczak, &

Paszczynski, 2012). El pH es un factor sumamente importante para una enzima por dos

factores principalmente: i) El estado de protonación de los grupos funcionales de los

aminoácidos y cofactores envueltos en la reacción catalítica y ii) La estructura

tridimensional nativa de las enzimas (Bisswanger, 2014). En el artículo llamado

“Ligninolytic peroxidase gene expression by Pleurotus ostreatus: Differential regulation

in lignocellulose medium and effect of temperatura and pH” (Fernandez-Fueyo, y otros,

2014) se estudia el efecto del pH y la temperatura en la expresión de genes en Pleurotus

ostreatus, encontrando que los cambios de pH generan modificaciones más extremas que

los cambios de temperatura. Además, se encuentra que la expresión de las diferentes

isoenzimas de MnP y VP fue afectada por diferentes temperaturas y pH en los cultivos,

siendo VP la enzima más afectada. En la tesis titulada “Evaluación de enzimas

degradadoras de lignina producidas por aislamientos fúngicos de cultivos de arroz”

(Muñoz, 2012), se evaluó la estabilidad de las enzimas ligninolíticas de Pleurotus ostreatus

lacasa y MnP en diferentes pH. La lacasa resulta estable en un pH de 5 y se mantiene estable

en pH alcalino, pero cuando es sometida a pH ácido su actividad se ve reducida

drásticamente. Por otro lado, la MnP es estable a una temperatura de 30ºC y un pH de 6

pero cuando se tiene un pH menor a 5 la actividad enzimática decrece rápidamente.

40


En la Figura 15 se presenta la curva de pH del extracto enzimático en el tiempo de cultivo.

Inicialmente el pH es de 4,5 y rápidamente va aumentando con el paso de los días hasta

llegar a 6,14 en el último día de cultivo. Es importante notar el gran salto en el pH entre el

día 0 y el día 2, es probable que el mismo hongo esté ajustando el pH del medio ya que el

rango de pH adecuado para el crecimiento micelial de Pleurotus ostreatus está entre 6,0 y

7,0 (Córdoba & Cultid, 2015) y como se mencionó anteriormente, los cambios en el pH

son factores sumamente importantes en la actividad enzimática y podría explicar el

comportamiento reportado en el presente estudio.

Figura 15. Curva de pH del extracto enzimático.

3.2.4. Exo-1,4-b-D-glucanasa

En la Figura 16, se muestra la curva de actividad enzimática de la exoglucanasa. Se puede

observar que desde el segundo día de cultivo se presenta una gran actividad de

exoglucanasa de 1251,20 U/L, la cual baja y sube sin un patrón definido, siendo la mínima

4,5

5,15

5,675,78

5,97 5,946,07 6,02

6,14

4,50

4,70

4,90

5,10

5,30

5,50

5,70

5,90

6,10

6,30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

pH

Días

41


actividad reportada la encontrada en el día 19 con 767,15 U/L y la máxima reportada la

encontrada en el día 23 con 1305,47 U/L. El día 23 también resultó ser el día de mayor

actividad de la lacasa.

No hay diferencias significativas entre los días de cultivo

Se realizó un ANOVA con significancia del 5%, con el fin de conocer si existen diferencias

entre las mediciones realizadas para la actividad enzimática en los diferentes días de cultivo

y se encontró que para esta prueba no hay diferencias.

Los resultados obtenidos en este ensayo fueron diferentes a los obtenidos en otros estudios

realizados, en los cuales la actividad enzimática va aumentando progresivamente hasta

alcanzar un máximo en la segunda semana de cultivo y finalmente decrece dramáticamente.

En el estudio titulado “Production of cellulase by Pleurotus ostreatus and Pleurotus sajor-

caju in solid state fermentation of lignocellulosic biomass” (Khalil, Hoque, Basunia, Alam,

& Khan, 2010) se cuantificó la actividad enzimática de enzimas celulolíticas producidas

sobre diferentes sustratos lignocelulósicos en un periodo de 14 días y el comportamiento

encontrado para todas las pruebas fue el mismo: crecimiento progresivo hasta el día 10,

seguido de un rápido decrecimiento en la actividad enzimática que alcanza valores cercanos

a 0 en el día 14. Sin embargo, es importante mencionar que el cultivo realizado es diferente.

Por otro lado, en la cuantificación de exoglucanasa realizada por Montoya, en el trabajo

llamado “ Selección de la mejor combinación hongo-formulación para la degradación de

sustratos lignocelulósicos mediante fermentación en estado sólido con Pleurotus ostreatus,

Coriolus versicolor y Lentinus edodes” (Montoya, Sanchez, & Levin, 2012) se encuentra

42


que, al igual que en el presente trabajo, la actividad se mantiene constante durante los días

de cultivo.

Figura 16. Actividad enzimática de la exoglucanasa.

3.2.5 Endo-1,4-b-D-glucanasa

No se encontró actividad en la prueba cuantitativa realizada sobre el extracto enzimático.

Por lo tanto, se rastreo actividad cuantitavamente con el método del rojo congo y

unicamente se encontró actividad (decoloración) en una de las diez muestras analizadas, la

cual pertenece al día 27. Este resultado se muestra en la Figura 17. Debido a lo anterior, se

puede concluir que probablemente la actividad de endoglucanasa en el cultivo es muy baja

y por lo tanto no pudo ser cuantificada ni rastreada en todos los días de cultivo.

1251,201138,25

857,36

1185,92

1054,64

767,15

1305,47

1194,73

0200400600800

10001200140016001800

2 5 8 12 15 19 23 27

Act

ivid

ad e

nzim

átic

a (U

/L)

Días

43


Figura 17. Resultado de la decoloración del rojo congo por el extracto enzimático del día

27.

Finalmente, se realizó un rastreo cualitativo de endoglucanasa en un cultivo diferente; esta

prueba de rojo congo se realizó al quinto día de cultivo y sus resultados se encuentran en

la Figura 18. La Figura 18.a muestra el resultado obtenido para Pleurotus ostreatus, se

observa un halo de decoloración que indica la presencia de carboximetilcelulosa degradada

por la presencia de endoglucanasa. En la Figura 18.c, se observa el control positivo

realizado con Ganoderma lucidum, en la cual también se observa un halo amarillo intenso

aunque cubre una menor área que el halo de la Figura 18.a. Finalmente en las Figuras 18.b

y 18.d se observa que no hubo ningún tipo de decoloración en los controles, lo cual

confirma la veracidad del método empleado. En el estudio “Evaluación de Actividades

Endoglucanasa, Exoglucanasa, Lacasa y Lignina Peroxidasa en Diez Hongos de Pudrición

Blanca” (Montoya, Sanchez, & Levin, 2012), se realizó esta misma prueba en Pleurotus

ostreatus en donde también se observó la decoloración del rojo congo con un diámetro de

31mm.

44


Prueba Control negativo Pl

euro

tus o

stre

atus

a.

b.

Gan

oder

ma

luci

dum

(con

trol

pos

itivo

)

c.

d.

Figura 18. Resultados de la prueba de decoloración del rojo congo. a. Prueba con P.

ostreatus. b. Control negativo con P. ostreatus. c. Prueba con Ganoderma lucidum d.

Control negativo con Ganoderma lucidum.

45


3.3 Medición de lignina y carbohidratos

En la Tabla 1 se encuentran los resultados para la deslignificación, la pérdida de

carbohidratos y la pérdida de masa de cascarilla de arroz, debido al pretratamiento

realizado. La deslignificación obtenida se encuentra dentro del rango esperado según

trabajos anteriores como el de (Becerra, 2017) en el cual se obtuvo una deslignificación de

14,89%. Además, en el estudio titulado “Delignification of wheat straw by Pleurotus spp.

under mushroom-growing conditions” se evaluó la deslignificación de paja de trigo usando

Pleurotus sajor-caju, Pleurotus sapidus, Pleurotus cornucopiae y Pleurotus ostreatus,

obteniendo una pérdida de peso seco total de 18% y una deslignificación promedio de 11%,

siendo P. ostreatus el hongo con mayor tasa de deslignificación con 13% y una pérdida de

celulosa y hemicelulosa promedio de 20% y 50% respectivamente (Tsang, Reid, &

Coxworth, 1987). Gracias a lo anterior se concluye que el pretratamiento realizado se

encuentra dentro del rango normal reportado en la bibliografía y por lo tanto fue un

pretratamiento exitoso ya que, como lo reportan (Sanchez, Sierra, & Alméciga, 2011), una

reducción de 8% en la lignina puede liberar hasta el 20% de los azúcares.

Tabla 1. Porcentajes perdidos después del pretratamiento

Porcentaje

perdido

Lignina 11,18%

Celulosa 28,35%

Hemicelulosa 32,78%

Masa total 16,65%

46


La deslignificación obtenida se atribuye principalmente a la lacasa que presentó una gran

actividad y oxidó compuestos fenólicos de la lignina, asimismo, la pérdida de celulosa se

atribuye a la acción de celulasas como la exoglucanasa que se mantuvo constante durante

todo el tiempo de cultivo y además se ve reflejada en el perfíl de azúcares reductores

previamente mostrado en la Figura 9.

Por otro lado, es importante analizar la selectividad de P. ostreatus en la degradación de

lignina y carbohidratos. Estas relaciones se encuentran en la Tabla 2, y muestran que la

cantidad de lignina degradada representa solo un 39% de la cantidad de celulosa degradada

y un 34% de la hemicelulosa degradada. Además, Pleurotus ostreatus degrada la

hemicelulosa 1,16 veces más que la celulosa, por lo cual se concluye este hongo presenta

una selectividad que prioriza la hemicelulosa como fuente de energía sobre la celulosa.

Estos resultados son importantes ya que cuando se realiza un pretratamiento de

deslignificación con el objetivo de utilizar los azúcares para la producción de etanol, perder

azúcares se considera una reacción secundaria que afecta directamente el rendmiento del

proceso de producción de etanol.

Tabla 2. Relaciones de selectividad

Relación

Lignina/celulosa 0,39

Lignina/hemicelulosa 0,34

Hemicelulosa/celulosa 1,16

47


CAPÍTULO IV

CONCLUSIONES

En primer lugar, se concluye que se puede observar un perfil adecuado de azúcares

provenientes de hidrólisis enzimática por medio del uso de HPLC y de la técnica de DNS.

Además, el método de Trinder es útil para comprobar cualitativamente la presencia de

glucosa y se tiene amplio conocimiento de su desempeño para la cuantificación de glucosa

en sangre, sin embargo, no se recomienda el uso en la cuantificación de azúcares en extracto

enzimático porque se desconocen las posibles interacciones con los metabolitos presentes

además de arrojar una desviación estándar muy alta que hace poco viable el análisis del

perfil obtenido por este método.

La discrepancia de los resultados obtenidos por HPLC y DNS fue de más de 20% y según

la bibliografía encontrada puede ser explicada por la cantidad de oligosacáridos presentes

en el extracto enzimático que no son cuantificables por HPLC. Adicionalmente, se

concluye que el método del DNS es útil para la cuantificación de azúcares provenientes de

hidrólisis y se recomienda por su rapidez y su precisión aceptable, además de no requerir

equipos muy avanzados para ejecutarlo.

Se obtuvo el perfil de actividad enzimática de la lacasa con una actividad máxima de

14170,65 U/L, la cual es más de 15 veces la actividad máxima de MnP encontrada, que fue

de 868.11 U/L. Por lo tanto, la deslignificación encontrada puede ser atribuida

principalmente a la acción de lacasas. Asimismo, se comprobó la ausencia de actividad de

LiP en Pleurotus ostreatus, lo cual tiene explicación en la ausencia de genes que codifican

para su producción.

48


La actividad enzimática de la exoglucanasa se encontró casi constante en el tiempo, con

una actividad máxima registrada de 1305,47 U/L y una actividad mínima de 767,15 U/L.

No fue posible cuantificar la endoglucansa en el cultivo lo cual indica que la cantidad de

enzima producida podría ser muy pequeña, sin embargo se logró hacer el rastreo cualitativo

de esta enzima usando Pleurotus ostreatus en un medio con CMC como fuente de carbono.

Para terminar, el pretratamiento biológico realizado alcanzó una deslignificación de

11,18% y una pérdida de celulosa y hemicelulosa de 28,35% y 32,78%. El pretratamiento

fue exitoso, ya que alcanzó niveles esperados de deslignificación.

49


CAPÍTULO V

TRABAJO FUTURO

En primer lugar, se recomienda cambiar el pH del cultivo ya que el pH adecuado para el

óptimo crecimiento micelial de P. ostreatus se encuentra en el rango entre 6 y 7 y como se

observó en la Figura 15, el medio sufre un reajuste de pH drástico durante los días de

cultivo lo que puede deberse a una acción de defensa del hongo y podría provocar un

consumo de energía innecesario del mismo. Además, un cambio del pH del cultivo podría

mejorar los niveles de actividad enzimática registrados ya que cuidaría a las enzimas

ligninolíticas de su inactivación. Por otro lado, es recomendable adicionar iones Mn+2 al

cultivo así como se adicionan iones de cobre, ya que esto estimularía la producción de MnP

lo cual podría conllevar un mayor grado de deslignificación. Adicionalmente se

recomienda incentivar y cuantificar la versátil peroxidasa, ya que se ha comprobado que

Pleurotus ostreatus tiene los genes que codifican para tres isoenzimas de versátil

peroxidasa (Fernandez-Fueyo, y otros, 2014), la cual es un tipo de enzima importante ya

que es un híbrido entre la MnP y la LiP (ausente en P. ostreatus) y por lo tanto puede oxidar

compuestos fenólicos y no fenólicos de la lignina sin la necesidad de un mediador (Wong,

2009), convirtiéndola en un factor clave para la deslignificación. Asimismo, se recomienda

realizar la cuantificación de la enzima celulolítica b-glucosidasa, ya que esta enzima es la

encargada de hidrolizar la celobiosa para obtener glucosa, por lo tanto, es esencial tener en

cuenta su actividad enzimática como parte fundamental de la hidrólisis enzimática de la

celulosa.

50


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54


ANEXOS

Anexo 1: Preparación de medios de cultivo

Tabla A.1.1. Preparación de medio SDY

Reactivo Cantidad Glucosa 20g Peptona 5g Levadura 5g Agua destilada 500 mL

Tabla A.1.2. Preparación de medio basal

Reactivo Cantidad Glucosa 0.5g KH2PO4 2g MgSO4 0.25g (NH4)SO4 0.9g CaCl2 0.1g Kcl 0.5g Agua destilada 1000mL Tiamina 0.5g Ácido cítrico 2.1g Citrato de sodio dihidratado 2.94g Hcl 100mL NaOH 0.08g

55


Anexo 2: Curva de calibración de DNS

Figura A.2 Curva de calibración usando glucosa.

y = 0,6307x - 0,0169R² = 0,99541

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Abs

orba

ncia

Concentración (g/L)

Curva calibración reactivo DNS

56


Anexo 3: Preparación de reactivo DNS

Tabla A.3. Insumos para la preparación del reactivo DNS

Reactivo Cantidad NaOH 6.6g DNS 3.5g Tartrato de sodio y potasio 100g Agua destilada 500 mL

Se deben disolver los reactivos en agua destilada en caliente y con agitación magnética. Se debe guardar en oscuridad en un frasco ambar y en frío.

57


Anexo 4: Instrucciones del kit de glucosa

Figura A.4 Reactivos, preparación y procedimiento del kit de glucosa.

58


Anexo 5: Preparación de soluciones para el método del rojo congo

Preparación del agar

Tabla A.5. Insumos para la preparación del agar

Reactivo Cantidad Agar bacteriológico 3.2g Peptona 1g Extracto de levadura 1g Carboximetilcelulosa 0.2g

Para el control se realiza la misma solución omitiendo la carboximetilcelulosa.

Preparación de la solución de rojo congo

Se pesan 0.45g de rojo congo en polvo y se adicionan a 300 mL de agua destilada. Se agita para diluir bien.

Preparación de la solución desmanchante

Se pesan 17.52g de NaCl y se adicionan a 300 mL de agua destilada. Se agita para diluir bien.

59


Anexo 6: Preparación de soluciones buffer para ensayos de cuantificación enzimática

Buffer citrato de sodio 50mM pH=5

En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido cítrico 0.1M y citrato de sodio 0.1M.

1. Se pesan 9.6g de ácido cítrico y se adiciona a 500mL de agua destilada.

2. Se pesan 12.9g de citrato de sodio y se adiciona a otros 500mL de agua destilada.

3. Se toman 115mL de solución de ácido cítrico y 135mL de solución de citrato de sodio y se mezclan.

4. A la mezcla obtenida en el paso anterior se adicionan 250mL de agua destilada.

5. En este punto se tienen 500mL de buffer citrato de sodio 100mM pH=5, para disminuir la concentración se agregan 500mL de agua destilada para obtener 1L de buffer citrato de sodio 50mM pH=5.

Buffer acetato de sodio 100mM pH=4.5

En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido acético 0.2M y acetato de sodio 0.2M.

1. Se disuelven 11.55mL de ácido acético en agua destilada completando 1L

2. Se disuelven 27.2g de acetato de sodio en agua destilada completando 1L

3. Se toman 305mL de la solución de ácido acético y se mezclan con 195mL de la solución de acetato de sodio.

4. A la solución obtenida en el anterior paso se le agrega 500mL de agua destilada

Buffer succinato de sodio 0.2M pH=4.5

En primer lugar se deben preparar dos soluciones: ácido succínico 0.2M y NaOH 0.2M.

1. Se disuelven 2.3g de ácido succínico en 100mL de agua destilada.

2. Se disuelven 0.8g de NaOH en 100mL de agua destilada

3. Se adiciona la solución de NaOH a la solución de ácido succínico lentamente hasta alcanzar un pH de 4.5.

Buffer tartrato de sodio 0.25M pH=3

1. Se disuelven 5.75g de tartrato de sodio en 100mL de agua destilada

2. Se disuelven 3.75g de ácido tartárico en 100mL de agua

3. Se mezclan las soluciones obtenidas en los pasos 1 y 2

60


4. En caso de ser necesario, se ajusta el pH en 3.

61


Anexo 6: Pruebas estadísticas

A.6.1 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de glucosa libre con HPLC

Resultadospara:HPLCgl.MTW

ANOVAunidireccional:Respvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 43,099 6,1570 20,98 0,000 Error 13 3,816 0,2935 Total 20 46,915 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 0,541792 91,87% 87,49% 80,81% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 1,857 0,551 ( 1,181; 2,533) 2 3 3,375 0,481 ( 2,699; 4,051) 3 3 3,910 0,411 ( 3,234; 4,586) 4 2 5,696 0,376 ( 4,868; 6,523) 5 2 6,293 0,307 ( 5,465; 7,120) 6 3 4,829 0,880 ( 4,153; 5,505) 7 3 2,687 0,556 ( 2,011; 3,362) 8 2 2,2550 0,0636 (1,4274; 3,0826) Desv.Est. agrupada = 0,541792

ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación

62


5 2 6,293 A 4 2 5,696 A 6 3 4,829 A B 3 3 3,910 B C 2 3 3,375 B C D 7 3 2,687 C D 8 2 2,2550 C D 1 3 1,857 D Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Figura A.6.1.1. Gráfica de residuos de la prueba

Figura A.6.1.2. Gráfica de intervalos de la prueba

A.6.2 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de glucosa libre con kit de glucosa

87654321

7

6

5

4

3

2

1

Muestra

Resp

Gráfica de intervalos de Resp vs. Muestra95% IC para la media

Ladesviaciónestándaragrupadaseutilizóparacalcularlosintervalos.

63


ANOVAunidireccional:kitvs.Muestra

1. Método 2. 3. Hipótesis nula Todas las medias son iguales 4. Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente 5. Nivel de significancia α = 0,05 6. 7. Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. 8. 9. 10. Información del factor 11. 12. Factor Niveles Valores 13. Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 14. 15. 16. Análisis de Varianza 17. 18. Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p 19. Muestra 7 21,86 3,123 1,26 0,328 20. Error 16 39,58 2,474 21. Total 23 61,45 22. 23. 24. Resumen del modelo 25. 26. R-cuad. R-cuad. 27. S R-cuad. (ajustado) (pred) 28. 1,57290 35,58% 7,40% 0,00% 29. 30. 31. Medias 32. 33. Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 34. 1 3 2,261 1,019 ( 0,336; 4,187) 35. 2 3 3,43 2,11 ( 1,51; 5,36) 36. 3 3 4,20 2,33 ( 2,28; 6,13) 37. 4 3 3,588 1,346 ( 1,662; 5,513) 38. 5 3 3,318 1,716 ( 1,392; 5,243) 39. 6 3 2,627 1,654 ( 0,702; 4,552) 40. 7 3 2,284 0,998 ( 0,359; 4,209) 41. 8 3 0,940 0,634 (-0,985; 2,866) 42. 43. Desv.Est. agrupada = 1,57290

64




A.6.3 Modelo lineal general para comparar las respuestas de HPLC y kit de glucosa

Modelolinealgeneral:Respuestavs.Muestra;Metodo

87654321

7

6

5

4

3

2

1

0

-1

Muestra

kit

Gráfica de intervalos de kit vs. Muestra95% IC para la media


65


Método Codificación de factores (-1; 0; +1) Información del factor Factor Tipo Niveles Valores Muestra Fijo 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Metodo Fijo 2 hplc; kit Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 48,889 6,984 4,23 0,002 Metodo 1 9,850 9,850 5,96 0,020 Error 36 59,474 1,652 Falta de ajuste 7 16,074 2,296 1,53 0,195 Error puro 29 43,400 1,497 Total 44 117,532 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 1,28532 49,40% 38,15% 21,29% Coeficientes EE del Término Coef coef. Valor T Valor p VIF Constante 3,302 0,193 17,12 0,000 Muestra 1 -1,243 0,494 -2,52 0,016 1,62 2 0,101 0,494 0,20 0,839 1,62 3 0,753 0,494 1,53 0,136 1,62 4 1,223 0,534 2,29 0,028 1,73 5 1,299 0,534 2,43 0,020 1,73 6 0,425 0,494 0,86 0,394 1,62 7 -0,817 0,494 -1,65 0,107 1,62 Metodo hplc 0,471 0,193 2,44 0,020 1,01 Ecuación de regresión Respuesta = 3,302 - 1,243 Muestra_1 + 0,101 Muestra_2 + 0,753 Muestra_3 + 1,223 Muestra_4 + 1,299 Muestra_5 + 0,425 Muestra_6 - 0,817 Muestra_7 - 1,742 Muestra_8 + 0,471 Metodo_hplc - 0,471 Metodo_kit Ajustes y diagnósticos para observaciones poco comunes Resid Obs Respuesta Ajuste Resid est. 6 5,813 2,932 2,881 2,49 R 9 6,871 3,585 3,286 2,84 R

66


15 1,416 4,131 -2,715 -2,38 R Residuo grande R

A.6.4 Modelo lineal general para comparar las desviaciones estandar de HPLC y kit de glucosa

Modelolinealgeneral:DESV.EST.1vs.MUES;m2Método Codificación de factores (-1; 0; +1) Información del factor Factor Tipo Niveles Valores MUES Fijo 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 m2 Fijo 2 hplc; kit Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p MUES 7 1,648 0,2354 1,48 0,309 m2 1 4,179 4,1793 26,25 0,001 Error 7 1,114 0,1592 Total 15 6,941


67


Figura A.6.4.2. Gráfica de efectos principales

A.6.5 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de azúcares reductores con DNS

ANOVAunidireccional:Concentracionvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 212,70 30,386 29,79 0,000 Error 10 10,20 1,020 Total 17 222,90 Resumen del modelo

68


R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 1,00998 95,42% 92,22% 84,87% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 2,350 1,024 ( 1,051; 3,650) 2 2 6,459 1,357 ( 4,868; 8,051) 3 2 8,449 0,359 ( 6,858; 10,041) 4 2 8,5210 0,1004 (6,9298; 10,1123) 5 2 13,44 1,73 ( 11,85; 15,04) 6 2 8,679 1,088 ( 7,088; 10,270) 7 2 4,4696 0,1121 (2,8784; 6,0609) 8 3 3,280 0,986 ( 1,981; 4,580) Desv.Est. agrupada = 1,00998

ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 5 2 13,44 A 6 2 8,679 B 4 2 8,5210 B 3 2 8,449 B 2 2 6,459 B C 7 2 4,4696 C D 8 3 3,280 C D 1 3 2,350 D Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.


69



A.6.6 ANOVA y prueba de Tukey en resultados de la prueba para lacasa

ANOVAunidireccional:Lacasavs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 843350779 120478683 18,25 0,000 Error 15 99045384 6603026 Total 22 942396163 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad.

87654321

16

14

12

10

8

6

4

2

0

Muestra

Conc

entra

cion

Gráfica de intervalos de Concentracion vs. Muestra95% IC para la media


70


S R-cuad. (ajustado) (pred) 2569,64 89,49% 84,59% 75,84% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 3 363,1 87,1 (-2799,0; 3525,3) 2 3 441 261 ( -2721; 3603) 3 3 1391 337 ( -1771; 4554) 4 3 2705 1810 ( -457; 5868) 5 3 13352 4986 ( 10189; 16514) 6 3 12444 2245 ( 9282; 15606) 7 3 14171 3846 ( 11008; 17333) 8 2 12843 1656 ( 8970; 16716) Desv.Est. agrupada = 2569,64

ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 7 3 14171 A 5 3 13352 A 8 2 12843 A 6 3 12444 A 4 3 2705 B 3 3 1391 B 2 3 441 B 1 3 363,1 B Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.


71



A.6.7 ANOVA en resultados de la prueba para endoglucanasa

ANOVAunidireccional:ExoGvs.Muestra

Método Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 8 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 7 510547 72935 3,17 0,055 Error 9 206967 22996 Total 16 717513 Resumen del modelo

87654321

20000

15000

10000

5000

0

Muestra

Laca

sa

Gráfica de intervalos de Lacasa vs. Muestra95% IC para la media


72


R-cuad. R-cuad. S R-cuad. (ajustado) (pred) 151,645 71,16% 48,72% 3,70% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 2 1251 145 ( 1009; 1494) 2 3 1138 198 ( 940; 1336) 3 2 857,4 63,3 (614,8; 1099,9) 4 2 1185,9 111,0 (943,4; 1428,5) 5 2 1055 162 ( 812; 1297) 6 2 767,1 87,1 (524,6; 1009,7) 7 2 1305 239 ( 1063; 1548) 8 2 1194,7 25,9 (952,2; 1437,3) Desv.Est. agrupada = 151,645


73



A.6.8 ANOVA en resultados de la prueba para MnP

ANOVAunidireccional:Actividadvs.MuestraMétodo Hipótesis nula Todas las medias son iguales Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente Nivel de significancia α = 0,05 Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis. Información del factor Factor Niveles Valores Muestra 5 1; 4; 5; 7; 8 Análisis de Varianza Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p Muestra 4 838153 209538 13,24 0,007 Error 5 79108 15822 Total 9 917261 Resumen del modelo R-cuad. R-cuad.

87654321

1500

1250

1000

750

500

Muestra

ExoG

Gráfica de intervalos de ExoG vs. Muestra95% IC para la media


74


S R-cuad. (ajustado) (pred) 125,784 91,38% 84,48% 65,50% Medias Muestra N Media Desv.Est. IC de 95% 1 2 430,3 24,5 ( 201,6; 658,9) 4 2 841,6 138,4 ( 613,0; 1070,3) 5 2 868 232 ( 639; 1097) 7 2 407,0 55,8 ( 178,4; 635,7) 8 2 102,7 47,4 (-125,9; 331,3) Desv.Est. agrupada = 125,784

ComparacionesenparejasdeTukeyAgrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95% Muestra N Media Agrupación 5 2 868 A 4 2 841,6 A 1 2 430,3 A B 7 2 407,0 A B 8 2 102,7 B Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.


75



87541

1250

1000

750

500

250

0

Muestra

Activ

idad

Gráfica de intervalos de Actividad vs. Muestra95% IC para la media


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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE Pleurotus ostreatus