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FOTOESTABILIDAD DE DOS FORMULACIONES DE BIOPLAGUICIDAS A BASE DE Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003

ZAIRA PATRICIA PEÑA DIAZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito para optar al título de

Microbióloga Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ, D.C. 2011

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NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

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FOTOESTABILIDAD DE DOS FORMULACIONES DE BIOPLAGUICIDAS A BASE DE Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003

ZAIRA PATRICIA PEÑA DIAZ

APROBADO

________________________________ ___________________________ Martha Isabel Goméz Ph.D . Laura Fernanda Villamizar Ph.D Directora Codirectora ________________________ María Ximena Rodríguez Jurado _____________________ ___________________ Ingrid Schuler Ph.D. Janeth Arias M.Sc, M.Ed. Decana Académica Directora de Carrera

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A Dios y mi familia por su amor

y apoyo incondicional.

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AGRADECIMIENTOS A la Doctora Martha Isabel Gómez, Química Farmacéutica Ph.D. Investigadora del Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA, por su inmensa colaboración, enseñanza, paciencia, dedicación, apoyo incondicional y orientación en el desarrollo de este trabajo y por su contribución en mi formación profesional. A la Doctora Laura Fernanda Villamizar, Química Farmacéutica Ph.D. Investigadora del Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA, por toda su colaboración, enseñanza, dedicación y apoyo incondicional y por su contribución en mi formación profesional. A la Doctora Alba Marina Cotes, por darme la oportunidad de hacer parte de su excelente grupo de investigación durante este periodo. A los investigadores del Laboratorio de Control Biológico por aportes a este trabajo.

A los estudiantes y auxiliares del Laboratorio de Control Biológico por su cooperación, apoyo incondicional y amabilidad.

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TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 13 2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................... 14 3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................. 15

3.1. Trichoderma spp. ........................................................................................................ 15 3.1.1. Clasificación taxonómica de Trichoderma koningiopsis ....................................... 15 3.1.2. Mecanismo de acción .......................................................................................... 15 3.2. Lecanicillium lecanii ..................................................................................................... 15

3.2.1. Clasificación taxonómica de Lecanicillium lecanii ................................................ 16 3.2.2. Mecanismo de acción ........................................................................................... 16 3.3. Bioplaguicidas microbianos ......................................................................................... 16

3.3.1. Tipos de formulación de bioplaguicidas ............................................................... 16 3.3.1.1. Formulaciones líquidas......... ....................................................................... 16

3.3.1.2. Formulaciones sólidas ………………………………………………………..…17

3.4. Efectos de la radiación UV………………………..……………………………………......17

3.5. Protectores solares…………………………………..……………………………………...18

3.5.1. Filtros solares químicos o absorbentes………………………………………………18

3.5.2. Filtros solares físicos……………………………………………………….……...…..19

4. OBJETIVO ............................................................................................................................... 19 5. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 19

5.1. Microorganismos ......................................................................................................... 19 5.2. Producción masiva y formulación ................................................................................ 19 5.3. Control de calidad de las formulaciones de Lecanicillium lecanii Vl026 y

Trichoderma koningiopsis Th003 .......................................................................................... 20 5.4. Estudio de fotoestabilidad ........................................................................................... 20 5.5. Análisis estadístico ...................................................................................................... 21

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................... 21 6.1. Control de calidad de los conidios formulados y sin formular Lecanicillium lecanii

Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 ........................................................................... 21 6.2. Estudio de Fotoestabilidad .......................................................................................... 22

6.2.1. Fotoestabilidad de Lecanicillium lecanii Vl026..……………………………………..22

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6.2.2. Fotoestabilidad de Trichoderma koningiopsis Th003 ………..……………………..24

6.2.3. Fotoestabilidad de los conidios sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 ………………………………………………………….......25

6.2.4. Fotoestabilidad de los conidios formulados y reconstituidos en agua y formulados suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 …………………………………………...……………………..…...26

6.3. Presencia de micelio y esporas ................................................................................... 27 7. CONCLUSIONES .................................................................................................................. 28 8. RECOMENDACIONES ......................................................................................................... 28 9. LITERATURA CITADA ......................................................................................................... 29 10. ANEXOS .............................................................................................................................. 33

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ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Características microbiológicas promedio de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003.……………………………………………………………………………………………...21

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 a. Producción masiva de Lecanicillium lecanii Vl026 mediante fermentación sólida. b. Producción masiva de Trichoderma koningiopsis Th003 mediante fermentación sólida.……………………………………………………………………………………………...20

Figura 2 a. Conidios sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 después de ser expuestos a 90min de radiación solar simulada b. Conidios formulados de Lecanicillium lecanii Vl026 (WG) después de ser expuestos a radiación solar simulada por 90 minutos.…………………………………………………………………………………….…......23

Figura 3. Efecto de la radiación solar simulada sobre la germinación de los conidios de Lecanicillium lecanii Vl026 formulados y sin formular……………………………….………23

Figura 4 a. Conidios sin formular de Trichoderma koningiopsis Th003 después de ser expuestos a 90 min de radiación solar simulada b. Conidios formulados de Trichoderma koningiopsis Th003 (WP) después de ser expuestos a radiación solar simulada por 90 minutos………………………………………………………………………………………..……24

Figura 5. Efecto de la radiación solar simulada sobre la germinación de de los conidios de Trichoderma koningiopsis Th003 formulados y sin formular…………………………………25

Figura 6. Susceptibilidad de los conidios sin formular de L. lecanii Vl026 y T. koningiopsis Th003 frente a la radiación solar simulada…………………………………………………….26

Figura 7. Fotoestabilidad de los conidios formulados de L. lecanii Vl026 WG y T. koningiopsis Th003 WP. a. Reconstituido en agua. b. suspendidos en aceite y reconstituidos en agua…………………………………………………………………………..27

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ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Resultados del control de calidad de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003………………………………………………………………………………………………33

Anexo 2. Resultados de la germinación de conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 a 0, 30, 60 y 90 minutos de exposición a radiación solar simulada……………………………………………………….34

Anexo 3. Resultados cualitativos de presencia o ausencia de micelio y esporas de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026…………………………35

Anexo 4. Resultados cualitativos de presencia o ausencia de micelio y esporas de los conidios formulados y sin formular de Trichoderma koningiopsis Th003…………………37

Anexo 5. Análisis estadístico de la germinación de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 sin exposición a radiación solar simulada………………………………………………………………………..39

Anexo 6. Análisis estadístico de la germinación de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026………………………………………………………………...…40

Anexo 7. Análisis estadístico de la germinación de los conidios formulados y sin formular de Trichoderma koningiopsis Th003………………………………………………………...….43

Anexo 8. Análisis estadístico de la germinación de los conidios sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003……………………………..46

Anexo 9. Análisis estadístico de la germinación de los conidios formulados y reconstituidos en agua de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003……………………………………………………………………………………………..48

Anexo 10. Análisis estadístico de la germinación de los conidios formulados, suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003………………………………………………………………………………50 

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RESUMEN

Los cultivos de algodón, tomate y lechuga son de alta importancia económica a nivel mundial y se ven afectados por diversas plagas entre las que se encuentran las moscas blancas Bemicia tabaci y Trialeurodes vaporariorum en cultivos de algodón y tomate y patógenos como Sclerotinia minor, Sclertotinia sclerotiorum y Rhizoctonia solani en cultivos de lechuga. El control de estas plagas se ha hecho en su mayoría con plaguicidas químicos que tiene impactos en salud humana y en el medio ambiente. Sin embargo actualmente se ha incrementado el uso de plaguicidas biológicos a base de hongos para el control de estas plagas. Los microorganismos que son usados como principio activo de los bioplaguicidas se ven afectados por factores abióticos como temperatura, pH, humedad y radiación UV del sol, siendo este último el factor más deletéreo pues causa daños directos e indirectos sobre macromoléculas. En este sentido, el Laboratorio de Control Biológico de CORPOICA desarrolló un bioplaguicida a base del hongo entomopatógeno Lecanicillium lecanii Vl026 para el control de moscas blancas y otro a base de Trichoderma koningiopsis Th003 para el control de Sclerotinia sp., los cuales incluyen protectores solares en su formulación. Teniendo en cuenta lo anterior el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la fotoestabilidad de estas dos formuláciones y dos tipos de reconstitución (en agua y en aceite y agua) frente la radiación solar simulada. Para esto se expusieron los conidios formulados y sin formular de los dos hongos a radiación solar simulada durante 0, 30, 60 y 90 minutos y se midió su germinación. Los resultados demostraron que los dos hongos presentaron una disminución gradual de la germinación a medida que aumentó el tiempo de exposición. Sin embargo, los conidios sin formular de Lecanicillium lecanii fueron más susceptibles que los formulados llegado a una inactivación del 59% pasados 90 minutos de exposición, frente a una inactivación del 37% de los conidios formulados. Lo mismo sucedió con Trichoderma koningiopsis pues se obtuvo una inactivación de los conidios sin formular del 51% frente a una inactivación del 36% de los conidios formulados. El tipo de reconstitución no mejoró la fotoestabilidad pero la formulación de los dos hongos demostró un efecto protector de los conidios manteniendo su germinación.

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ABSTRACT

The cotton, tomato and lettuce are high economic importance worldwide and are affected by various pests among which are whiteflies Bemicia tabaci and Trialeurodes vaporariorum in cotton and tomato crops and pathogens such as Sclerotinia minor, Sclertotinia sclerotiorum and Rhizoctonia solani on lettuce crops. Control of these pests is made mostly with chemical pesticides that have impacts on human health and the environment. But actually increased pesticide use based fungal biological control of these pests. The microorganisms that are used as active of biopesticides are affected by abiotic factors such as temperature, pH, moisture and UV radiation from the sun, the latter being the most deleterious factor for direct and indirect damages of macromolecules. In this sense, the Biological Control Laboratory COROPICA developed a biopesticide based on entomopathogenic fungus for control of whiteflies Lecanicillium lecanii Vl026 and other based on Trichoderma koningiopsis Th003 to control Sclerotinia sp., Which include sunscreens formulation. Considering the above, the present study aimed to determine the photostability of these two formulations and two types of reconstitution (in water and oil and water) versus simulated solar radiation. Therefore, formulated and unformulated fungi conidia were exposed to simulated solar radiation for 0, 30, 60 and 90 minutes and germination was measured. The results showed that the two fungi showed a gradual decrease with increasing germination exposure time. However, unformulated conidia of Lecanicillium lecanii were more susceptible than those made inactivation reached 59% after 90 minutes exposure, compared to a 37% inactivation of conidia formulated. So did Trichoderma koningiopsis was obtained for inactivation of unformulated conidia of 51% versus 36% inactivation of conidia formulated. The type of reconstruction did not improve the photostability but the wording of the two fungi showed a protective effect of keeping conidia germination. 

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1. INTRODUCCIÓN Entre los cultivos de mayor importancia económica en Colombia se encuentran el algodón, el tomate y la lechuga. El algodón con una producción anual de 111.107 toneladas (Ton) y un rendimiento de 2.304 Kg/Ha (1); el tomate con una producción de 32,7 Ton/Ha (2) y la lechuga con un rendimiento promedio de 18,32 Ton/Ha en la sabana de Bogotá (3).

El algodón y el tomate se ven afectados por las moscas blancas Bemicia tabaci (Hemiptera/Aleyrodidae) y Trialeurodes vaporariorum (4), principalmente en los departamentos de Tolima, Cundinamarca, Santander y Cesar, con pérdidas que oscilan entre el 25% y el 100% (5).

El control y manejo de esta plaga se ha hecho por medio de plaguicidas químicos, siendo el método más utilizado y a veces el único (6), generando problemas de resistencia e impacto negativo en el medio ambiente y en la salud humana (7). Una alternativa promisoria es el uso de plaguicidas microbianos a base de hongos entomopatógenos como Lecanicillium lecanii, Beauveria bassiana y Paecilomyces fumosoroseus, entre otros (8).

En cuanto a los cultivos de lechuga (Lactuca sativa) y tomate, éstos son afectados por diversos patógenos siendo las especies Sclerotinia minor, Sclertotinia sclerotiorum y Rhizoctonia solani los hongos que ocasionan las mayores pérdidas económicas (9). En este sentido el uso de agentes de control biológico constituye un método eficaz para el control de fitopatógenos, siendo Trichoderma el género de hongos controladores más usado a nivel mundial (10).

Dentro de los factores limitantes que afectan a los plaguicidas microbianos se encuentra la exposición a altas temperaturas, a valores de pH extremo y a la radiación ultravioleta del sol (11), que causa una muy rápida inactivación de los microorganismos (12).

La radiación UV tiene diferentes efectos negativos en la viabilidad de los hongos biocontroladores (13), ya que induce efectos deletéreos en las células como consecuencia de su acción sobre porfirinas, carotenoides, esteroides, quinonas, proteínas y ácidos nucleicos (14). Estudios sobre la persistencia de bioplaguicidas microbianos revelan que la radiación solar es el más destructivo de los factores ambientales a los que se ven expuestos los bioplaguicidas microbianos (15).

En este sentido, muchas formulaciones de bioplaguicidas microbianos incluyen adyuvantes que actúan como protectores solares, dentro de los que se encuentran, los filtros solares que absorben selectivamente la radiación UV incidente. Otros protectores solares pueden dispersar o reflejar la radiación (pantallas solares), entre los que se destacan el óxido de zinc (ZnO) y el dióxido de titanio (TiO2) (16).

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2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporarium son plagas ampliamente distribuidas en regiones tropicales y subtropicales del mundo, donde causan importantes pérdidas en más de 500 especies de plantas como el tomate, el pepino, el frijol, la papa, el algodón, el melón, la soya y las flores, entre otros (18,19). Los daños causados por estas plagas se deben al debilitamiento de la planta por consecuencia de la alimentación de este insecto chupador; problemas fisiológicos como la madurez irregular en el tomate; y la excreción de sustancias que favorecen el crecimiento de hongos sobre las plantas colonizadas (20). El cultivo de lechuga (Lactuca sativa) es afectado por una diversidad de patógenos siendo las especies Sclerotina minor (Jagger) y Sclerotinia sclerotiorum (de Bary) los hongos que ocasionan mayores pérdidas económicas que pueden oscilar entre el 10% y el 50% (21). La enfermedad del moho blanco causada por Sclerotina sp. presenta gran importancia dada su amplia distribución en las regiones templadas y tropicales del mundo y las altas pérdidas que ocasiona, pues reduce los rendimientos y la calidad del producto cosechado (22). Cundinamarca representa cerca del 72% de la producción nacional de lechuga (23); sin embargo, los rendimientos de producción son bajos comparados con los obtenidos en Estados Unidos y Bélgica debido principalmente a la incidencia de este hongo (24). Rhizoctonia solani es un patógeno habitante del suelo que ataca el tomate, especialmente cuando éste se cultiva en invernadero, provocando podredumbre en las raíces y cuello. Las pérdidas por enfermedades en este cultivo ascienden al 80% de las pérdidas totales a nivel de cosecha y a nivel de consumidor (25). Para el manejo sostenible de insectos, plagas y enfermedades, el Laboratorio de Control Biológico de Corpoica desarrolló un bioplaguicida formulado como un granulado dispersable a base de un aislamiento nativo de Lecanicillium lecanii para el control de las moscas blanca y otro formulado como polvo mojable cuyo principio activo es un aislamiento nativo de Trichoderma koningiopsis para el control de Sclerotinia sp. y Rhizoctonia solani en los cultivos de lechuga y tomate respectivamente. Los microorganismos utilizados como principio activo de dichos bioplaguicidas pueden verse afectados por diferentes condiciones ambientales como la humedad, la temperatura y la radiación ultravioleta del sol, siendo este último el factor más limitante (26). La radiación UV del sol tiene efectos directos e indirectos sobre macromoléculas. Entre los efectos indirectos se encuentra el daño en macromoléculas y entre los directos el daño en DNA que tiene como consecuencia la disminución en la viabilidad, disminución en la patogenicidad, disminución en la velocidad de elongación de micelio y disminución en la germinación de conidios (27). Por tal razón los bioplaguicidas desarrollados en Corpoica incluyen en sus formulaciones protectores solares, con miras a mejorar la eficacia y la persistencia de estos dos microorganismos en campo, lo que va a repercutir directamente en los niveles de control.

Actualmente CORPOICA cuenta con dos bioplaguicidas microbianos a base de los hongos T. koningiopsis Th003 y L. lecanii Vl026, los cuales incluyen protectores solares en su composición, sin embargo no se ha demostrado el efecto fotoestabilizador de las

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formulaciones, lo cual es necesario para finalizar el proceso de desarrollo de estos bioplaguicidas.

3. MARCO TEÓRICO

3.1 Trichoderma spp.

Las colonias del género Trichoderma, crecen en forma de polvillo con poco micelio aéreo y con pigmentación típica en tonos verdes y verde-amarillo en medio de cultivo agar Papa-Dextrosa-Agar (28). Se caracteriza por poseer conidióforos erectos o arrastrados, al final del conidióforo presenta terminaciones fialinas (29) y sus esporas son hialinas lisas, ovoides y con un solo núcleo (30).

3.1.1 Clasificación taxonómica de Trichoderma koningiopsis (31)

Dominio: Eucariota

Reino: Fungi

Phylum: Ascomycota

Clase: Sordariomycetes

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocreaceae

Género: Trichoderma

Especie: Trichoderma koningiopsis

3.1.2 Mecanismo de acción como biocontrolador

Trichoderma sp. es un hongo oportunista y actúa como parásito y antagonista de muchos hongos fitopatógenos. Su principal mecanismo de acción es el micoparasitismo. Trichoderma crece a través de la hifa de otro hongo y secreta enzimas que degradan la pared celular, después consume el protoplasma del hospedero como fuente de alimento y multiplica sus conidios (17). Otro mecanismo utilizado por Trichoderma spp. es la competencia por nutrientes, por espacio y otros factores de crecimiento. Como parásito Trichoderma tiene una fuerte capacidad para movilizarse en el suelo y tomar los nutrientes, haciéndolo mejor y más eficientemente que cualquier microorganismo del suelo (32). En cuanto a la interacción con la planta, Trichoderma coloniza raíces y causa importantes cambios en el metabolismo de ésta, estimula el crecimiento de la planta y elimina patógenos por micoparasitismo (17). Trichoderma spp. es utilizado para el control de patógenos en cultivos de soya, algodón, cítricos, girasol, café, pimienta, tabaco, lenteja, banano y tomate, entre otros (17). 3.2 Lecanicillium lecanii

Las colonias de este hongo son de color blanco a crema, los conidióforos son poco diferenciados de las hifas vegetativas. Las células conidiógenas (fiálides) están en forma

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de verticilios de dos a seis, en parejas o solitarias sobre hifas o apicalmente sobre cortas ramificacionesy sus conidios son ovalados y gordos en forma de arroz (33). 3.2.1 Clasificación taxonómica de Lecanicillium lecanii (34)

Reino: Fungi

Phylum: Ascomycota

Clase: Ascomycetes

Género: Lecanicillium

Especie: Lecanicillium lecanii

3.2.2 Mecanismo de acción como biocontrolador

Es un importante patógeno de insectos utilizado para control de plagas. Tiene diferentes hospederos incluidos artrópodos, nematodos, plantas y hongos. Su mecanismo de acción como hongo entomopatógeno mitospórico se basa en la adherencia de los conidios a la cutícula del hospedero, los cuales germinan y penetran la cutícula, produciendo blastosporas dentro del hemocele del artrópodo, finalmente el micelio se ramifica e invade los tejidos causando la muerte del hospedero (35). Lecanicillium lecanii también puede actuar como controlador de patógenos de plantas mediante antibiosis y micoparasitismo (36).

3.3 Bioplaguicidas

Los bioplaguicidas son organismos vivos plantas, animales microscópicos como nematodos y microorganismos entre los que se encuentran, bacterias, virus, y hongos) o productos naturales derivados de esos organismos que ayudan a suprimir plagas. Entre las ventajas de usar bioplaguicidas se encuentra el reducido impacto en el medio ambiente y en la salud humana a diferencia de los plaguicidas sintéticos (17).

El uso de plaguicidas se ha hecho necesario para el control de plagas en cultivos de importancia económica, aunque el uso de plaguicidas químicos sigue prevaleciendo frente a los biológicos, por precio y eficacia (37). La importancia de reducir el uso de plaguicidas químicos radica en su toxicidad y en el impacto que tienen tanto en la salud humana como en el medio ambiente. La mayoría de las intoxicaciones en Colombia se dan por plaguicidas organo-fosforados y carbamatos, los cuales son ampliamente utilizados como insumos agrícolas, plaguicidas domésticos y para el control de vectores de enfermedades epidémicas (38).

Los bioplaguicidas tienen varios tipos de presentación según su forma de aplicación. Entre éstas se encuentran las formulaciones líquidas, los gránulos dispersables en agua, los polvos mojables y los pellets (17).

Los bioplaguicidas microbianos a base de hongos tienen ciertas limitantes en su efectividad en campo debido a su exposición a condiciones medioambientales drásticas como por ejemplo los rayos UV del sol (26).

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3.3.1 Tipos de formulación de bioplaguicidas

3.3.1.1 Formulaciones líquidas

* Suspensiones acuosas (S)

En esta formulación el ingrediente activo está suspendido en un medio acuoso, y éste debe ser de pequeño tamaño de partícula y ser de fácil redispersión (39).

*Concentrados emulsionables (EC)

El principio activo de un concentrado emulsionable se encuentra suspendido en un solvente no polar con agentes emulsificantes. Estos concentrados se caracterizan porque al ser mezclados con agua forman una emulsión (39).

3.3.1.2 Formulaciones sólidas

*Granulados (G)

Los granulados tienen aspecto de arenilla con tamaños de partícula que oscilan entre 0,2 y 1,5 mm, y normalmente contienen el principio activo, el vehículo y el adherente (40).

*Granulados dispersables en agua (WG)

Tienen la misma presentación de los granulados pero éstos deben reconstituirse en agua para ser aplicado mediante un aspersor (39).

*Polvos mojables o polvos para reconstituir (WP)

Se preparan mezclando el ingrediente activo con un agente transportador como la arcilla, con un humectante y un dispersante. El humectante ayuda a mojar el producto cuando se mezcla con el agua y el dispersante reduce la cohesión de las partículas permitiendo que se dispersen en la fase acuosa. Estos polvos forman una suspensión al ser mezclados con agua (39).

*Polvos para espolvoreo

El principio activo se encuentra disperso en un vehículo inerte sólido y son aplicados directamente sobre las plantas o sobre el suelo (41).

3.4 Efectos de la radiación UV

La radiación ultravioleta afecta directamente la germinación de conidios, disminuyéndola progresivamente a medida que aumenta el tiempo de exposición (42). Aparte de los daños generados en la producción de conidios, la molécula más afectada por la radiación UV es el DNA que se modifica y transmite el daño de generación en generación (mutaciones) 43).

La radiación UV es el 7% de la energía emitida por el sol y cubre longitudes de onda de los 100 a los 400 nanómetros y es clasificada en tres categorías: UV-A que comprende longitudes de onda entre 320 y 400 nm, UV-B entre 280 y 320 nm y UV-C entre 100 y 280 nm.

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La radiación solar antes de llegar a la superficie terrestre, viaja a través de la atmósfera donde es absorbida la radiación UV-C y el 90% de la UV-B, mientras que la radiación UV-A es débilmente absorbida, por tal razón la radiación UV disponible en la tierra es 98% UV-A y 2% UV-B (44).

*Tipos de daño

La acción de la radiación ultravioleta sobre los microorganismos, se debe a la presencia de grupos cromóforos en diferentes estructuras celulares, tales como ácidos nucleicos, lípidos y proteínas capaces de absorber ciertas longitudes de onda que ocasionan daños directos o indirectos sobre las macromoléculas. Los daños directos se refieren a la formación de fotoproductos generalmente a nivel del ADN, donde se forman dímeros de bases pirimidínicas adyacentes sobre la misma cadena de ADN tipo timina - timina, timina - citosina y citosina - citosina, por acción de la radiación UVC o UVB (45).

En segundo lugar, la radiación UV-A causa daños indirectos debido a la formación de especies reactivas de oxígeno tales como peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilo o superóxidos, capaces de oxidar las pentosas del ADN y de romper la doble cadena de la molécula (14).

Estudios realizados sobre el efecto de la radiación UV-A y UV-B sobre Paecilomyces fumosoroseus, demostraron que al exponer el hongo a la radiación UV-B, se reduce la germinación en un 98% en menos de 30 minutos, disminuyendo también su viabilidad medida en UFC y su patogenicidad medida mediante bioensayos de infectividad con Spodoptera frugiperda (46). En el estudio realizado por Villamizar et al. (2009) evaluando el efecto de la luz UV C sobre la actividad biocontroladora de Lecanicillium lecanii para el control de Bemisia tabaci se observó que la germinación de los conidios no formulados disminuye en un 69,7% después de seis horas de exposición a luz UV (4,5-6,0 kWh/m2), mientras los conidios formulados disminuyeron en un 37,4% su germinación, concluyendo a partir de esto que la formulación redujo el daño causado por la radiación solar. Los autores atribuyeron el efecto de fotoestabilidad al protector solar incluido en la formulación, el cual absorbe una porción de la radiación UV del sol (47). En otro estudio realizado con Trichoderma sp. se detectó una reducción de la germinación de los conidios al estar expuestos a radiación UV y se observó un efecto negativo sobre la extensión de su micelio (27).

3.5 Protectores solares

3.5.1 Filtros solares químicos o absorbentes

Son moléculas que poseen un grupo carbonilo que se isomeriza bajo el efecto de la energía de las radiaciones absorbidas, absorben una parte de las radiaciones cortas y reflejan la otra parte con una longitud de onda superior a 380 nm (luz visible o la radiación infraroja) (48).

Los filtros solares químicos, pueden ser de espectro estrecho (protección frente a radiación UV-C), filtros de espectro moderado a amplio (protección frente a radiación UV-A) y de amplio espectro (protección frente a radiación UV-B y UV-A) (49).

Entre los filtros de bajo espectro se encuentra el ácido para-aminobenzoico (PABA) y sus ésteres. Los rangos de absorbancia para el PABA y el aminobenzoato de glicerol está entre 260 y 313 nm en concentraciones del 5 al 15%. Cinamatos y sus ésteres, útiles en

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concentraciones entre el 1 y el 4%, tienen un rango de protección entre 280 y 310 nm y son insolubes en agua. Tambien se encuentran en este campo los salicilatos y ésteres, cuyo rango de protección está entre 290 y 315 nm (48).

3.5.2. Filtros solares físicos

Estos filtros son generalmente de origen mineral, reflejan o dispersan la radiación ultravioleta y son efectivos frente a radiación ultravioleta de tipo A y B y la radiación visible. Los filtros solares físicos más usados son el dióxido de titanio y el óxido de zinc, que son químicamente inertes, seguros y protegen contra el espectro completo de UV (48).

4. OBJETIVO

Determinar la fotoestabilidad de dos formulaciones a base de Trichoderma koningiopsis Th003 y Lecanicillium lecanii Vl026 frente a la radiación solar simulada.

5. METODOLOGÍA

5.1 Microorganismos

Los microorganismos evaluados en el presente trabajo fueron Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003. Estas cepas fueron suministradas por el banco de germoplasma del Laboratorio de Control Biológico de Corpoica y se mantuvieron crioconservadas en glicerol al 10% hasta su recuperación en cajas de Petri con medio agar extracto de malta (EM) y agar papa dextrosa (PDA) respectivamente.

5.2 Producción masiva y formulación

Para iniciar la fermentación sólida de Lecanicillium lecanii Vl026 se hizo crecer el hongo en medio líquido Sabouraud y este cultivo se utilizó como preinóculo en una fermentación en estado sólido utilizando un medio a base de cereales previamente estandarizado. El sustrato sólido inoculado se llevó a incubación por 10 días a 27±2°C y posteriormente se dejó en cuarto frío por 5 días a 4±2ºC para mejorar la esporulación. Los conidios fueron separados por lavado y centrifugación y posteriormente se formularon con el fin de obtener un granulado dispersable (WG) (Figura 1a).

En el caso de la fermentación sólida de Trichoderma koningiopsis Th003, el hongo se cultivó en medio de cultivo agar PDA por 5 días, momento en el cual se preparó una suspensión de conidios en una solución de Tween 80 al 0,1% y se ajustó a una concentración de 1x108 conidios/mL. Esta suspensión se asperjó sobre el sustrato de fermentación sólida a base de cereales previamente estandarizado. El medio inoculado se incubó por 8 días a 24±2°C. Los conidios fueron separados por lavado (solución Tween 80, 0,1%) y posteriormente centrifugados, con ellos se elaboró la formulación diseñada como un polvo mojable (WP) (Figura 1b).

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Figura 1 a. Producción masiva de Lecanicillium lecanii Vl026 mediante fermentación sólida. b. Producción masiva de Trichoderma koningiopsis Th003 mediante fermentación

sólida.

5.3 Control de calidad de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003

Para los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 se realizó un control de calidad preparando diluciones seriadas en base 10 hasta 10-8 y evaluando las siguientes características por triplicado:

* Viabilidad: Se determinó en medio de cultivo agar EM-tritón |para L. lecanii y en medio de cultivo agar PDA-tritón para T. koningiopsis, sembrando en superficie las diluciones 10-

6, 10-7 y 10-8. Las cajas se incubaron a 25±2°C por 4 días y se determinó en número de unidades formadoras de colonia por gramo de producto (UFC/g).

* Germinación: Las diluciones 10-2 y 10-3 se sembraron en medio agar-EM-benlate (0,0003%) para L. lecanii y medio de cultivo agar-agua-benlate (0,0003%) para T. koningiopsis. Las cajas se incubaron por 24 horas a 25±2°C, tiempo después del cual, se cortó un cuadrado de agar de 1cm2 que se colocó en una lámina portaobjetos. Sobre el agar se adicionó una gota de azul de lactofenol y utilizando un microscopio con el objetivo de 40X, se realizó la lectura de conidios germinados y sin germinar en 10 campos ópticos por réplica (47).

* Concentración: La dilución 10-3 se cuantificó en cámara de Neubauer para cada tratamiento. El conteo se realizó por triplicado para cada tratamiento.

5.4 Estudio de fotoestabilidad

Para cada formulación se evaluaron tres tratamientos correspondientes a los conidios secos sin formular, los conidios formulados reconstituidos en agua y los conidios formulados suspendidos en una base oleosa y reconstituido en agua. Todas las suspensiones se ajustaron a una concentración de 1x106 conidios/mL. Muestras de 0,1mL de cada tratamiento se sembraron en medio agar-agua-benlate (0,003%) para T. koningiopsis y en medio agar-EM-benlate (0,003%) para L. lecanii. Se inocularon tres cajas por tiempo de exposición (0, 30, 60 y 90 min) para un total de 12 cajas por cada tratamiento. El tiempo de exposición se seleccionó de acuerdo con el tiempo de irradiación máxima (12 µW/cm2.nm ) diaria en departamentos como Tolima que reportan las máximas radiaciónes de luz UV de Colombia. El diseño experimental fue completamente al azar con medidas repetidas en el tiempo y tres repeticiones para cada

a  b

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tratamiento y tiempo de exposición. Las cajas inoculadas fueron expuestas a la radiación emitida por un simulador solar 16S 150 marca Solar Light ajustando la potencia de la radiación UV-B a 12 µW/cm2.nm, con un radiómetro. Las unidades experimentales inoculadas e irradiadas fueron incubadas a 25±2°C por 24 horas, tiempo después del cual se leyó la germinación siguiendo la metodología previamente descrita. Las cajas se incubaron nuevamente por 48 horas para evaluar cualitativamente la presencia de micelio y 8 días más para verificar la conidiación del hongo.

5.5 Análisis estadístico

Una vez demostrada la normalidad de los datos (Prueba de Shapiro Wilk 95%) y la homogeneidad de las varianzas (Prueba de Bartlett 95%), se realizó un análisis de varianza ANOVA y una prueba de comparación de medias de Tukey (95%).

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Control de calidad de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003

Los conidios sin formular y formulados de Lecanicillium lecanii y Trichoderma koningiopsis se caracterizaron microbiológicamente y los resultados promedio de las características para cada tratamiento se presentan en la tabla 1. (Anexo 1)

Tabla 1. Características microbiológicas promedio de los conidios formulados y sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003.

WG: Granulado dispersable, WP: Polvo mojable. Los valores de cada característica se encontraron dentro de los límites establecidos por el laboratorio de control de calidad BIOTECNICA de Corpoica, que establece los parámetros de calidad que debe tener cada uno de estos bioplaguicidas para poder ser comercializados. En este sentido la viabilidad de la formulación a base de Th003 debe ser superior a 1x108 UFC/g y la del granulado a base de Vl026 debe ser superior a 1x109 UFC/g. Para la concentración de conidios se establece que el WP de Th003 debe tener mínimo 1x108 conidios/g y el WG de Vl026 mínimo 1x109 conidios/g y el límite de aceptación para la germinación de conidios es mínimo del 80%. La germinación para todos los tratamientos fue superior al 80%. Entre la germinación de los conidios formulados y sin formular de Th003 no hubo diferencias significativas, lo que sugiere que el proceso de formulación no tuvo un efecto negativo en la germinación de los conidios. En cambio para Vl026, la germinación de los conidios formulados fue significativamente mayor (F=4,56. df=3, P=0,0382) que la de los conidios sin formular (Anexo 5), lo que quiere decir que la formulación está brindando algún tipo de protección a los conidios posiblemente durante el proceso de secado mejorando la germinación.

Característica Vl026 WG Vl026 conidios

Th003 WP Th003 conidios

Viabilidad (UFC/g) 3,5 x 109 4,2 x 109 1,3 x 108 2,6 x 108 Concentración (conidios/g) 4,7 x 109 8,0 x 109 8,4 x 108 7,2 x 108 Germinación 24 horas (%) 87,41 a 82,15 c 83,40 bc 85,92 ab

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6.2.1 Fotoestabilidad de Lecanicillium lecanii Vl026

La germinación de los conidios formulados y sin formular, expuestos o no a la radiación solar simulada se presenta en la figura 3 (Anexo 2), donde se evidencia que tanto los conidios no formulados, como los formulados reconstituidos en agua y los formulados suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua, presentaron una disminución gradual de la germinación a medida que aumentó el tiempo de exposición a la radiación solar simulada. Este comportamiento indica que todos los tratamientos fueron susceptibles a la radiación.

El efecto negativo de la radiación posiblemente se debió al espectro de la radiación UV-B, cuyo efecto ha sido demostrado para varios hongos. Por ejemplo, Moody (1999) determinó que la germinación de conidios de hongos del filoplano disminuyó de forma gradual más del 40%, al ser expuestos a radiación monocromática tipo UV-B durante 15 horas.

Los conidios de todos los tratamientos presentaron germinaciones que oscilaron entre el 81% y el 84% antes de iniciar la irradiación. Después de 90 minutos de exposición a la radiación solar simulada se obtuvo una inactivación del 37,77% para los conidios formulados reconstituidos en agua, del 37,51% para los conidios suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua y del 59,35% para los conidios sin formular reconstituidos en agua.

En la figura 2a. se puede observar la germinación de los conidios formulados y sin formular de L. lecanii Vl026 después de exponerse a radiación solar simulada por 90 minutos, donde se evidencia la mayor germinación y elongación del tubo germinal en el bioplaguicida en comparación con los conidios sin formular, sugiriendo un efecto protector de la formulación frente a la radiación.

La germinación de los conidios en los tres tratamientos se redujo significativamente después de los primeros 30 minutos de irradiación (F= 142,80, df= 11, P= 0,000) (Figura 3, anexo 6). Pasados los 60 minutos de irradiación se observó una reducción significativa de la germinación de los conidios sin formular con respecto al valor obtenido a los 30 minutos, mientras que la germinación de los conidios formulados (WG) se mantuvo estable, para los dos tipos de reconstitución. Pasados 90 minutos de exposición, se observó una germinación significativamente menor en los conidios no formulados en comparación con la obtenida en los conidios formulados (WG) tanto reconstituido en agua como cuando se utilizó aceite y agua. Este resultado indica que la formulación (WG) redujo eficientemente el efecto negativo de la radiación solar simulada sobre los conidios de L. lecanii.

Además, se puede concluir que para la formulación, la adición de la base oleosa no mejoró la fotoestabilidad del hongo.

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Figura 2 a. Conidios sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 después de ser expuestos a radiación solar simulada por 90 minutos b. Conidios formulados de

Lecanicillium lecanii Vl026 (WG) después de ser expuestos a radiación solar simulada por 90 minutos.

 

Figura 3. Efecto de la radiación solar simulada sobre la germinación de los conidios de Lecanicillium lecanii Vl026 formulados y sin formular. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%).

La radiación solar simulada afectó drásticamente la germinación de los conidios de L. lecanii de igual forma como se demostró en el estudio realizado por Villamizar et al. (2009) quienes evaluaron los efectos de la radiación UV sobre los conidios de este mismo hongo, observando que los conidios no formulados disminuyeron su germinación en un 69,7% después de seis horas de exposición a luz UV-C (4,5-6,0 kWh/m2) mientras los conidios formulados disminuyeron su germinación en un 37,4%. Los autores concluyeron que la formulación redujo el daño causado por la radiación solar, atribuyendo el efecto de fotoestabilizador al protector solar incluido en la formulación, el cual absorbe una porción de la radiación UV del sol.

a  b

24 

 

6.2.2 Fotoestabilidad de Trichoderma koningiopsis Th003

Los conidios de Trichoderma koningiopsis sin formular, formulados y reconstituidos en agua y suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua presentaron una disminución gradual de la germinación a medida que aumentó el tiempo de exposición a la radiación solar simulada.

La germinación inicial de los tres tratamientos osciló entre el 80% y el 85% y se presentaron inactivaciones del 39% para los conidios formulados reconstituidos en agua, del 34% para los conidios formulados suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua y del 51% para los conidios no formulados después de 90 minutos de irradiación.

En la figura 4 (Anexo 2) se puede observar la germinación de los conidios formulados y sin formular después de exponerse a radiación solar simulada durante 90 minutos, donde se evidencia nuevamente que los conidios formulados presentan mayor germinación y elongación del tubo germinal que los conidios sin formular, lo que indica que la formulación de Th003 también brindó protección frente a la radiación.

Al igual que para L. lecanii se presentó una reducción significativa de la germinación de los tres tratamientos a través del tiempo de exposición (F= 108,9, df= 11, P= 0,000) (Figura 5, anexo 7). Pasados 90 minutos de irradiación se obtuvo una germinación significativamente menor para los conidios sin formular con respecto a la de los conidios formulados WP en los dos sistemas de reconstitución, confirmándose el efecto fotoestabilizador de la formulación.

Figura 4 a. Conidios sin formular de Trichoderma koningiopsis Th003 después de ser expuestos de radiación solar simulada por 90 minutos b. Conidios formulados de Trichoderma koningiopsis Th003 (WP) después de ser expuestos a radiación solar simulada por 90 minutos.

Los conidios de T. koningiopsis formulados y reconstituidos en agua o suspendidos en base oleosa y reconstituidos en agua, no presentaron diferencias significativas entre si, lo que sugiere que el aceite vegetal de la base oleosa no mejoró la fotoestabilidad de la formulación del hongo.

Sin embargo, en otros trabajos se ha demostrado un efecto de los aceites vegetales en la tolerancia a la radiación solar, como el trabajo de Morley-Davies et al. (1995) quienes expusieron conidios de los hongos Beauveria bassiana, Metarhizium flavoviridae y M.

ba 

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anisopliae formulados en aceite de parafina o como polvos mojables, a la radiación solar simulada durante 24 horas. En dicho trabajo se determinó que la formulación en polvo mojable que incluía un filtro solar fue la formulación más estable, pero la formulación oleosa redujo la fotoinactivación con respecto a los conidios sin formular.

Figura 5. Efecto de la radiación solar simulada sobre la germinación de de los conidios de Trichoderma koningiopsis Th003 formulados y sin formular. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas según prueba de Tukey (95%)

6.2.3. Comparación de la susceptibilidad de los conidios sin formular de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 a la radiación solar simulada.

La germinación inicial de los conidios sin formular de L. lecanii y T. koningiopsis fue del 83% y del 85% respectivamente y después de 30 minutos de irradiación presentaron una reducción del 30%. Pasados 60 y 90 minutos se evidenció una menor germinación para L. lecanii con un valor de inactivación total del 59% frente a un 51% de inactivación presentado por T. koningiopsis. 

Las germinaciones de los conidios no formulados tanto de L. lecanii como de T. koningiopsis no presentan diferencias significativas entre si hasta los 30 minutos de exposición (Figura 6, anexo 8). Sin embargo, a partir de los 60 minutos de irradiación los conidios no formulados de L lecanii presentaron germinaciones significativamente menores (F=158,82, df=7, P=0,000) que los conidios no formulados de T. koningiopsis. Este resultado sugiere que L. lecanii es más susceptible a los efectos nocivos de la radiación solar simulada, que los conidios de T. koningiopsis.

La diferencia en la tolerancia de diferentes hongos a la radiación UV se debe a diferentes mecanismos de defensa. Por ejemplo, algunas especies de hongos poseen enzimas que le permiten controlar el estrés oxidativo generado por la radiación UV (50).

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Ciertos hongos presentan otro mecanismo de defensa frente a la radiación UV-B, consistente en pigmentos como la melanina que tienen la capacidad de absorber cierta longitud de onda emitida por el sol (51). Estudios realizados demuestran que Trichoderma sp. al igual que Penicillium sp. poseen pigmentos de naturaleza polifenólica que les confieren el color verde (52). Otro estudio realizado sobre pigmentos de Trichoderma sp. determinó la presencia de antraquinonas en diferentes especies de este hongo (53). Dichos pigmentos posiblemente hacen que el aislamiento Th003 objeto de este estudio, sea más tolerante a la radiación que el aislamiento Vl026, el cual es macroscópicamente de color blanco.

 

Figura 6. Susceptibilidad de los conidios sin formular de L. lecanii Vl026 y T. koningiopsis Th003 frente a la radiación solar simulada. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas entre sí según prueba de Tukey 95%.

6.2.4 Comparación de la fotoestabilidad de los conidios de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 formulados como WG y WP respectivamente.

Al comparar la fotoestabilidad de los dos bioplaguicidas (L. lecanii WG y T. koningiopsis Th003 WP) para los dos sistemas de reconstitución evaluados, se observó una reducción progresiva de la germinación a medida que aumentó el tiempo de irradiación (Figura 7).

Sin embargo, independientemente del sistema de reconstitución, las germinaciones finales de los bioplaguicidas no presentaron diferencias significativas entre sí, lo que sugiere que las dos formulaciones fueron igualmente fotoestables (Anexo 9 y 10).

Las formulaciones mejoraron la fotoestabilidad de los dos hongos y aunque ésta no fue del 100%, si se logró disminuir el impacto de la radiación posiblemente por la presencia de filtros solares. Para T. koningiopsis Th003 se incluyeron dos protectores solares uno físico y uno químico y para L. lecanii Vl026 se utilizó un protector químico. Los protectores solares han sido ampliamente estudiados para mejorar la fotoestabilidad de microorganismos biocontroladores. Por ejemplo, Hadapad et al. (2009) evaluaron la

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fotoestabilidad de las esporas de Bacillus sphaericus formuladas y sin formular con diferentes protectores solares a diferentes concentraciones y expuestas a radiación UV-B de 8 a 24 horas, observándose que después de seis horas de irradiación los conidios sin formular murieron completamente mientras que al usar un protector solar con una concentración alta (2%), la inactivación se redujo a un 15% aproximadamente (54).

Figura 7. Fotoestabilidad de los conidios formulados de L. lecanii Vl026 WG y T. koningiopsis Th003 WP. a. Reconstituido en agua. b. suspendidos en aceite y

reconstituidos en agua. Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas entre sí según prueba de Tukey 95%.

6.6 Presencia cualitativa de micelio y esporas.

La formación de micelio se evidencio a las 72 horas de incubación y la presencia de esporas a los ocho días para la mayoría de los tratamientos a excepción de los conidios no formulados de L. lecanii Vl026 después de 90 minutos de exposición a radiación solar simulada (Anexo 3). En general la presencia de micelio fue menor a medida que aumentó el tiempo de exposición. También se observó que en los tratamientos formulados el micelio fue más abundante que en los tratamientos sin formular. El micelio de T. koningiopsis fue más abundante que el micelio de L. lecanii después de exponerse a la misma radiación y la presencia de esporas siempre fue consecuente con la presencia de micelio. Estos resultados indican que además de un efecto en la germinación, la radiación solar simulada y el tiempo de exposición afectaron la formación de micelio y en consecuencia la conidiación, resultados similares encontró Moody (1999) quien observó que la extensión del micelio de Trichoderma koningii y tres hongos más se vio inhibida cuando se expusieron a radiación UV B durante 17 días.

 

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7. CONCLUSIONES

1. La radiación solar simulada disminuyó la germinación de los conidios de forma directamente proporcional al tiempo de exposición a ésta.

2. Las formulaciones mejoraron la fotoestabilidad de los conidios de Lecanicillium lecanii Vl026 y Trichoderma koningiopsis Th003 frente a la radiación solar simulada.

3. Utilizar aceite para reconstituir las formulaciones no mejoró la fotoestabilidad de los conidios de ninguno de los dos hongos.

4. Los conidios de Trichoderma koningiopsis Th003 fueron más tolerantes a la radiación solar simulada que los conidios de Lecanicillium lecanii Vl026.

8. RECOMENDACIONES

1. Evaluar el efecto de la radiación solar simulada sobre la actividad biocontroladora de los hongos.

2. Estudiar los daños fisiológicos y genéticos ocasionados por la radiación solar sobre los conidios de Lecanicillium lecanii y Trichoderma koningiopsis

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