ENZIMAS: CONCEPTOS BSICOS

Y CINTICA

Medicina 2015

Enzimas: catalizadores de naturaleza proteica

Las enzimas pueden requerir de cofactores

Elementos Inorgnicos que actan como Cofactores enzimticos

Metal Enzima

Zn2+ Anhidrasa carbnica Zn2+ Carboxipeptidasa Mg2+ EcoRV Mg2+ Hexoquinasa Ni2+ Ureasa Mo Nitrato reductasa Se Glutatin peroxidasa Mn2+ Superoxido dismutasa K+ Propionil CoA carboxilasa

Coenzima Enzima Tiamina pirofosato Piruvato deshidrogenasa Flavina adenina nucletido Monoamino oxidasa Nicotinamida adenina dinucleotido Lactato dehydrogenasa Pyridoxal fosfato Glicogeno fosforilasa Coenzima A (CoA) Acetil CoA carboxilasa Biotina Pyruvato carboxilasa 5-Deoxyadenosil cobalamina Methylmalonil mutasa Tetrahidrofolate Timidilato sintetasa

Coenzimas: cofactores de naturaleza orgnica

CURVA DE PROGRESO

Cintica enzimtica: Formacin de un complejo entre la enzima y el sustrato (complejo ES).

Dos posibles mecanismos para la misma reaccin 1) reaccin no catalizada:

S D P 2) reaccin catalizada por una enzima:

S + E D ES D EP D E + P

En el mecanismo de reaccin enzimtica, la energa de activacin del estado de transicin es mucho menor que en la reaccin no catalizada.

Como resultado, las enzimas aceleran la velocidad de la reaccin en relacin a la reaccin no enzimtica.

Las enzimas no modifican la condicin del equilibrio de la reaccin qumica.

Gt

Mecanismo de reaccin no enzimtico

Modelo de la llave-cerradura

Modelo del encaje inducido

Modelo del encaje inducido

La enzima experimenta un cambio conformacional

Efectos de 1. Orientacin 2. Proximidad de los sustratos en el sitio activo

La fijacin de los sustratos al sitio activo se hace en la orientacin correcta para que estos reaccionen de manera productiva (efecto de orientacin) Las enzimas logran en su sitio activo que los sustratos se ubiquen a una distancia ideal para que reaccionen de manera productiva (efecto de proximidad)

Colisin productiva

Colisiones no productivas

En la superficie de la enzima, los reactivos se encuentran en la orientacin correcta y a la distancia apropiada

Algunos aminocidos del sitio activo participan en: -La unin de el o los sustratos. -La conversin del sustrato en producto o catlisis propiamente tal.

Fosfofructoquinasa 1

Fructosa 6-P + ATP Fructosa 1,6 bi-P + ADP

Fosfofructoquinasa 1

Fructosa 6-P + ATP Fructosa 1,6 bi-P + ADP

Fosfofructoquinasa 1

Fructosa 6-P + ATP Fructosa 1,6 bi-P + ADP

Sitio activo

Cintica enzimtica

CURVA DE PROGRESO

[P]

tiempo

V equilibrio = 0

1 V

2 V

Vo = Vinicial

CURVA DE PROGRESO

S + E D ES D E + P

V = P t

[P]

tiempo

[P]

tiempo

Vo

Curva de Progreso

S + E D ES D E + P

equilibrio

[P]

tiempo

[Et] = cte

Curva de progreso a diferentes concentraciones de sustrato

S3

Vo3

Vo4

S4

S2

Vo2

S5

Vo5

S1

Vo1

Curva de velocidad inicial (Vo) versus concentracin de sustrato (S)

concentracin de sustrato, [S]

Velo

cida

d in

icia

l, V

o

S1

S2

S3

S4

Vo1

Vo2

Vo3

Vo4

S5

Vo5

Pregunta:

Cmo derivar una ecuacin de velocidad en funcin de la concentracin de sustrato para una reaccin catalizada por una enzima?

Respuesta:

Debemos proponer un modelo o mecanismo:

-Mecanismo Michaeliano (Derivado por Michaelis y Menten: 1913) -Existencia de un complejo ES

E + S ES E + P

k1

k2

k3

k4

2. [P] 0, k4 no se considera para el anlisis

Consideraciones del Mecanismo Michaeliano:

1. El mecanismo cintico:

k3 k1

k2 E + S ES E + P

Por tanto, el mecanismo se reduce a:

3. la etapa limitante o lenta de la reaccin es la transformacin de ES en E + P (k3)

Si k3 es la constante de velocidad de la etapa limitante, entonces: la velocidad de la reaccin se puede escribir como: Vo = k3[ES]

4. Estado estacionario para ES Si [ES] es constante, entonces: Podemos derivar una ecuacin de velocidad en funcin de la [S]

Derivacin de la ecuacin de Michaelis-Menten Anexo 2: pgina 104 de la gua de seminarios y Trabajos prcticos

Ecuacin de Michaelis y Menten

Vo = Vmax [S] Km + [S]

Km = (k2 + k3 )/k1 Si k3 es constante de velocidad de la etapa lenta, entonces: k2 + k3 k2, de donde Km = k2/k1 (equivalente a la constante de disociacin ES)

E + S ES E + P k3 k1

k2

SIGNIFICADO DE LA Km

En estas condiciones Km es una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato.

Km para algunas enzimas y sustratos Enzima Sustrato Km (mM) Catalasa H2O2 25 Hexoquinasa (cerebro) ATP 0,4

D-glucosa 0,05 D-fructosa 0,9 D-manosa 0,06

Glucoquinasa (heptica) D-glucosa 10 Anhidrasa carbnica HCO3- 26 Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108

N-Benzoiltirosinamida 2,5 -galactosidada D-lactosa 4,0 Treonina deshidratasa L-treonina 5.0 Fosfofructoquinasa ATP 0,12

D-Fructosa-6P 0,023

Hexoquinasa Glucoquinasa

Km glucosa 0,05mM 10 mM

variacin de glucosa

sangunea

Operacionalmente, Km = [S] con la que se obtiene Vmax/2

E + S ES E + P k3 k1

k2

En el mecanismo Michaeliano:

-k3 representa la constante de velocidad de la etapa limitante o lenta, -representa el nmero de recambio o constante cataltica de la reaccin (kcat).

SIGNIFICADO DEL NMERO DE RECAMBIO, k3 kcat : nmero de molculas de sustrato convertidas a producto por unidad de tiempo y por molcula de enzima

Operacionalmente k3 kcat tiene unidades de tiempo-1

y se puede calcular como:

Vmax = k3[Et], de donde

kcat = k3 = Vmax [Et]

Cmo se puede medir la eficiencia cataltica de una enzima?

k3 k1

k2 E + S ES E + P

La eficiencia cataltica de una enzima es el reflejo de dos procesos: 1. La unin del sustrato a la enzima (Km) 2. La conversin de sustrato a producto (k3 kcat)

kcat/Km

Determinacin experimental de Km y Vmax

Determinacin experimental de Km y Vmax

Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimtica

Vo

ToC

desnaturacin por calor

Efecto de la Temperatura sobre la actividad enzimtica

Modificacin reversible de la actividad

enzimtica

Efecto de Inhibidores

[I1]

[I2]

Km1

Km2

Competitive Inhibition

No inhibitor

Vo

[S]

Inhibicin no competitiva

sin inhibidor

[I1]

[I2] Vmax2

Vmax1

Vmax

Km

sin inhibidor

[I]

1/[S]

1/Vo

-1/Km

Los agentes farmacolgicos pueden ser utilizados como inhibidores de la actividad enzimtica. Drogas anticancergenas: quimioterapia.

Regulacin de la actividad enzimtica por modificacin de su

concentracin

Ejemplo de Induccin y Represin Enzimtica en el metabolismo de Aminocidos: Ciclo de la urea Las enzimas del ciclo de la urea aumentan o disminuyen su concentracin en forma dependiente del contenido de aminocidos en la dieta.

Regulacin de la actividad de una enzima por modificacin covalente

La enzima modifica su actividad como consecuencia del cambio en el estado de fosforilacin

Regulacin de la actividad de una protena por fosforilacin

Enzimas alostricas Enzimas con sitios de unin para molculas reguladoras de la actividad enzimtica en sitios distintos al del sustrato

Fosfofructoquinasa I: tetrmero

Estas enzimas presentan una cintica diferente a la Michaeliana: Cintica Sigmoide

Cintica Sigmoide

Cintica Sigmoide comparada con la cintica Michaeleiana

Para explicar este comportamiento proponemos un modelo en el cual el sustrato se une de manera cooperativa a la enzima (recordar hemoglobina). La enzima es adems multimrica.

Modelo concertado: Monod, Wyman y Changeux

La enzima existe en dos conformaciones T y R que se encuentran en equilibrio

K = [T] [R]

T

R

R

[T] > [R]

Modelo concertado: Monod, Wyman y Changeux

T: estado de baja afinidad por el sustrato R: estado de alta afinidad por el sustrato

K = [T] [R]

T R

S desplaza el equilibrio hacia la formacin de R

S S

R S

Los reguladores pueden inhibir o estimular la actividad de una enzima

Ejemplo: Fosfofructoquinasa I

Regulador alostrico: activador

Activacin por digestin proteoltica

Inhibicin irreversible o Inactivacin

Timidilato sintasa

En las clulas el uracilo y el fluoruracilo se

convierten en dUMP y FdUMP

El FdUDP forma un inermediario covalente con los

aminocidos del sitio activo que inactiva a la enzima

FIN