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PROYECTO CGPI: 20050585
DETECCIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS PRESENTES EN PRODUCTOS CÁRNICOS EMPLEANDO MÉTODOS MOLECULARES.
DIRECTORA: M. S.P. ELIZABETH FERNÁDEZ RENDÓN
RESUMEN En México como en otros países , la salmonelosis constituye una de las principales
causas de morbilidad y mortalidad. Salmonella a menudo infecta a los humanos por el
consumo de alimentos contaminados de origen animal. En la última década el número
de brotes y casos reportados se ha incrementado lo que parece estar relacionado con
la creciente industrialización de productos de origen animal.
Los métodos de cultivo utilizados como rutina para el aislamiento de Salmonella a partir
de alimentos, son laboriosos y consumen demasiado tiempo ya que involucran pasos
de pre-enriquecimiento en medios no inhibitorios, enriquecimiento selectivo con el
subsecuente aislamiento en medios selectivos con agar y la identificación bioquímica
del microorganismo en cuestión.
Varias estrategias han sido propuestas como alternativa para reducir los tiempos de
análisis, una de ellas la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una herramienta
de la biología molecular altamente específica.
El problema se complica ya que es necesario contar con los aislamientos del
microorganismo sospechoso, en este caso las salmonelas, para poder emplear este
método, lo que incrementa el tiempo de análisis.
Aunque esta técnica puede ser extremadamente efectiva sobre suspensiones de ácidos
nucleicos puros (bacteria aislada), esta sensibilidad es reducida dramáticamente
cuando se aplica directamente a muestras biológicas complejas como son los
alimentos, por un sin número de compuestos tales como lípidos, sales y proteínas que
afectan la reacción, evitando la polimerización.
La propuesta del proyecto que se concluye consistió en utilizar la reacción en cadena
de la polimerasa directamente de los alimentos evitando los pasos de pre-
enriquecimiento, enriquecimiento y aislamiento de las salmonelas de los alimentos y
acortar los tiempos de análisis.
Una parte fundamental fue eliminar todos los componentes inhibitorios de la reacción en
cadena de la polimerasa con la purificación del DNA mediante tratamiento con
proteinasa K y fenol.
Varios ensayos empleando concentraciones conocidas de una cepa tipo fueron
desarrollados sobre muestras de carne de aves que resultó, de acuerdo a la
bibliografía, la que presenta mayor frecuencia de aislamiento de Salmonella en nuestro
país. Los resultados obtenidos con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
fueron comparados con los que se obtuvieron con la técnica convencional de cultivo
como estándar de oro.
Se logró detectar la presencia de Salmonella spp empleando la técnica de la reacción
en cadena de la polimerasa directamente de los alimentos cuando se inocularon las
muestras de carne de pollo con concentraciones de aproximadamente 100 bacterias/
ml.
Debido a lo costoso de los reactivos no fue posible emplear esta metodología en un
estudio de campo como son rastros de pollo.
Una ventaja de la técnica es que permite hacer un muestreo externo del producto o
alimento de manera que se pueden tomar las muestras destruir el alimento con un
lavado externo.
Es conveniente señalar que la técnica explorada es una prueba tamiz y que deberá
comprobarse la presencia del patógeno en los alimentos por cultivo ya que es posible
que las bacterias que nos son ya viables puedan dar la prueba positiva.
Introducción
En los países subdesarrollados las enfermedades gastrointestinales constituyen una de
las principales causas de morbilidad y mortalidad. En México, para 1989, las diferentes
instituciones de salud notificaron, 3,419 casos de brucelosis, 9,790 de shigelosis,
10,939 de tifoidea, 30,899 intoxicaciones alimentarias no especificadas, 72,754 de
salmonelosis y 1,948,542 de otras infecciones intestinales, lo que da un total de
2,076,343 episodios relacionados con transmisión alimentaria.
Salmonella muy a menudo infecta a los humanos a través de alimentos contaminados
de origen animal; el pollo y huevos en particular han sido implicados. El número de
casos reportados de salmonelosis ha incrementado durante la pasada década en varios
países del oeste. El incremento parece estar relacionado a la creciente industrialización
de los alimentos de origen animal.
Los métodos de cultivo usados para la detección de Salmonella en alimentos de origen
animal son laboriosos y consumen demasiado tiempo. Los métodos convencionales de
cultivo usados hoy en día para el análisis de Salmonella involucran pre-enriquecimiento
en agua peptonada, enriquecimiento selectivo en caldo, siembra en medios selectivos,
y la subsecuente identificación por pruebas bioquímicas.
El procedimiento puede consumir por lo menos tres días para obtener colonias
sospechosas que deberán identificarse plenamente. Varias estrategias de análisis
alternativo han sido propuestas, y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en
particular ha sido propuesta por ser una herramienta de diagnóstico molecular
altamente específica. Aunque esta técnica es extremadamente efectiva sobre
soluciones puras de ácidos nucleicos, esta sensibilidad puede ser reducida
dramáticamente cuando esta es aplicada directamente a muestras biológicas complejas
como son los alimentos. Puesto que los alimentos pueden originarse de ambas fuentes
animal y vegetal, la inhibición puede ser causada por un sin número de compuestos
comúnmente encontrados en los alimentos, tales como lípidos, sales, y proteínas, así
como sustancias presentes en los medios de cultivo empleados durante el
enriquecimiento.. Otros tipos de DNA y células diferentes al del organismo blanco
también han sido mostrados por afectar ambas, la sensibilidad y especificidad de la
PCR.
Para lograr una alta eficiencia a través del método de la PCR que sustituya el análisis
de rutina de muestras de alimentos, se requieren métodos rápidos y de simple
preparación. Muchos métodos de preparación de muestras, tales como la extracción de
DNA son laboriosos y caros y no proveen la calidad de DNA molde deseado. Por lo
tanto, existe la necesidad de un método de preparación de muestras simple. El uso de
cultivo de enriquecimiento previo al análisis de la PCR tiene varios propósitos,
incluyendo (i) dilución de substancias inhibidoras de la PCR presentes en la muestra,
(ii) multiplicación del microorganismo blanco para proveer concentraciones detectables,
(iii) dilución de células muertas y por último (iv) la posibilidad de aislar el organismo
blanco para estudios complementarios.
El propósito del trabajo fue determinar la presencia de Salmonella por métodos
moleculares para evaluar su sensibilidad como técnicas alternativas en el diagnóstico
de productos cárnicos.
La hipótesis fue es posible detectar la presencia de Salmonella spp. a partir de carne
de aves sin el empleo una etapa de enriquecimiento de la muestra.
Uno de los principales problemas abordados fue eliminar los medios de enriquecimiento
en la detección de la Salmonella a partir de los alimentos, ya que aunque la
concentración de bacterias patógenas en el alimento pueden ser suficientes para ser
detectadas, se requieren concentraciones suficientes del microorganismo en los
alimentos ya que éste se comporta como una matriz que retiene a los microorganismos,
lo que dificulta su extracción. El enriquecimiento en el caso del análisis de alos
alimentos se muestra como una alternativa ya que incrementa el número de
microorganismos, lo que facilita su detección por la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa, sin embargo consume tiempo valioso en el diagnóstico. Una forma de
resolver este problema fue lavar externamente la carne de pollo de tal forma que se
pudiera retirar cualquier contaminación principalmente externa y concentrar las
bacterias por medio de centrifugación, separar el paquete celular en donde se esperaba
la presencia del microorganismo. Esto además de evitar que en el alimento fueran
atrapadas algunas bacterias, facilita el proceso de análisis ya que el producto puede ser
muestreado sin causarle ningún deterioro.
Otro problema abordado fue la eliminación de aquellos agentes inhibitorios que se
encontraban en el alimento y que interfieren con la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) como son las proteínas, grasas, etc Para ello se le dio un tratamiento con
proteinasa K y fenol para eliminar estas interferencias en los concentrados de bacterias
obtenidas a partir del lavado.
El último problema abordado fue hacer que la sensibilidad de la técnica fuera adecuada
para poder utilizarla en muestras con concentración de bacterias diferente.
En el trabajo se inocularon muestras de pollo con concentraciones conocidas de una
cepa tipo de Salmonella spp. se pusieron en bolsas de polietileno y se adicionó agua
peptonada para recuperar la contaminación externa, empleando frotación del producto.
El líquido recuperado fue analizado por medo de la técnica de la reacción en cadena de
la polimerasa previo al tratamiento con proteinasa K y fenol para obtener el DNA de la
muestra.
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa detecta la presencia de un gen
que codifica una invasina presente en las bacterias del género Salmonella.
Al mismo tiempo que se realizó este ensayo, por el método tradicional de cultivo fue
analizado el alimento que se inoculó para determinar que no estuviera contaminado con
este microorganismo desde antes y esto incrementara la posibilidad de encontrar
positivo el alimento. Asimismo al momento de inocular las muestras se realizó un
recuento de las salmonelas para saber la concentración a la cual se encontraban por
medio de la técnica de vaciado en placa con agar cuenta estándar.
La presente investigación contribuye con métodos de análisis que disminuyen los
tiempos de diagnóstico en la industria alimentaria. En la actualidad se pueden emplear
este tipo de métodos pero se requiere del aislamiento de las bacterias para realizarlo, la
principal contribución es realizar la detección de la bacteria directamente del alimento
sin perder tiempo en su aislamiento. Se puede emplear como una prueba tamiz que
permite liberar los productos asegurando que no se encuentran contaminados con este
patógeno y si la prueba es positiva debe ser confirmada la presencia del
microorganismo por el método convencional de cultivo pero en un número reducido de
muestras.
MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 1- DIAGRAMA GENERAL DE TRABAJO
Cepa tipo de Salmonella
Estandarizar el inóculo deSalmonella para los ensayos de
la PCR
Estandarizar la técnica de PCR para la detección de Salmonella
directa del alimento
Detección de Salmonella en muestras de carne de
aves por PCR
Detección de Salmonella en muestras de carne de
aves por cultivo
Figura 2- Estandarización del inóculo de Salmonella.
Inocular un tubo con caldo Mueller-Hinton
Incubar por 4 h a 37° C hasta alcanzar la concentración del tubo 0.5 del nefelómetro de McFarland (1.5 x 108 bacterias/ml)
Realizar diluciones decimales hasta 107
Sembrar cada dilución en placas con agar cuenta estándar
Cepa de Salmonella
Realizar el recuento de colonias de Salmonella spp en cada
dilución.
Seleccionar las diluciones con 10, 100 y 1000 bacterias/ml
Figura 3- Estandarización de la PCR para la detección de Salmonella spp a partir de muestras de pollo inoculadas.
Carne de pollo
Pasar a bolsa estéril + 300 ml de agua peptonada 0.1 %
Homogeneizar en stomacher 230 rpm/ 1 min.
Centrifugar el agua de lavado a 5000 rpm/ 15 min.
Resuspender sedimento en agua peptonada 0.1%
Preenriquecimiento en 10 ml de agua peptonada 1%
Inocular con 1 ml de una suspensión con concentraciones
conocidas de Salmonella
Incubar a 37ºC 5 h en agitación
Enriquecimiento selectivo
0.5 ml en 10 ml de caldo selenito
0.5 ml en 10 ml de caldo tetrationato
Incubar a 42º C por 24 h.
Siembra en medios selectivos Mc. Conkey, XLD, sulfito de bismuto
Identificación bioquímica presuntiva
Identificación serológica
1 ml 1 ml 1 ml
Centrifugar 5000 rpm/15 min.
Resuspender en 1 ml de agua peptonada 0.1%
Extracción y purificación de DNA
Inocular con 1 ml de una
suspensión con concentraciones
conocidas de Salmonella
Tomar 1 ml
Extracción y purificación
de DNA
PCR
Cepas.- Para este trabajo se utilizará la cepa de Salmonella enteritidis ATCC 203
de la colección del Laboratorio de Bacteriología Médica del IPN-ENCB.
Material biológico.- Se colectaran muestras de pierna y muslo de pollo en
diferentes locales de una Central de Abastos en los cuales se expende el pollo a
granel para consumo humano.
Estandarización del inóculo de Salmonella.- A partir de un cultivo puro de 24 h
de S. enteritidis en caldo Mueller-Hinton, se toma una asada y se inocula otro
tubo con caldo Mueller-Hinton, se incuba a 37° C por 4 h hasta alcanzar la
concentración del tubo 0.5 del nefelómetro de Mc Farland (1.5 x 10 8 bacterias/ml),
a partir de este último se realizan diluciones decimales hasta 107 , se siembra 0.1
ml de cada dilución en placas con agar cuenta estándar, se incuban a 37° C por
48 h. Posteriormente se realiza el conteo de colonias de Salmonella spp en cada
dilución, se selecciona la dilución con 10, 100 y 1000 bacterias/ml.
Tratamiento de la muestra para la estandarización de la PCR.- Dos piezas de
pollo (pierna y muslo) serán homogeneizadas en 300 ml de agua peptonada 0.1%
en una bolsa plástica estéril. Cada bolsa es sacudida a fondo en un stomacher a
230 rpm/1 minutos, posteriormente se centrífuga el agua de lavado a 5000 rpm
por 15 minutos, finalmente se resuspende el sedimento en agua peptonada 0.1%.
Contaminación de la muestra con enriquecimiento para estandarización de
la PCR.- Se inocula con 1 ml de una suspensión de S. enteritidis con
concentraciones de 10, 100 y 1000 bacterias/ml en la suspensión obtenida en el
paso 7.6, la mezcla se coloca en 10 ml de agua peptonada 1 % y se incuba 5 h a
37° C, luego de la incubación, el cultivo se centrífuga a 5000 rpm por 15 minutos,
el sedimento se resuspende en 1 ml de agua peptonada, a partir del cual se lleva
a cabo la extracción y purificación del DNA para posteriormente procesarlo para
PCR.
Contaminación de la muestra sin preenriquecimiento para estandarización
de PCR.- Se toma 1 ml de la suspensión del sedimento obtenida en el paso 7.6 y
se le adiciona 1 ml de una suspensión de S. enteritidis para obtener una
concentración de 10, 100 y 1000 bacterias/ml, se mezcla y se toma 1 ml para
extracción y purificación de DNA para posteriormente procesar para PCR.
Método para el aislamiento de Salmonella spp por la técnica oficial de
cultivo (NOM-114-SSA1-1994). Inocular 1 ml de una suspensión de bacterias
obtenidas por lavado externo con stomacher de dos piezas de pollo (pierna y
muslo) a dos tubos de medio de enriquecimiento selectivo conteniendo 10 ml de
caldo selenito y 10 ml de caldo tetrationato, adicionar a éste último 0.2 ml de una
solución de yodo-yoduro. Incubar a 42º C por 24 h.
Después del tiempo de incubación mezclar el tubo con caldo selenito cistina y
sembrar una asada por estría cruzada en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),
agar verde brillante (VB), y una tercera caja con cualquiera de los medios
selectivos adicionales (agar entérico de Hecktoen o agar sulfito de Bismuto).
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato e incubar las placas 24
± 2 h a 35º C.
Identificación bioquímica. Seleccionar al menos 2 colonias típicas de cada medio
selectivo. Inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con
agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie y por punción en el fondo.
Incubar por 24 ± 2 h a 35º C.
Tipificación serológica. Se colocan 2 gotas de solución salina estéril 0.85% en un
portaobjetos y se suspende una porción del cultivo desarrollado en TSI,
posteriormente se agrega una gota de antisuero polivalente somático “O”, se
mezcla con movimientos rotatorios aproximadamente durante 1 minuto. La
presencia de aglutinación (grumos) en el portaobjetos se considera como positiva.
Cuando la aglutinación es positiva con el antisuero polivalente, se procede a
realizar la tipificación con antisueros para los grupos A, B, D, E y para el antígeno
Vi.
Extracción de DNA.- Extracción del DNA de las muestras contaminadas natural y
artificialmente. Se toma 1 ml de alícuota de la muestra en agua peptonada se
centrifuga a 10,000 x g en un tubo de microcentrifuga por 5 min a 4º C. El
sobrenadante es cuidadosamente desechado, y el paquete celular se resuspende
en 300 µl de buffe r TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA [pH 8.9] 0.1 mM). El tubo de
microcentrifuga es incubado por 10 min a 100º C en baño de agua e
inmediatamente enfriado en hielo. Después se centrifuga a 14,000 X g a 4º C por
5 min, el sobrenadante conteniendo el DNA es cuidadosamente transferido a un
nuevo tubo de microcentrifuga.
7.11 Purificación de DNA mediante tratamiento con proteinasa K y fenol.- Se
transfiere el lisado a uno o más tubos de centrífuga, se adiciona proteinasa K (20
mg/ml) hasta una concentración final de 100 µg/ml, mezclar cuidadosamente, se
incuba en un baño de agua por 3 h a 50° C. Remover la mezcla de vez en vez.
Posteriormente se mantiene la solución a temperatura ambiente y se adiciona un
volumen igual de fenol equilibrado con Tris-Cl 0.1 M (pH 8.0). Se mezclan
cuidadosamente las dos fases volteando lentamente el tubo durante 10 minutos,
posteriormente se separan las dos fases por centrifugación a 5000 g por 15 min,
en seguida se transfiere la fase acuosa a un tubo de centrífuga nuevo. Se repite la
extracción con fenol 2 veces más.
Técnica de PCR para la detección de Salmonella spp. La PCR es realizada en
un termociclador Gen Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Para esta
técnica se utilizaran los iniciadores para el gen invA propuesto por Rahn y cols.,
1992, el cual está localizado sobre la isla de patogenicidad 1 de Salmonella spp y
codifica una proteína del sistema de secreción tipo III (Collazo y Galán, 1997).
Cuadro II. Iniciadores utilizados para la PCR.
Gen Iniciadores Secuencia Tamaño del amplificado
(pb)
Temperatura de alineamiento (° C)
inv A 139 141
GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA TCATCGCACCGTCAAAGGAACC 284 64
Esta técnica se realizará empleando un volumen de 25 µl de la mezcla para PCR
conteniendo 0.4 µM de cada iniciador, 200 µM de cada dNTP (Roche
Diagnostics), 1X PCR buffer (20mM Tris-HCl [pH 8.4], 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2,
0.75 U Taq polimerasa (Invitrogen), y 5 µl de muestra de DNA. Las condiciones de
incubación son 95°C por 1 min. Seguido de 35 ciclos de 95°C por 30s, 64º C por
30 s, y 72 °C por 30 s. Se emplea una extensión final de 72°C por 4 min.
Una alícuota de 10 µl de un producto de PCR se coloca sobre un gel de agarosa
1.8% conteniendo 0.5 µg de bromuro de etidio/ml y se corre a 6 V/cm por 90min.
Equipo para electroforesis y peso estándar.
RESULTADOS
Meta 1
Recopilar información bibliográfica que sustentara la presente investigación.
RESULTADOS
Con base en aproximadamente 70 citas bibliográficas se justificó el presente
trabajo, se fundamentó la metodología utilizada y los resultados obtenidos.
Meta 2
Detección de cepas tipo de Salmonella spp. con la técnica de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) utilizando diferentes inicadores recomendados
para su demostración.
RESULTADOS
Para el cumplimiento de esta meta se revisó la bibliografía existente y se escogió
con base a otros estudios realizados con este microorganismo, aquella secuencia
de iniciadores que permitiera detectar diferentes especies de Salmonella que
coincidiera con los tipos serológicos que se describen en nuestro país. Fue
necesario realizar un Blast (programa que permite realizar la homología de las
secuencias de gen escogido con las de las especies de Salmonella y otros
microorganismos que pudieran contener este gen para eliminar aquelllas
secuencias que tuvieran problemas. En un trabajo previo realizado por Rahn y
cols., 1992 se probó la secuencia de iniciadores escogida y se estudiaron las
posibilidades de obtener resultados positivos con varias cepas diferentes a
Salmonella.
La secuencia utilizada se muestra a continuación:
Gen Iniciadores Secuencia Tamaño del amplificado
(pb)
Temperatura de alineamiento (° C)
inv A 139 141
GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA TCATCGCACCGTCAAAGGAACC 284 64
Los iniciadores detectan el gen invA propuesto por Rahn y cols., 1992, están
localizados sobre la isla de patogenicidad 1 de Salmonella spp y codifica una
proteína del sistema de secreción tipo III (Collazo y Galán, 1997).
RESULTADOS
Los resultados incluyeron la estandarización de la técnica para detectar la cepa
tipo de Salmonella inoculada en muestras de pollo.
En la figura 4 se observa la extracción del DNA de algunas cepas utilizadas para
lograr la estandarización de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa 0.8% de DNA bacteriano. Carril 2 (DNA de S. tiphymurium), carril 3 (DNA de una cepa de Salmonella aislada de carne de pollo), carril 4 (DNA de Salmonella infantis).
1 2 3 4
Una vez comprobado que se había logrado extraer el DNA de las cepas en
estudio, se procedió a realizar los primeros ensayos de amplificación de DNA
mediante la técnica de PCR.
El siguiente ensayo de PCR que se hizo fue para probar 3 temperaturas de
alineamiento, una a 64º C y las otras dos, 6º C arriba y abajo de la indicada, es
decir 70 y 58º C. Para este ensayo se usó DNA de Salmonella typhimurium.
Como puede observarse en la figura 5, las tres temperaturas de alineamiento
probadas (70, 64 y 58º C), se obtuvo buena amplificación, por lo que se decidió
elegir la temperatura intermedia entre estas que es la de 64º C.
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa al 1.6% de los amplificados de DNA de S. typhimurium a diferentes temperaturas de alineamiento. Carril 1 (amplificado del DNA de S. typhimurium a una temperatura de alineamiento de 70º C), carril 2 (amplificado del DNA de S. typhimurium a una temperatura de alineamiento de 64º C), carril 3 (amplificado del DNA de S. typhimurium a una temperatura de alineamiento de 58º C), carril 4 (marcador de peso molecular). Carril 5-8 (Otras muestras). Una vez obtenidos los productos de amplificación (mezcla de reacción y
condiciones de amplificación como habían sido establecidas anteriormente), se
cargaron en los pozos de un gel de agarosa 1.6%, 10µl del amplificado más 2.5 µl
1 2 3 4 5 6 7 8
350 800
2652 pb
50
de azul de bromofenol y 2 µl del marcador de peso molecular más3 µl de agua
destilada estéril y 3 µl de azul de bromofenol.
Después de tener establecidas las condiciones de reacción para la PCR, lo
siguiente fue amplificar el DNA de cepas de Salmonella.
En la figura 6 se muestran los resultados obtenidos con la secuencia de
iniciadores escogida capaz de detectar varias especies de Salmonella, las bandas
de tres cepas de Salmonella que fueron amplificadas en el gel de agarosa
muestran los productos de amplificación esperados de 284 pb.
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 1.6% de los amplificados de DNA de Salmonella typhimurium (carril 1), Salmonella. infantis ( carril 2), Salmonella enteritidis (carril3), marcador de peso molecular (carril 4).
50
350
800
2652
1 2 3 4 5 6 7 8
Meta 3 Recuperación del patógeno por la técnica de cultivo Inoculación de la cepa tipo de
Salmonella spp en concentraciones de 10, 100 y 1000 cel/g en carne de ave y su
recuperación por la técnica de cultivo .
RESULTADOS
En las figuras 7, 8 y 9 se muestran los resultados obtenidos con las muestra
contaminadas con Salmonella . La figura 7 muestra los productos de amplificación
cuando se utilizaron 1000 bacterias/mL de alimento, la figura 8 muestra los
resultados obtenidos cuando se inocularon 100 bacterias/mL del alimento y en la
figura 9 se muestran los resultados obtenidos cuando se inocularon solamente 10
bacterias/mL de alimento.
Figura 7. Electroforesis en agar de agaros a que muestra los resultados de la inoculación de muestras de pollo con 1000 bacterias/ml de S. typhimurium. Carril 1: Muestra 1. Carril 2: Muestra 2. Carril 3: Muestra 3.Carril 4: Muestra 4. Carril 5: Control negativo.Carril 6: Control positivo. Carril 7: Marcador de peso molecular.
2652 pb
800 pb
350 pb
1 2 3 4 5 6 7
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa que muestra los resultados de la inoculación de muestras de pollo con 100 bacterias/ml de S. typhimurium. Carril 1: Muestra 1. Carril 2: Muestra 2. Carril 3: Muestra 3. Carril 4: Control negativo. Carril 5 Control positivo. Carril 6: Marcador de peso molecular
2652 pb
800 pb
350 pb
1 2 3 4 5 6
Figura 9. . Electroforesis en gel de agarosa que muestra los resultados de la inoculación de muestras de pollo con 10 bacterias/ml de S. typhimurium. Carril 1: Muestra 1.Carril 2: Muestra 2 Carril 3: Muestra 3. Carril 4:Control positivo Carril 5: Marcador de peso molecular Los resultados obtenidos nos indicaron que cuando se inocularon 10 bacterias de
Salmonella en las muestras, los resultados obtenidos no fueron reproducibles en
todas las muestras inoculadas como se observa en la figura 9 en donde
solamente en una de las tres muestras inoculadas se logró detectar a la bacteria
por lo que se deduce que la sensibilidad de la técnica es de 100 bacterias/mL.
Meta 4
Detección de Salmonella por PCR directa del alimento con enriquecimiento.
Inoculación de la cepa de Salmonella en diferentes concentraciones en carne de
ave y su detección con enriquecimiento de la muestra.
RESULTADOS
Debido a que los resultados obtenidos en los experimentos anteriores fueron sin
la utilización de los medios de enriquecimiento, no se ensayaron con el
enriquecimiento ya que se alargarían los tiempos de análisis de las muestras.
1 2 3 4 5
2652 pb
800 pb
350 pb
Meta 5
Detección de Salmonella por PCR directa del alimento sin enriquecimiento.
Inoculación de la cepa de Salmonella en diferentes concentraciones en carne de
ave y su detección sin enriquecimiento
RESULTADOS
Con los resultados obtenidos en la meta 3 se concluyó que si era posible detectar
la presencia de Salmonella en las muestras sin enriquecimiento, con lo que se
concluye que el método es suficientemente sensible como para detectar a la
bacteria blanco con el manejo propuesto en el proyecto.
Será necesario realizar estudios de campo en donde se analicen muestras
contaminadas en forma natural para observar el funcionamiento de la técnica.
En el presente trabajo no se continuó con estos ensayos ya que lo costoso de los
reactivos empleados solamente nos permitía llegar a cumplir estas metas y en un
estudio recurrente se elevaría el costo del proyecto que difícilmente podría ser
apoyado con un presupuesto superior al proyecto inicial.
IMPACTO
El presente trabajo se fundamentó en la necesidad que se tiene en la industria
alimentaria de contar con métodos más rápidos para liberar lotes de productos
que no tengan riesgos de producir enfermedad al ser consumidos.
La salmonelosis es una enfermedad endémica que provoca serios problemas de
salud en la población. Con los tratados de libre comercio es exigencia de otros
países que los productos de exportación estén libres de patógenos como
Salmonella el presente proyecto tendría un impacto en el sector productivo a nivel
de rastros en donde es común encontrar esta contaminación con Salmonella que
al ser aislada con los métodos de cultivo se prolonga el tiempo de liberación de
lotes del producto avícola.
La implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permitiría, a
nivel de rastro, liberar aquellas canales que se encontraran libres del patógeno,
dada la especificidad de la prueba y sobre todo en muestras que solamente
fueran sometidas a lavado, sin destrucción del producto, aquellas que resultaran
positivas necesariamente deberán ser sometidas a pruebas de cultivo de
bacterias para comprobar la presencia de Salmonella dado que con las células
muertas se pueden encontrar productos de amplificación. De tal forma que la
utilización de la PCR se propone como una prueba tamiz que permite descartar
las canales de pollo que estén libres del patógeno.
El principal beneficio es en el sector salud al proporcionar al consumidor
productos inocuos que no le provoquen enfermedades.
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