quimica analitica clinica

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QUÍMICA ANALÍTICA CLÍNICA 1

QUÍMICA A NALÍTICA CLÍNICA

TEOR Í A

Licenciatura de Química 10/11/2011




TEMA 1: P rincipios básicos del laboratorio clínico 1 - Unidades d e m edic ión :

A finales del siglo XVIII aparece el sistema métrico que se caracteriza porque introduce dos

unidades que son el metro y el kilogramo. El metro se define como la millonésima parte de uncuadrante terrestre y el kilogramo se define como el peso de un decímetro cúbico de agua.

A finales del siglo XIX se renueva el sistema métrico pasando a llamarse sistema CGS porque

tenía 3 unidades (cm, g y segundos). En 1904 se volvió a renovar llamándose sistema MKS (m, kg y

segundos). Este último sistema es la base de lo que conocemos como sistema internacional (SI). Las

unidades del sistema internacional pasaron a ser 6 las unidades básicas. A partir de 19970 se introduce

una nueva medida para medir cantidades de sustancias que es el mol.

A partir de estas siete unidades básicas se obtienen el resto aplicando ecuaciones físicas yquímicas. Se usan múltiplos y submúltiplos para expresar cantidades mayores o menores a la unidad

básica.

Hay ciertas excepciones como:

- En el tiempo normalmente se usa el día, hora, minutos en lugar del segundo.

- En el volumen normalmente se usa el litro con sus submúltiplos en lugar del m3.

- Para valores de concentración usamos la molaridad (mol/l) si se conoce el peso molecular y

g/l si no se conoce en lugar de mol/m3.

- El pH es el –log[H+] y no se usa la unidad del SI que sería mol/m3.

Lo normal es que cualquier laboratorio trabaje con el sistema internacional pero muchas

unidades no se emplea. Pero en libros y artículos si se emplea las unidades del sistema internacional.

Una unidad muy usada es la unidad empleada para la actividad enzimática, en el sistema

internacional es el Katal que es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un mol de

substrato por segundo, sin embargo habitualmente se utiliza otra unida d alternativa llamada “unidad

internacional” y se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un µmol por

minuto.

2 - Unidades d e m asa :

El primer requisito para un laboratorio es tener una balanza de calidad para preparar las

disoluciones y hacer análisis gravimétricos. Las balanzas más habituales son las mecánicas y

electrónicas/eléctricas.

- Balanzas mecánicas: las más usuales son de dos o 1 plato.




o En la de dos platos: tiene dos platos unidos por una barra o fulco apoyada en su

centro de gravedad, para ajustar el peso normalmente tienen un puente ajuste unido

al fulco.

o En la de un plato: tienen tres brazos puentes, en dos de ellos es donde se cuelgan

las pesas y el tercero es para ajustar.

El error de este tipo de balanzas es de ± 0’1 gra mo, y el tiempo que se tarda en pesar es muy alto.

- Balanzas electrónicas: consisten en un plato situado sobre una bobina eléctrica que al pesar

se activa originando un campo magnético que empuja al plato a su posición inicial. El

requisito de estas balanzas es que deben ser aisladas del resto del instrumental para evitar

cualquier tipo de vibración, además deben de estar completamente limpias. Hay diferentes

categorías:

o Granatarios: podemos pesar entre 1 y 0’1 mg o Analíticas: podemos pesar hasta µg.

3 - Mater i a l d e l abora tor io :

La mayor parte del material de laboratorio puede ser de cristal o de plástico. El plástico es más

resistente pero el vidrio es mas inerte y transparente pero además es mucho más caro. La mayor parte

de los laboratorios compran material de vidrio.

Hay muchos tipos de vidrios pero el que se recomienda es el borosilicato que tiene muy pocos

alcalinos y alcalinotérreos y sin metales de transición además de aguantar hasta temperaturas de 600ºC, por eso son idóneos para introducirlos en estufas siempre que no sea material aforado o esmerilado.

Las pipetas pueden ser graduadas o aforadas, también en laboratorios clínicos se usa

micropipetas para volúmenes comprendidos entre 1 y 500 µl. Son muy exactos.

Otro instrumental: termómetros, centrífugas y estufas; estas dos últimas se utilizan para

tratamiento de muestras como sangre y orina.

4 - Agua d e l abora tor io :

Debe ser agua muy pura libre de metales y compuestos orgánicos.

Existe un comité nacional de laboratorios clínicos que ha establecido que existen tres grados de

pureza del agua:

Tipo 1: Más pura. Se debe utilizar para análisis cuantitativos. Análisis donde se emplea

cromatografía y técnicas espectroscópicas.

Tipo 2: Para análisis cualitativo. Pruebas de microbiología.

Tipo 3: Más impura. Se utiliza para fabricar agua tipo 2 y 1. Se utiliza para el lavado del

material.




Tipo 1 y Tipo 2: Se debe utilizar rápidamente porque se contamina con el CO2 y

microorganismos que hay en la atmósfera.

Tipo 2 y Tipo 3: Se pueden conservar en envases de polietileno o cristal.

Existen 5 procesos para obtener agua:

G Filtración: pasar agua por un tipo de filtros con 0’2 µm.

G Osmosis inversa: similar a la filtración. Se somete agua a presión haciendo pasar agua por

poliamidas aromáticas o acetato de celulosa.

De las dos formas consigo eliminar sólidos disueltos y gran parte de compuestos orgánicos. El

agua que se obtiene con estos dos procesos es de Tipo 3.

G Destilación: evaporar agua y condensarla eliminando muchos interferentes.

G Cambio iónico (desionización): consiste en pasar agua por una resina. Para eliminar cationes

utilizamos una resina de cambio catiónico, para eliminar aniones utilizamos una resina decambio aniónico.

Con la destilación y el cambio iónico eliminamos toda la materia orgánica e inorgánica así como

microbios. En ambos casos obtengo agua Tipo 2.

G Adsorción: al agua le quedan gases disueltos, así como sustancias de baja punto de ebullición.

Esos es posible eliminar con este proceso. Se pasa el agua por unas columnas que se

encuentran rellenas de carbón activo o arcillas, Así se obtienen aguas Tipo 1.

El instrumento mide la conductividad del agua que está saliendo y también la resistividad. Para

que el agua sea Tipo 1 la resistividad debe de ser superior a 10 megaohmios/cm. Si el agua no es muy

pura la conductividad será alta por lo que la resistividad será baja.

Agua con baja conductividad y alta resistividadÎ Agua pura.

5 - Segur idad e n e l l abora tor io c l ín i co :

Deben de existir normas de seguridad. Deben de tener duchas, campanas de gases, uso de batas

y gafas, extintores. Dependiendo de la muestra se tiene que usar guantes y mascarillas. Llevar gorros para no contaminar las muestras con pelo.

Debe de existir un manual de seguridad que explique los sistemas que hay que utilizar como las

normas de personal.

Así mismo, hoy día se está imponiendo el sistema de identificación de riesgos que son unas

pegatinas o anuncios en el material para informar del riesgo que pueden tener el material.

- El rombo de color azul: riesgo de salud

- El rombo de color rojo: inflamabilidad- El rombo de color amarillo: más o menos reactivo o estable




- El rombo de color blanco: otros riesgos distintos específicos de cada sustancia.

Los rombos que tienen unos números comprendidos entre 0-4: siendo 0 el de riesgo mínimo y

4 riesgo máximo.

Dependiendo del tipo de compuesto debemos de cumplir algunas normas:

A Inflamables volátiles: tienden a explotar con facilidad. Debende estar en frío, en el

frigorífico. No podemos meter alimentos o cualquier otro tipo de sustancias. Hoy se

trabaja bajo campanas de gases y para que la ebullición sea homogénea hay que utilizar

bolas de vidrio.

A Gases comprimidos: ejemplo: absorción atómica (acetileno y aire); fotometría de llama

(butano o propano) y ICP (argón). Debemos de tener diferentes balas de gases unidas

a los instrumentos. Puede haber escapes de gases que provocan explosiones.A Corrosivos: son los ácidos y las bases extremadamente fuertes. Hay que trabajar bajo

campana. Cuando mezclamos ácido fuerte y agua hay que añadir el ácido sobre el

agua. Cuando hay derrame de ácidos fuertes neutralizamos con una base. Si se

derrama una base fuerte nuetralizamos con ácido acético.

A Mercurio: es muy tóxico y no se puede enterrar como tal. Se hace reaccionar los

residuos de mercurio con tioacetoamida formándose los sulfuros de mercurio que no

son tóxicos y se pueden enterrar.

A Virus: son difíciles de controlar. Ejemplo: hepatitis. Estas muestras deben ir marcadas.

A Radioactividad: se hace radioinmunoanálisis y para esos inmunoanálisis hay que

utilizar sustancias radiactivas: I135 y I131. Estas sustancias hay que utilizarlas en

dependencias especiales.




TEMA 2: T

écnicas analí ticas más f recuentes utilizadas en quí mica clí nica

Técnicas espectrométricas

Las técnicas espectrométricas se basan en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con

la materia. Las principales técnicas espectrométricas empleadas en la actualidad en los laboratorios de

bioquímica clínica, son la espectrometría de absorción molecular ultravioleta y en el visible, la

fuorimetría, turbidimetría, nefelometría, Iuminometría y la espectrometría de absorción y de emisión

atómica.

1. Consideraciones g enerales

Los electrones en los átomos o las moléculas pueden distribuirse en varios niveles de energía,

aunque residen principalmente en los niveles más bajos o estado fundamental. Cuando se suministra

energía por medio de una radiación electromagnética, los electrones pasan a estados excitados, lo que

da lugar a un espectro de absorción. Sólo se absorbe la cantidad de energía exacta equivalente a la

diferencia de nivel energético, de acuerdo con las reglas de la mecánica cuántica. Cuando caen los

electrones de un nivel superior a un nivel inferior se emite exactamente un cuanto de energía y se

produce un espectro de emisión.

Las radiaciones electromagnéticas se consideran como un conjunto de corpúsculos, los fotones,

que llevan asociada una onda. Se denomina espectro electromagnético al conjunto de radiaciones

electromagnéticas y se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda:

- Rayos X (1-100 nm)

- Ultravioleta (100-390 nm)

- Visible (390-800 nm)

- Infrarrojo (800-100.000 nm)

- Microondas (100000-1000000 nm)

La relación entre la energía de la radiación y su frecuencia viene dada por la ecuación:

E = h J

donde E es la energía, J la frecuencia y h la constante de Planck. La frecuencia de la radiación

está relacionada con la longitud de onda de acuerdo con la ecuación:

J = c / O




Si se sustituye este valor en la ecuación de la energía se obtiene:

E = h c / O

que demuestra que la energía de una radiación electromagnética es inversamente proporcional a la

longitud de onda. De forma que las radiaciones electromagnéticas de menor longitud de onda (rayos

X) son las de mayor contenido energético.

Los análisis que emplean las radiaciones electromagnéticas pueden ser de absorción, emisión,

transmisión y reflexión. Las principales radiaciones electromagnéticas que se utilizan en los

laboratorios clínicos son las ultravioleta y las visibles.

2. Espectrometría d e a bsorción m olecular

La absorción por las moléculas biológicas de radiaciones de las regiones ultravioleta y visibledel espectro depende de la estructura electrónica de los átomos de carbono que las componen. Las

regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético y sus técnicas asociadas son las más

utilizadas en el trabajo analítico de rutina en los laboratorios de bioquímica clínica. El término luz se

usa para la energía radiante con longitudes de onda visibles para el ojo humano y las longitudes de

onda que las rodean.

2.1. L ey d e L ambert-Beer

La absorción de las radiaciones electromagnéticas por las disoluciones se rige por la Ley deLambert-Beer, que relaciona la intensidad de la luz incidente y la de la luz transmitida I, cuando un

rayo de luz atraviesa la longitud l de un medio que absorbe:

I = I0 e-k l

donde k es un coeficiente de absorción que depende de la naturaleza de las sustancias.

Para disoluciones diluidas, la Ley de Lambert-Beer puede escribirse de la forma:

I = I0 e

-a c l

donde “a ” es el coeficiente de absorción y “c ” la concentración de la disolución. La relación

entre las intensidades de la luz transmitida y la de incidencia I0 se denomina transmitancia y el

logaritmo decimal de la transmitancia es la absorbancia. Puede escribirse:

T = I / I0 A = -lg I / I0 = a c l

donde “a ” es la absortividad, característica de cada sustancia. Cuando la concentración se

expresa en mol/l, “a ” se escribe con el símbolo H, sus unidades son l / mol cm y se denomina

coeficiente de absorción molar. La Ley de Lambert-Beer queda de la forma:




A = H c l

2.2. C omponentes d e u n a parato d e a bsorción m olecular

Los espectrómetros son los instrumentos que se utilizan para las medidas de absorción de las

radiaciones electromagnéticas. Los principales componentes de un espectrómetro son (Fig. 2-1):

1. Fuente de luz.

2. Sistema de selección de longitud de onda

3. Dispositivo para la cubeta de espécimen

4. Detector de luz.

5. Dispositivo de lectura de la señal generada por el detector.

Este tipo de espectrómetros se denominan de un solo haz. Las medidas espectrométricas con un

solo haz presentan errores debidos a las fluctuaciones de la intensidad de la luz o a la inestabilidad de

los sistemas de detección. Para solventar estos problemas se utilizan aparatos de doble haz. Los

espectrómetros de doble haz (Fig. 2-2) dividen el rayo luminoso en dos haces, el que pasa por la

cubeta de referencia (blanco) y el que asa por la cubeta del espécimen. La señal que incide sobre el

detector es la diferencia (espécimen – referencia). El rayo luminoso se divide por medio de un espejo

giratorio, que hace incidir el mismo haz, alternativamente, por la cubeta con la referencia y por la cubeta con el espécimen. A continuación se describen las principales características de los

componentes de los espectrómetros.

Fuente de luz

La fuente de luz más utilizada para las medidas en la región visible del espectro (360-950 nm) es

la lámpara de wolframio. También, se utilizan lámparas de halógenos que proporcionan energía

radiante de mayor intensidad y son más duraderas. Para las medidas en la región ultravioleta 220 a 360

nm, se utilizan las lámparas de descarga de hidrógeno o de deuterio.

Sistema de selección de longitud de onda

La longitud de onda requerida para las medidas puede aislarse por medio de un filtro o de un

monocromador. Los filtros son los sistemas más sencillos y están formados por materiales que dejan

de forma selectiva las longitudes de onda deseadas, absorbiendo el resto. En los monocromadores, la

radiación procedente de la lámpara se dispersa por un prisma o por una rejilla de difracción en un

espectro, a partir del cual se aísla la longitud de onda deseada por medio de una rendija.

Los sistemas de selección de longitud de onda se catalogan por su amplitud de banda o paso de

banda, que es la anchura en nanómetros de la curva de transmitancia en el punto medio del pico (Fig.




2-3). Los filtros de vidrio tienen amplitudes de banda del orden de 50 nm, mientras que .los filtros de

interferencia poseen amplitudes de banda más estrechas, de alrededor de 5 a 10 nm. Los prismas

permiten el aislamiento de radiación de amplitud de banda de 0.5 a 1.5 nm. Las rejillas de difracción

permiten aislar energía radiante de amplitud de banda entre 20 y 35 nm, las peores, basta 0.5 nm o menos las menores. Las buenas rejillas de difracción son generalmente mejores sistemas de selección

de longitud de onda que los prismas.

Las rendijas de refracción hacen la separación porque el haz de luz se refleja sobre una

superficie con un elevado número de surcos, produciéndose la separación entre las distintas

longitudes de onda.

Cubetas

Las cubetas son los recipientes donde se colocan las disoluciones para las medidas de

absorbancia. Pueden ser cuadradas, redondas o rectangulares. Se construyen de vidrio, plástico o

cuarzo, y suelen tener un paso de 1 cm. Las cubetas de vidrio son útiles para las medidas entre 310 Y

1000 nm. Para lecturas por debajo de 310 nm se precisan cubetas de cuarzo, debido a que el vidrio y el

plástico absorben por debajo de esa longitud de onda.

Detectores de energía radiante

Los detectores de los espectrómetros convierten la luz que les llega en energía eléctrica. Los

detectores más utilizados para medir la intensidad de la luz en las regiones ultravioleta son los

fotodiodos y los tubos multiplicadores.

Dispositivos de lectura

La energía eléctrica procedente del detector se presenta mediante diversos dispositivos de

lectura. En la actualidad, la mayoría de los espectrómetros están controlados por ordenador. Poseen

programas que permiten manipular las señales, realizar curvas de calibrado, almacenarías y

transformar los datos.

Interferencias en las determinaciones espectrométricas

Las interferencias en las medidas espectrométricas son de dos tipos: las estáticas y las cinéticas.

Las interferencias estáticas se producen por sustancias presentes en el espécimen que no

experimentan variación durante la reacción analítica. Los ejemplos más típicos de este tipo de

interferencias en los laboratorios clínicos son la ictericia, la lipemia y la hemólisis. La corrección se

realiza utilizando un blanco con el espécimen al que no se añade alguna de las sustancias necesarias

para la reacción. Otra forma de corrección utiliza la lectura a varias longitudes de onda.




Las interferencias cinéticas se originan a causa de sustancias presentes en el espécimen que

reaccionan con algún componente de la mezcla de reacción de forma que la importancia relativa de su

contribución depende del tiempo, así como de su concentración. Cuando la sustancia reacciona con

mayor rapidez que la que se analiza, su presencia puede corregirse con un análisis cinético, mientrasque si lo que interfiere reacciona a la misma velocidad que lo que se analiza, la corrección se hace

realizando la determinación con la sustancia que hay que analizar y sin ella, y la corrección es una

simple sustracción.

Lectura a varías longitudes de onda

Como se ha señalado en el apartado anterior, las interferencias estáticas que se producen en

algunas determinaciones pueden eliminarse por lectura a dos o más longitudes de onda.

En general, la determinación de la concentración de un compuesto en disolución se realiza

midiendo su absorbancia, si el compuesto absorbe, transformándolo en otro compuesto que absorba

por medio de su reacción con los reactivos adecuados o haciendo que forme parte de una reacción en

la que otra sustancia experimente un cambio de sus propiedades de absorción de luz. La reacción de

producción del compuesto que absorbe puede utilizar reactivos químicos o sistemas enzimáticos. en

combinación con reactivos químicos. La medida de la concentración de sustancias en disolución por

técnicas espectrométricas de absorción se realiza con dos tipos fundamentales de métodos. los de

punto final y los eméticos o de medida de velocidad de reacción.Alternativamente, la concentración del espécimen puede obtenerse sin utilizar soluciones

estándar de concentración conocida, cuando se conozca el coeficiente de absorción molar del

compuesto del que se mide la absorbancia, utilizando la ley de Lambert-Beer.

c = A / H l

En los métodos cinéticos o de medida de la velocidad de reacción se determina la variación de la

absorbancia con el tiempo que se relaciona con la concentración. Los métodos eméticos suelen ser

mucho más rápidos y menos sensibles a las interferencias externas, como la turbidez o el color delespécimen, que los métodos de punto final.

3. Fluorimetría Se denomina fluorescencia a la emisión de radiación por los electrones excitados de compuestos

que previamente han absorbido radiación debido a que estos electrones vuelven a su estado

fundamental. La energía de la radiación emitida es menor y la Iongitud de onda, por tanto, mayor que

la de la radiación absorbida. La diferencia o aumento entre dos longitudes de onda se llama desviación

de Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con




compuestos que tienen grandes diferencias entre las Iongitudes de onda de excitación y de emisión.

El tiempo entre la absorción de la radiación electromagnética y la emisión de la fluorescencia es muy

pequeño, del orden de 10-8 segundos.

Un gran número de compuestos presentan el fenómeno de la fluorescencia, la mayoría de loscuales son sustancias que tienen enlaces múltiples conjugados con electrones S deslocalizados. La

fluorescencia se emite en todas las direcciones, puede cuantificarse y su medida es mucho más sensible

que la de la absorción de la radiación. Las medidas de fluorescencia se realizan con aparatos

denominados fluorimetros (Fig. 2-4), que constan de los siguientes componentes:

1. Fuente de luz de excitación

2. Filtro o monocromador primario

3. Cubeta con el espécimen

4. Filtro o monocromador secundario

5. Detector

6. Registro

La luz procedente de la lámpara de excitación se hace pasar por el filtro o monocromador

primario que selecciona la longitud de onda adecuada que incide sobre la cubeta con el espécimen.

Parte de la luz se absorbe y, como consecuencia del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor

longitud de onda. Esta luz se hace pasar por el filtro o monocromador secundario colocado

perpendicularmente al rimero a evitar interferencias de la luz de excitación. Finalmente. la luz llega al

detector, donde se transforma en energía eléctrica. El retardo entre la absorción de la radiación

electromagnética y la emisión de la fluorescencia se emplea en una clase de fluorímetros denominados

de resolución de tiempo, que eliminan las interferencias y son, por tanto, más sensibles.

La fuente de energía radiante de los fluorímetros (lámpara de excitación) es, generalmente, una lámpara de descarga de mercurio o de xenón, capaz de producir energía suficiente para excitar los

compuestos fluorescentes. Proporciona un espectro de energía radiante de elevada intensidad entre

250 y 800 nm. Los filtros o monocromadores utilizados para la selección de las Iongitudes de onda

primaria y secundaria, son análogos a los de los espectrómetros. Las cubetas pueden tener forma

cilíndrica o rectangular, en cuyo caso las cuatro caras deben ser traslucidas.

Las principales aplicaciones de las medidas fluorimétricas en los laboratorios clínicos se realizan

para la determinación de catecolaminas, estrógenos y porfirinas en orina, y algunas enzimas en suero,orina o fluidos biológicos.




4. Bioluminiscencia y q uimioluminiscencia

La luminiscencia es la emisión de luz como consecuencia de una reacción química. La

luminiscencia puede ser quimioluminiscencia cuando los electrones pasan a un estado excitado como

consecuencia de una reacción química y vuelven a su estado basal emitiendo luz, o bioluminiscencia cuando la emisión de luz surge como consecuencia de una reacción catalizada por una enzima.

La luminometría es la técnica que mide la luminiscencia. Para la medida de la luminiscencia se

requieren aparatos simples denominados luminómetros que constan de los siguientes componentes:

1. Cámara de mezcla/cubeta

2. Fotomultiplicador (detector)

3. Amplificador

4. Lector/registro

La cámara de mezcla/cubeta debe mantenerse a temperatura constante, ya que estas reacciones

son muy sensibles a la temperatura, particuIarmente las catalizadas por enzimas. Las principales

aplicaciones de la luminometría son en los sistemas de detección de los inmunoanálisis con reactivos

marcados, por ejemplo los enzimoinmunoanálisis que utilizan fosfatasa alcalina como enzima

marcadora con detección por luminiscencia.

5. Turbidimetría y n efelometría

La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de la solución particulada,

mientras que la nefelometría mide la luz dispersada a diversos ángulos por la suspensión particulada.

En el primer caso, turbidimetría, tendré que medir a una longitud de onda a la cual me esté asegurando

que la muestra no sufre ningún tipo de absorción, sino sólo dispersión de la luz.

Cuando un rayo de luz choca con una partícula en suspensión, parte de la luz se absorbe, parte

se refleja y parte se dispersa. La dispersión de la luz por una partícula depende de su tamaño, de suíndice de refracción con relación a la del líquido que la rodea y de la longitud de onda la luz. Cuando

la longitud de onda de la luz es mucho mayor que el tamaño de la partícula (d< 0.1 O), la luz se dispersa

de forma simétrica alrededor de la partícula, con un mínimo de la intensidad de la dispersión a 90º del

rayo incidente. Cuando la longitud de onda de la luz incidente es aproximadamente igual al tamaño de

las partículas (d=O) se dispersa más luz hacia delante que hacia atrás. Finalmente, cuando la longitud de

onda de la luz incidente es mucho menor que el tamaño de la partícula (d>10 O), la mayoría de la luz se

dispersa hacia adelante.




5.1. Aplicaciones d e l a t urbidimetría y l a n efelometría

La principal aplicación actual de la turbidimetría y la nefelometría en los laboratorios de

bioquímica clínica es para la determinación de proteínas específicas, utilizando métodos

inmunológicos. El tamaño de la mayoría de las proteínas solubles está comprendido entre 1 y 20 nm yel de los complejos antígeno-anticuerpo entre 50 y 100 nm. Los agregados que se forman tras la

reacción antígeno-anticuerpo tienen tamaños entre 300 y 1000 nm. Como se ha señalado antes, la

cantidad de luz dispersada depende del tamaño, de la cantidad y del índice de refracción de las

especies dispersantes, por lo que un aumento de cualquiera de estas magnitudes produce una

detectabilidad mayor. Para lograrlo se unen a los antígenos o a los anticuerpo s partículas de látex con

tamaño entre 100 y 300 nm, de manera que los agregados que se forman tienen tamaños mayores. Este

tipo de métodos se denominan inmunoanálisis potenciados.

Los principales problemas de la aplicación de la nefelometría y la turbidimetría a los sistemas

biológicos es la presencia de moléculas endógenas que dispersan la luz. Además, los reactivos deben

estar libres de polvo, ya que las partículas grandes producen una gran dispersión de luz. Es este

fondo o dispersión blanco la que limita la sensibilidad de la nefelometría y la turbidimetría. Estos

problemas se han solucionado con el diseño de instrumentos de gran sensibilidad y con la mejora de

la calidad de los anticuerpos.

5.2. Instrumentaciónp ara

l as

m edidas

t urbidimétricas

y n efelométricas

La turbidez puede medirse con un espectrómetro (se realizan medidas de absorbancia), de

forma que la sensibilidad de la turbidimetría está principalmente limitada por la exactitud y sensibilidad

del aparato, ya que este método mide el descenso de una señal grande de luz transmitida. Puede

utilizarse cualquier Iongitud de onda para la medida de la turbidez (siempre que no absorba el analito).

Las más empleadas son: 340 nm para la inmunoprecipitación con bajas concentraciones de la sustancia

que se mide; 500-700 nm para las pruebas que emplean partículas; y 800 nm para los análisis con

concentraciones elevadas de la sustancia que se mide.

Los nefelómetros son semejantes a los fluorímetros y su principal diferencia es que la longitud

de onda de excitación y de detección es la misma. Los nefelómetros están compuestos por los

siguientes componentes:

l. Fuente de luz.

2. Filtro de selección de la longitud de onda de excitación

3. Cubeta de espécimen

4. Filtro de selección de la longitud de onda de detección




5. Detector

6. Registro.

Los componentes ópticos de los nefelómetros son semejantes a los de los espectrómetros. Los

detectores se encuentran situados en algunos nefelómetros a 90º u otros ángulos comprendidos entre

10 y 90°.

Los aparatos para las medidas de dispersión de luz para la cuantificación de las reacciones

antígeno-anticuerpo deben detectar la presencia de exceso de antígeno.

La elección entre turbidimetría y nefelometría depende de la aplicación y de la instrumentación

de que se disponga. En general, las técnicas turbidimétricas suelen utilizarse ara concentraciones

elevadas de la sustancia que se mide, que dan lugar a grandes descensos de la luz transmitida, mientras

que las técnicas nefelométricas suelen emplearse para concentraciones bajas de la sustancia que se

mide, que dan lugar a poca turbidez. El límite de detección de las pruebas nefelométricas es de 1

mg/dl para las proteínas séricas.

6. Espectrometria a tómica

Los métodos descritos anteriormente están relacionados esencialmente con espectrometría

molecular. Mientras que las moléculas dan lugar a espectros de bandas, los átomos producen

espectros de línea claramente definidos. En general, y en contraste con la espectrometría molecular,las concentraciones de átomos no se miden directamente en disolución, sino que los átomos deben

volatilizarse en una llama o electrotérmicamente en un horno. En este estado los elementos emiten o

absorben fácilmente radiación monocromática a la longitud de onda adecuada. Normalmente se usan

nebulizadores (atomizadores) para dispersar las soluciones en la llama a través de las cuales se pasa la

luz. Alternativamente, el rayo de luz pasa en un horno a través e una cavidad que contiene el material

vaporizado. La emisión de luz se mide por espectrometría de emisión de llama la absorción de luz por

espectrometria de absorción atómica. La energía emitida o absorbida es proporcional al número de

átomos en el paso óptico.

6.1. E spectrometría d e e misión a tómica

La espectrometría de emisión atómica se ha denominado también fotometría de llama. Cuando

se calienta con una llama una emulsión de un metal, los electrones absorben energía y pasan a estados

excitados inestables. Los electrones regresan de forma espontánea a sus estados normales emitiendo

energía en forma de luz. La Iongitud de onda de la luz emitida en la caída de los electrones es

característica de cada elemento. Los metales alcalinos y los alcalinotérreos son fácilmente excitables

mediante una llama. La longitud de onda de la luz emitida en la caída de estos electrones a sus estados




normales corresponde a la región visible del espectro. Así, el sodio produce luz amarilla (589 nm), el

calcio rojo-amarillenta (622 nm), el litio roja (670 nm) y el potasio, violeta (166 nm) .

En condiciones controladas, la intensidad de la luz emitida es directamente proporcional al

número de átomos que la emiten y, en consecuencia, al número de átomos presentes en elespécimen. Los fotómetros de llama son aparatos para la medida de la intensidad de la luz emitida por

átomos como el sodio y el potasio. Constan de los siguientes componentes (Fig. 2-5):

1. Atomizador

2. Suministrador de combustible

3. Quemador

4.

Monocromador 5. Detector

6. Dispositivo de lectura

Los atomizadores producen el paso de una corriente de aire sobre un tubo capilar que tiene el

otro extremo dentro de la solución del espécimen. Se forman gotitas de varios tamaños (por efecto

Venturi) y las grandes se eliminan por un proceso de sedimentación. Este paso se requieren pues las

gotas más grandes tienden a no permanecer en la llama.

La llama debe ser muy estable su temperatura muy elevada. Se utilizan mezclas de gases como

propano o butano y aire, o acetileno y aire. El quemador es la parte donde se evapora

instantáneamente el disolvente y el espécimen se convierte en un gas, que se distribuye de forma

homogénea por la llama.

6.2. Espectrometría d e a bsorción a tómica

Los átomos en forma de vapor en su estado fundamental absorben luz de longitudes de onda

muy estrechas, pasando a estados de onda excitados. El elemento que quiere medirse se vaporiza por

medio de una llama o un método electrotérmico (horno de grafito). La fuente de energía radiante son

las lámparas de cátodo hueco, que están construidas con el mismo elemento que quiere medirse.

Cuando se excitan los átomos de la lámpara producen un vapor que emite un rayo de luz

monocromática de la misma Iongitud de onda que la que absorben los átomos de ese elemento. Los

espectrómetros de absorción atómica llevan también una lámpara suplementaria para corregir las

interferencias de fondo.

Los componentes de un espectrómetro de absorción atómica son (Fig. 2-6):

1. Lámpara de cátodo hueco




2. Nebulizador

3. Llama

4. Monocromador

5. Detector

La luz procedente de la lámpara de cátodo hueco se hace pasar por la llama donde se

encuentran los átomos del elemento que quiere medirse, nebulizados y en su estado fundamental.

Parte de la radiación se absorbe por los átomos del elemento, que pasan a un estado excitado. Durante

este proceso, se pierde parte de la luz, de forma que el descenso de luz que llega al detector es

directamente proporcional a la concentración del elemento en el espécimen.

Los quemadores electrotérmicos se emplean en la denominada absorción atómica sin llama. El

más utilizado es el horno de grafito, que consiste en una cavidad de grafito con dos electrodos que

proporcionan la corriente eléctrica para el calentamiento. Por el interior de la cámara circula agua, para

enfriarla rápidamente después de la atomización. El espécimen (sólido o líquido) se coloca en la

cámara e inicialmente se produce un calentamiento de alrededor de 1500 ºC para eliminar el disolvente

y destruir la matriz (calcinación) y posteriormente, se aumenta la temperatura hasta alrededor de 3000

°C para producir la atomización. Los límites de detección son mucho más bajos.

La espectrometría de absorción atómica se emplea para la medida de la concentración de metalesen los fluidos biológicos. Los principales metales que se miden son: aluminio, arsénico, bario, cadmio,

calcio, cobre, cromo, hierro, litio, magnesio, manganeso, mercurio, níquel, plata, platino, plomo,

selenio.

7. Osmometria. C romatografia. E lectroforesis. T écnicas e lectroouimicas

La osmometría es una técnica que se utiliza para medir la concentración de sustancias, en

general, en las disoluciones. La cromatografía utiliza para la separación la distribución de las sustancias

entre dos fases, una móvil y otra estacionaria, mientras que la electroforesis utiliza la diferentevelocidad de migración de las sustancias cargadas. Las técnicas electroquímicas son técnicas de medida

basadas en procesos de oxidación-reducción.

7.1. Osmometria Las propiedades coligativas de las disoluciones son las relacionadas con el número total de

partículas de soluto por masa de disolvente. Las propiedades coligativas son la presión osmótica, la

presión de vapor, el punto de congelación y el punto de ebullición.




La osmometría es una técnica que se utiliza para medir la concentración de moléculas e iones, en

general, en una disolución, no de determinados iones o meléculas en particular. La osmolalidad de

una disolución es el número de moles de partículas por kilogramo de agua. La osmolalidad de una

disolución puede determinarse midiendo cualquier propiedad coligativa. Se utilizan el descenso del punto de congelación y el descenso de la presión de vapor. El aumento de la osmolalidad de una

disolución produce un aumento de la presión osmótica y en el punto de ebullición; un descenso del

punto de congelación, un descenso de la presión de vapor.

Los osmómetros que emplean la medida del descenso del punto de congelación constan de un

baño de enfriamiento para congelar el espécimen y un dispositivo que mide la temperatura a la que se

produce la congelación. Cada mol de partículas disueltas por kilogramo, produce un descenso e 1,86

°C de la temperatura de congelación. De esta forma, la osmolalidad viene dada por la fórmula:

Osmolalidad = disminución del punto de c ongelación / 1.86 °C

El resultado que se obtiene en osmoles se multiplica por 1000 para dar miliosmoles, que es la

unidad más empleada.

7.2. Cromatografía La cromatografía es una técnica de separación que se fundamenta en la distribución de las

sustancias en dos fases, una móvil y otra estacionaria. Puede clasificarse de acuerdo con: (1) la

interacción de las sustancias que se separan con la fase estacionaria: adsorción, reparto, cambio de ión,

exclusión y afinidad. Con frecuencia, en algunos métodos cromatográficos de separación coexisten

dos o más tipos de interacciones entre la fase móvil y la fase estacionaria; (2) en función del tipo de

fase móvil se distingue entre Cromatografía de Gases y Cromatografía Líquida.

7.2.1. En f unción d el t ipo d e i nteracción e ntre a nalito y f ase e stacionaria

7.2.1.1. Cromatografía d e a dsorción

La cromatografía de adsorción fue el primer tipo de cromatografía utilizada. Esta técnica retienelos solutos por adsorción superficial en la que las principales interacciones entre las moléculas y los

adsorbentes son las electrostáticas, los puentes de hidrógeno y las dispersivas. La forma más general

de cromatografia de adsorción se realiza en una columna que se llena de adsorbente adecuado. Las

sustancias que quieren separarse se colocan en la parte superior de la columna y al pasar por ésta va

siendo retenidas por el adsorbente. La elución de las sustancias retenidas se realiza utilizando

disolventes en los que sean solubles y que también interactúen con el adsorbente.

La cromatografía de adsorción se utiliza muy poco en los laboratorios de química clínica.

Después de la separación en las columnas se cuantifica por espectrometría o por fluorimetría.




7.2.1.2. Cromatografía d e r eparto

La cromatografía de reparto consigue la separación de sustancias tomando como base su

diferente distribución entre dos fases líquidas inmiscibles (solubilidad). Puede realizarse en papel, capa

fina, o columna. El coeficiente de reparto (R f ) es un valor característico de cada sustancia en cada sistema de separación.

La cromatografía en papel es una técnica de reparte líquido-líquido en la que el agua retenida

entre las fibras de celulosa actúa como fase estacionaria (polar), mientras que la fase móvil (menos

polar) es una mezcla de disolventes orgánicos y acuosos. La cromatografía en papel se ha utilizado en

los laboratorios de química clínica para la separación de aminoácidos, azúcares y otras sustancias de

peso molecular bajo. Debido a sus tiempos de desarrollo largos, en la actualidad no se emplea.

La cromatografía en capa fina es una técnica de reparto líquido-líquido, en la que resultan muy importantes las interacciones por adsorción. Utiliza como soportes gel de sílice, celulosa, poliaminas,

gel de óxido de aluminio, etc. Los geles se extienden sobre una placa rígida de vidrio, plástico o

aluminio, formando una capa fina cuyo espesor puede ajustarse a la conveniencia. La cromat. en capa

fina es más rápida y sensible que la cromat. en papel. Se utiliza para la separación de lípidos,

esteroides, aminoácidos, azúcares y en general, para la separación de sustancias de peso molecular

bajo.

7.2.1.3. Cromatografía d e c ambio i ónico La cromat. de cambio iónico separa las sust. tomando como base las interacciones electrostáticas

que se producen entre os grupos ionizables de los compuestos que quieren separarse, y los grupos

cargados unidos a un soporte sólido. Los cambiadores iónicos son sustancias insolubles que cotienen

grupos cargados con iones móviles de signo contrario, que neutralizan los grupos fijos. Estos iones

móviles o contraiones pueden intercambiarse de manera reversible con otros iones de la misma carga.

Los cambiadores pueden ser catiónicos si intercambian iones del medio con carga positiva, o

aniónicos si intercambian iones negativos. Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. Los grupos fenólicos, carboxílicos y sulfónicos se utilizan como

cambiadores aniónicos. Los grupos sulfónicos y amino cuaternarios son cambiadores fuertes, mientras

que los otros grupos mencionados lo son débiles.

El mecanismo por el que se produce la separación en la cromatografia de cambio de ión es la

unión reversible de los compuestos a los cambiadores que, de forma esquemática, está explicado en la

Figura 3-1. En primer lugar, se añade el espécimen sobre la columna que contiene el cambiador. Las

sustancias quedan más o menos retenidas, dependiendo de las interacciones de sus grupos ionizables

con el cambiador. Las sustancias que han quedado unidas se separan pasando a través de la columna




un tampón o amortiguador en el que se modifica el pH, la fuerza iónica o ambos, respecto del tampón

en el que se aplicó el espécimen. Finalmente, se regenera la columna pasando contraiones del

cambiador, de forma que queda dispuesta para utilizarse de nuevo.

La cromatografía de cambio de ión se aplica en bioquímica para la separación de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y, en general, para todos los compuestos que tengan naturaleza

iónica. En el laboratorio clínico, además de utilizarse en los analizadores de aminoácidos, se usa para la

separación de hemoglobinas, isoenzimas, esteroides y otras sustancias cargadas de interés clínico.

7.2.1.4. Cromatografia d e e xclusión

La cromatografía de exclusión, antes denominada filtración en geles, es una técnica que separa

las moléculas en función de su tamaño y de su forma. La fase estacionaria es un gel, polímero anhidro

muy hidrófilo, que se hincha cuando se sumerge en agua o en soluciones electrolíticas. Esta

cromatografía se realiza en columna y la elución o salida de las sustancias es independiente del

eluyente, o fase móvil utilizada, de su pH y de su fuerza iónica y, como se ha indicado antes, sólo es

función de la forma y del tamaño de las sustancias y de los poros del gel.

El mecanismo de separación de la cromatografia de exclusión está representado en la Figura 3-2.

El espécimen se aplica sobre el lecho del gel y al pasar a través de la columna las moléculas mayores

que el diámetro máximo de los poros de los geles pasan por los espacios que dejan entre sí los granos

del gel y salen pronto, mientras que las moléculas menores quedan retenidas en los granos de éste.Cuanto menores sean las moléculas, más tardan en salir de la red porosa y, por tanto, eluyen más

tarde. De esta forma en la cromatografía de exclusión la elución se produce en orden decreciente de

tamaño molecular. La separación de diferentes moléculas de una mezcla en la cromatografía de

exclusión viene dada por el espacio recorrido y la resolución es, por tanto, función de la longitud de la

columna y del tamaño de las partículas del gel. El diámetro de la columna sólo determina la cantidad

de espécimen que puede aplicarse.

La cromatografla de exclusión se aplica fundamentalmente a la separación de sustancias de peso

molecular elevado, como péptidos, proteinas, ácidos nucleicos, polisacáridos y otros compuestos de

interés biológico. En los laboratorios clínicos, la cromatografía de exclusión se usa para purificaciones

en técnicas hormonales.

7.2.1.5. Cromatografia d e a finidad

La cromatografía de afinidad utiliza para la separación interacciones biológicas altamente

específicas, como las interacciones enzima-sustrato antígeno-anticuerpo y hormona-receptor. La fase

estacionaria se prepara inmovilizando el ligando sobre el soporte sólido, bien directamente oempleando un brazo espaciador. Para realizar la cromatografla se añade la mezcla, que contiene la




sustancia que se quiere separar, al ligando inmobilizado, generalmente contenido en una columna

cromatográfica. aunque también puede encontrarse en disolución. El compuesto que se quiere separar

se une al ligando y el resto de las sustancias se eliminan mediante lavado. La separación o elución de la

sustancia que se quiere separar se consigue, alterando las condiciones experimentales por variacióndel pH o de la fuerza iónica, pasando un ligando distinto al anclado en la columna por el que tenga

mayor afinidad la sustancia. La cromatografía de afinidad se emplea en los laboratorios de bioquímica

clínica para la separación de glicohemoglobina y catecolaminas.

7.2.2. En f unción d el t ipo d e f ase m óvil

7.2.2.1. Cromatografia d e g ases

La cromatografia de gases es una técnica de reparto líquido-gas, que se realiza en una columna

rellena sólido finamente dividido que actúa como soporte. La fase estacionaria está formada por un

líquido no volátil que impregna el soporte, y la fase móvil en un gas inerte que fluye por la columna a

velocidad constante. La separación por cromatografia de gases requiere que los solutos sean volátiles.

Muchos compuestos de interés clínico no son volátiles, de forma que deben modificarse

químicamente por un proceso denornmaao derivatización. Se suele aumentar la volatilidad

transformando los grupos funcionales polares (hidroxilo, amino, cetona) en grupos no polares

(trimetilsilil, monoxima).

El espécimen volátil se disuelve en un disolvente ,orgánico adecuado; los más utilizados son la acetona, el hexano y el acetato de etilo. Se introduce el espécimen con una microjeringa en un bloque

con una temperatura elevada. Se produce la evaporación de los componentes de la mezcla que son

arrastrados por el flujo del gas. Los productos volátiles se separan en la columna según su reparto

entre la fase líquida estacionaria y la fase gaseosa móvil. Los productos separados se detectan a la salida

de la columna. Los principales detectores son los de conductividad térmica, los de ionización de llama

(FID), los de fotoionización, los termoiónicos selectivos, los de nitrogeno/fósforo (NPD) y los de

captura electrónica. La señal generada se comunica a un registro que lleva acoplado un integrador para

la medida del área de los picos correspondientes a cada una e las sustancias separadas.

Las principales aplicaciones de la cromatografia de gases en los laboratorios clínicos son la

cuantificación de ácidos orgánicos en orina, la determinación de fármacos en orina, la determinación

de monóxido de carbono en sangre, etc. Los cromatógrafos de gases pueden acoplarse a

espectómetros de masas, para combinar el poder de resolución de la cromatografia de gases con la

gran especificidad v sensibilidad de la espectrometría de masa. En los laboratorios clínicos, esta

combinación se usa principalmente para el análisis de drogas en medicina del deporte (control

antidoping).




7.2.2.2. Cromatografía l íquida d e a lta e ficacia

La cromatografla en columna puede utilizar los cinco tipos de interacción entre la fase móvil y la

fase estacionaria que se han señalado previamente, aunque la más utilizada es la cromatografía de

reparto. La separación en columna (se ha realizado hasta hace unos años utilizando el flujo gravitatoriocomo fuerza impulsora de la fase móvil, lo que lleva tiempos de separación largos. La construcción de

sistemas impulsores de la fase móvil de presión elevada, así como la obtención de rellenos de las

columnas de gran eficacia de actuación, ha permitido tiempos cortos de separación y una gran

selectividad. La cromatografla que emplea estos métodos se denomina HPLC (high performance

liquid chromatography: cromatografía líquida de alta eficacia). Un cromatógrafo de HPLC está

originado por los siguientes componentes (Fig. 3-3):

1.

Reservorio de fase móvil.2. Bomba impulsara.

3. Inyector

4. Columna

5. Detector

6. Registro

7. Ordenador

La bomba de los cromatógrafos líquidos puede actuar de modo isocrático o de modo gradiente,

En el modo isocrático la composición de la fase móvil permanece constante durante todo el proceso,

mientras que en el modo gradiente, la composición de la fase móvil va cambiando durante la

cromatografia. Se utiliza un gran número de detectores diferentes a la salida de la columna. Los más

empleados son los espectrómetros visible y UV, y los fluorímetros y detectores electroquímicos.

En la cromatografia de reparto líquido-líquido, las superficies de un sólido se recubren con unlíquido (fase estacionaria) inmiscible con el líquido que constituye la fase móvil. La separación se

produce por la distribución relativa o reparto de los componentes entre la fase móvil y la fase

estacionaria. Las fases líquidas estacionarias son generalmente polares, mientras que las fases móviles

son no polares. Los líquidos estacionarios más usados son el agua y el etilenglicol, y las fases móviles

más típicas, el hexano, el metanol y las mezclas hexano/isopropanol. Esta combinación de fase

estacionaria polar y fase móvil no polar se denomina cromatografía líquida en fase normal. Cuando la

fase estacionaria es no polar, como un hidrocarburo, y se utilizan como fase móvil sistemas acuosos, la

cromatografía se denomina en fase inversa.




Las principales aplicaciones clínicas de esta cromatografía son la separación de aminoácidos de

suero y orina, la cuantificación de fármacos en suero y orina, la separación de catecolaminas en fluidos

biológicos y la cuantificación de glicohemoglobina.

7.3. Electroforesis La electroforesis es el transporte de partículas cargadas en un campo eléctrico. Es una técnica de

separación, en la que las partículas cargadas se separan por su velocidad de migración diferente al

aplicar un campo eléctrico. La electroforesis se utiliza para separar compuestos con carga meta, como

aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos. La movilidad electroforética de una

molécula depende directamente del tamaño de la molécula, del coeficiente de fricción, que a su vez

depende directamente del tamaño de la molécula, de su forma y de la viscosidad del medio. La

migración de las partículas es dependiente del pH del medio en que se encuentran, ya que su carga neta depende del pH. Se produce la separación en distintas bandas.

El tampón en la electroforesis ejerce dos funciones: por un lado, lleva la carga eléctrica, y por

otro, determina la carga neta de las moléculas que se separan y, de esta forma, la dirección de la

migración electroforética. La fuerza iónica del tampón determina la anchura de la nube iónica que

rodea las moléculas cargadas. Cuanto mayor es la fuerza iónica, más estrechas son las bandas de

separación. Sin embargo, la fuerza iónica elevada produce un mayor calentamiento y la posible

desnaturalización de las sustancias que van a separarse, de forma que hay que llegar a una solución de

compromiso.

Aunque existen diversos tipos de electroforesis, en Qª clínica distinguimos fundamentalmente

entre tres de ellas:

7.3.1. Electroforesis d e z ona

Los principales soportes planos para electroforesis son el papel, las membranas de acetato de

celulosa, los geles de agar, agarosa, almidón y poliacrilamida). El papel de filtro fue el primer soporte

que se empleó para la electroforesis de zona, pero en la actualidad ya no se emplea.

Electroforesis en acetato de celulosa

La muestra se aplica sobre el soporte electroforético y a continuación se adiciona un tampón y se

aplica una corriente eléctrica. Una vez separados los componentes, normalmente se tiñen las

diferentes bandas con un colorante adecuado, la cuantificación se puede realizar: (1) cortar las bandas

teñidas y eluir el colorante, el cual se mide espectrofotométricamente; ó (2) densitométricamente, que

es más frecuente.




Las membranas de acetato de celulosa presentan, con relación al papel, las ventajas de ser

químicamente más homogéneas y poder transparentarse, con lo que las sustancias que se separan

pueden cuantificarse, una vez teñidas o reveladas, por densitometría de transparencia. Las membranas

de acetato de celulosa son muy elásticas cuando están húmedas, y frágiles y quebradizas cuando estánsecas. Las membranas de acetato de celulosa requieren una cantidad de espécimen mucho menor que

el papel, del orden de 1 a 2 µl.

Las membranas de acetato de celulosa se utilizan mucho en los laboratorios clínicos por su fácil

manipulación y la rapidez de sus desarrollos electroforéticos. Su aplicación principal es para separar las

proteínas del suero, lo que se denomina un proteinograma. La electroforesis en acetato de celulosa

separa las proteínas del suero en cinco fracciones, que son la albúmina y las globulinas. El Cuadro 3-1

muestra los porcentajes y las concentraciones de referencia de cada una de las fracciones, y en la

Figura 3-4 se presenta un esquema de una separación de las proteínas del suero en tiras de acetato de

celulosa, y la lectura densitométrica correspondiente. La electroforesis en acetato de celulosa se ha

aplicado también para la separación de lipoproteínas e isoenzimas del suero.

Electroforesis en gel

Los geles de agarosa, almidón y poliacrilamida no son sólo meros soportes que evitan la

difusión, sino que, modificando las concentraciones de los componentes que forman el gel, pueden

conseguirse diferentes porosidades y la separación se produce además de por diferencias de carga,

por diferencias de tamaño.

El poro del gel puede variarse hasta el tamaño adecuado modificando la concentración de

almidón. El principal problema de los geles de almidón proviene de su preparación engorrosa. Los

geles de poliacrilamida se forman por la polimerización del monómero acrilamida (CH2=CH-CO-

NH2) y el comonómero de entrecruzamiento N,N'-metilén-bisacrilamida (CH2=CH-CO-NH-CH2-

NH-CO-CH=CH2). Variando las concentraciones del monómero y del comonómero de

entrecruzamiento, se consiguen geles de poliacrilamida con un nivel amplio de tamaño de poro, que

puede ajustarse para optimizar la separación de los componentes del espécimen. La electroforesis en

gel se aplica en los laboratorios clínicos para la separación de proteínas, lipoproteínas e isoenzimas.

7.3.2. E nfoque i soeléctrico

Se trata de una técnica de separación electroforética que hace migrar a los compuestos

anfotéricos, como las proteínas, en un medio con un gradiente estable de pH. Las moléculas se

mueven hasta la zona en la que el pH es igual a su punto isoeléctrico. A este pH, la carga neta es cero y

la molécula detiene su migración. El gradiente de pH se crea por medio de unas sustancias

denominadas anfolitos, que son ácidos poliaminocarboxílicos con pesos moleculares comprendidos




entre 300 y 1000 dalton. El enfoque isoeléctrico puede realizarse en gel de poliacrilamida, gel de

agarosa o membranas de acetato de celulosa. La técnica de enfoque isoeléctrico posee un gran poder

de resolución y se utiliza, fundamentalmente, con fines analíticos.

7.3.3. Electroforesis c apilar

La electroforesis capilar es una técnica en la que la electroforesis de zona se realiza en capilares

de 75 µm de diámetro interno y de 25 cm de longitud. El capilar, relleno de disolución tampón, se

conecta a un detector en un extremo y a una fuente de corriente a través de reservorios con un

tampón. Las principales ventajas de los tubos de un diámetro tan pequeño son una mayor disipación

del calor, un menor volumen de espécimen y una menor anchura de las zonas de separación. La gran

disipación de calor permite aplicar voltajes elevados, del orden de 5000 voltios, con los que se mejora

la eficacia de la separación y se reduce el tiempo de separación. La electroforesis capilar se aplica en loslaboratorios clínicos para la separación de proteínas en fluidos biológicos, principalmente el suero.

8. Técnicas e lectroquímlcas

Las técnicas electroquímicas se basan en procesos de oxidación-reducción o redox, aquellos en

los que se producen intercambIos de electrones. Entre las técnicas electroquímicas utilizadas en los

laboratorios clínicos se encuentran los métodos potenciométricos, los amperométricos y los

culombimétricos.

8.1. Métodos p otenciométricos

Los métodos potenciométricos miden la actividad de los iones, que está relacionada con la

concentración por un factor, denominado coeficiente de actividad, a ¡ = f i · c ¡ . Los coeficientes de

actividad, cuyo valor es en todos los casos menor de 1, dependen de la fuerza iónica de la solución.

Las diferencias de potencial se miden por medio de electrodos. Los más utilizados en las

actualidad son los electrodos selectivos de iones.

Electrodos metálicos

Los electrodos metálicos están formados por un metal inmerso en una solución que contiene

sus iones. Cuando el metal es inestable en forma pura, se utiliza una amalgama del metal. Entre los

electrodos metálicos se encuentra el electrodo de calomelanos, formado por mercurio, cubierto de

cloruro mercurioso, en contacto con una disolución electrolítica que contiene cloruro. Este electrodo

se utiliza como electrodo de referencia.




Electrodos selectivos a los iones

Los principales tipos de electrodos selectivos a los iones son los electrodos de vidrio, de estado

sólido y los de cambio de ión. Los electrodos de vidrio están construidos con vidrios especiales

permeables a diversos iones como H+

, Na +

, K +

, Li+

, Rb+

, Cs+

, Ag+

, etc. Los electrodos de estado sólidoestán construidos con membranas formadas por cristales homogéneos o membranas formadas por

una sustancia activa embebida en una matriz inerte. Los cristales homogéneos o la matriz inerte

contienen una sal poco soluble del anión que quiere determinarse. Se han construido electrodos con

cristales homogéneos para la medida de F - (cristal de fluoruro de lantano), Cl- (cristal de cloruro de

plata), Br - (cristal de bromuro de plata), etc. Los electrodos de cambio de ión están construidos con

membranas que llevan incluido un transportador selectivo para un ión disuelto en un disolvente

inerte, donde tanto el transportador como el disolvente son insolubles en agua.

En la actualidad, en los laboratorios clínicos se emplean electrodos selectivos a los iones para la

determinación de Na +, K + y Cl- . Estos electrodos pueden formar parte de un analizador automático

para bioquímica clínica o estar incluidos en un sistema dedicado sólo a las determinaciones iónicas.

Asimismo se emplea un electrodo selectivo de iones, modificado para la determinación de la presión

de C02 en sangre, denominado electrodo de Severinghaus.

El electrodo de CO2 consta de un electrodo de vidrio de pH sumergido en una disolución de

bicarbonato de concentración fija (5 mM), que encuentra separada del teflón permeable a las moléculas

de CO2 . La membrana (nylon) permite que pasen a su través moléculas sin carga eléctrica, como CO2 ,

e impide que lo hagan las moléculas cargadas.

Entre la disolución y el vidrio sensible a los H+ del electrodo de medida se encuentra un

espaciador de nylon o celofán. El electrolito contacta también con el electrodo de referencia de

Ag/AgCl. El C02 disuelto en la sangre difunde desde el espécimen a través de la membrana y

produce un cambio de pH de la disolución de bicarbonato, de acuerdo con los equilibrios:

H2O + CO2 lH2CO3 lH+ + HCO3-

Las variaciones de CO2 producen variaciones de H+ en la disolución electrolítica y, como

consecuencia, la diferencia de potencial eléctrico del electrodo es función de la P de CO2 .

8.2. Métodos a mperométricos

Los métodos amperométricos se basan en la media de la intensidad de corriente que pasa por

una célula electroquímica cuando se aplica un potencial constante entre los electrodos. En los

laboratorios clínicos la amperometría se utiliza para la medida de la presión de oxígeno mediante el

denominado electrodo de Clark (figura 3-6). Este consta de una célula electroquímica con un cátodode platino y un ánodo de Ag/ClAg sumergido en una disolución de cloruro potásico y tampón




fosfato. Este conjunto se encuentra separado del espécimen por una membrana de polipropeno,

permeable a las moléculas de O2 . El cátodo de platino tiene aplicada una corriente eléctrica de

polarización de -630 mV, que es el potencial del par O2 /H2 O. A este potencial específico, sólo se

reducen las moléculas de O2 , lo que crea una corriente de electrones proporcional a la cantidad de moléculas presentes, de acuerdo con la reacción:

O2 + H2 O + 4e- l 4 OH-

½ O2 + 2H+ + 2e- l H2 O

Los electrones provienen del ánodo de Ag/AgCl, de acuerdo con la reacción:

Ag lAg+ + 1e-

Cuando no hay oxigeno, la corriente entre los electrodos es cero, pero cuando hay oxígeno enel espécimen se produce la difusión a través de la membrana y llega hasta el cátodo, donde se reduce

y se forma OH- . Siempre que el pH de la disolución interna permanezca constante, la corriente

producida entre el cátodo de platino y el ánodo de Ag/CIAg es proporcional a la presión de oxígeno

del espécimen.

8.3. Métodos c ulombimétricos

Los métodos culombimétricos se basan en la medida de la carga, total necesaria para la oxidación

o reducción de una especie. La principal aplicación de los métodos culombimétricos en loslaboratorios clínicos ha sido la determinación de cloruro en fluidos biológicos. En la actualidad este

método se ha abandonado.




TEMA 3: Técnicas analíticas más frecuentes utilizadas en Química clínica (II)

A) Técnicas inmunoquímicas

a. Conceptos generales

b. Producción de antisueros y anticuerpos monoclonales

c. Técnicas de aglutinación

d. Reacciones de inmunoprecipitación

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