UNIVERSIDAD CATLICA DEL MAULE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y FORESTALES ESCUELA DE INGENIERA FORESTAL

PRODUCCIN DE PLANTAS MICORRIZADAS CON TRUFA NEGRA (Tuber melanosporum.) MEDIANTE LA INOCULACIN DE ESTACAS ENRAIZADAS DE AVELLANO EUROPEO (Corylus avellana).

Profesor Gua:Rmulo Santelices Moya. Seminario presentado como parte de los requisitos para optar al Ttulo de Ingeniero de Ejecucin Forestal

GUILLERMO BRUNA DAZ - CSAR ROJAS VILLASEOR TALCA CHILE

2006

Profesor Patrocinante: Sr.

Rmulo Santelices Moya

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Profesor Patrocinante: Sr.

J.Antonio Valdivieso Rodriguez ...................................

Profesor Patrocinante: Sr.

Domingo Contreras Fernandez

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________________________________ DIRECTOR ESCUELA Ingeniera Forestal

A nuestros padres, por su apoyo incondicional, Paciencia y entrega valrica A nuestras familias por su sacrificio

NDICE GENERAL DE MATERIAS Ttulo Pgina

1.- INTRODUCCIN.. 1 2.- RESUMEN.. 3 3.- SUMMARY.... 4 4.- OBJETIVOS.. 5 4.1.- OBJETIVO GENERAL.... 5 4.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS... 5 5.- REVISIN BIBLIOGRAFICA.... 6 5.1.- ANTECEDENTES GENERALES DE Corylus avellana..... 6 5.1.1.- Situacin en el pas... 6 5.1.2.- Aspectos Botnicos y Ecolgicos..... 7 5.2.-ANTECEDENTES GENERALES DE LA PROPAGACIN ASEXUAL....10 5.2.1.- Propagacin Vegetativa a travs de estacas..11 5.2.1.1.- Origen de las races adventicias......12 5.2.1.2.- Factores que afectan el enraizamiento...13 5.2.1.2.1 Tratamientos aplicados a las estacas.....13 5.2.1.2.2.- Caractersticas del material vegetal....16 5.2.1.2.3.- Condiciones ambientales..19 5.2.1.2.3.1.- Medio de enraizamiento....19 5.2.1.2.3.2.- Humedad.........20 5.2.1.2.3.3.- Temperatura.......21 5.2.1.2.3.4.- Luz...22 5.3.- ANTECEDENTES GENERALES DE Tuber melanosporum....23 5.3.1.-Tipos De Trufas....23 5.3.2.- Efectos de la aplicacin de micorrizas seleccionadas para el desarrollo forestal......26 5.3.3.- Factores Que Afectan a Las Micorrizas ...27 5.3.4.- Geografa, clima y suelo......28

5.3.5.- Resumen.......29 5.4.- CICLO BIOLGICO DE LA TRUFA...30 5.4.1.- Etapas del ciclo de T melanosporum ..31 5.5.- TCNICAS DE MICORRIZACIN.....31 5.5.1- Tcnicas De Inoculacin De T. melanosporum......32 5.5.2- Principales Especies Simbiontes De T. Melanosporum.....33 5.5.3- Especies Potenciales Presentes En Chile......33 6.- METODOLOGA.....35 6.1.- ENRAIZAMIENTO DE ESTACAS.35 6.2.- INOCULACIN DE LAS ESTACAS CON Tuber melanosporum.......37 6.3.- DISEO EXPERIMENTAL ENSAYO I ENRAIZAMIENTO DE ESTACAS DE Corylus avellana...41 6.4.- DISEO EXPERIMENTAL ENSAYO II "MICORRIZACIN CON Tuber melanosporum..42 7.- RESULTADOS Y DISCUSIN..44 7.1.- ENRAIZAMIENTO..44 7.2.- MICORRIZACIN..47 8.-FIGURAS DE ALGUNAS DE LAS MICORRIZAS DE Tuber melanosporum OBTENIDAS EN EL ESTUDIO...50 9.-CONCLUSIONES..51 10.- BIBLIOGRAFA.53 12.- ANEXOS..57

NDICE DE TABLAS Ttulo Tabla N 1 Caractersticas de los terrenos recomendados para el cultivo de trufa negra......................................... Tabla N 2 Especies de simbiontes Potenciales Presentes En Chile...................... Tabla N 3 Caractersticas del sustrato.................................................................... 29 34 38 Pgina

Tabla N 4 Forma de evaluar la calidad de las plantas micorrizadas....................... 40 Tabla N 5 Diseo del Ensayo I Enraizamiento....................................................... 42 Tabla N 6 Descripcin de los factores del ensayo de micorrizacin...................... 42 Tabla N 7 Diseo del Ensayo II Micorrizacin....................................................... 43 Tabla N 8 Efecto del tipo de sustrato sobre la sobrevivencia, formacin de callo y arraigamiento de estacas de C. Avellana............... 44 Tabla N 9 Efecto del tipo de susbstrato sobre el Nmero y la longitud de races, en estacas de C. Avellana........................................................... 45 Tabla N 10 Efecto de origen de la estaca sobre la sobrevivencia, formacin de callo y arraiganmiento de estacas de C. Avellana........................... 45 Tabla N 11 Efecto del Origen de la estaca, sobre nmero y largo de races de C. Avellana ...................................................................................... 45 Tabla N12 Efecto de la Concentracin de AIB sobre la sobrevivencia, formacin de callo y arraiganmiento de estacas de C. Avellana........... 46 Tabla N13 Efecto de la concentracin de AIB sobre nmero, y largo de estacas de C.. Avellana..................................................................... 46 Tabla N 14 Efecto del tamao del contenedor en la micorrizacin de las plantas de C. Avellana................................................................ 47 Tabla N 15 Efecto de la temporada del inculo en la micorrizacin de las plantas de C. Avellana"................................................................ 48 Tabla N 16 Efecto del tamao del contenedor y de la temporada del inculo en la micorrizacin de las plantas de C. Avellana.............. 48

NDICE DE IMGENES Ttulo Figura N 1: Inflorescencias Masculina, Femenina, y Fruto maduro en rama de C. Avellana............................................... Figura N2: Tuber melanosporum Vitt (A), Tuber brumale Vitt. (B), Tuber magnatum Pico (C)..................................................................... 23 Figura N3: Micorrizas de Tuber melanosporum pertenecientes al ensayo............. Figuras N5 y N6: Diferencia evidente entre races generadas en estacas de sierpes y de rebrote........................................................ 36 Figura N 7: Secuencia fotogrfica que muestra la forma de inoculacion de la planta........................................................ 37 Figuras N 8 y N 9: Mezcla de sustrato, Inculo de Tuber melanosporum........ 38 Figura N 10: Secuencia fotogrfica que muestra la extraccin de la muestra de sustrato para posterior analisis en laboratorio................... 39 Figura N 11: Fotografas de Tuber melanosporum Obtenidas por los autores en el estudio................................................................... 50 25 Figura N4: Estacas instaladas en el medio de enraizamiento................................... 35 8 Pgina

1 1.- INTRODUCCIN Nuestro pas presenta una gran gama de condiciones agroecolgicas para el desarrollo de diversos cultivos. Sin embargo, esto no se traduce en reales beneficios para los pequeos y medianos propietarios ligados al sector silvoagropecuario, ya que no cuentan con las facultades tcnico-prcticas para competir de buena forma y en igualdad de condiciones con el resto de los productores. Por esto, es importante la incorporacin de nuevas alternativas de produccin que se condigan de alguna forma con las prcticas tradicionales ya existentes. Hoy en da, se sabe que el bosque no slo producir madera, sino tambin un gran nmero de productos no madereros, entre los que se encuentran los hongos comestibles. Estos se presentan como una importante alternativa econmica pero, lamentablemente, no se les presta la atencin que requieren y se desperdicia su potencial. Los hongos en general, y en especial la trufa negra, presentan un alto valor econmico y ecologco, convirtindose de esta forma en una gran alternativa de desarrollo para los pequeos y medianos productores de la regin centro-sur de Chile. Sin embargo, la principal dificultad que presenta su cultivo es la capacidad de establecer la simbiosis planta-hongo, por esto resulta prioritario investigar diversas formas de produccin de plantas micorrizadas. En Europa, la produccin trufera natural desciende ao tras ao, por lo que la produccin artificial se presenta como la nica alternativa de satisfacer los mercados ya existentes, y de conservar el producto, por lo que su multiplicacin en condiciones artificiales no slo tendra el valor econmico directamente relacionado, sino que tambin el ecolgico y social asociado a este. En la temporada 2005-2006 los precios fluctuaron entre US$ 500 y 1000 por kilogramo, dependiendo del pas en que se comercializaron en el viejo continente. En unos pocos pases en el mundo, como Francia, Italia y Espaa, se ha conseguido cultivar en condiciones artificiales el hongo micorrcico Tuber melanosporum. Estos pases son los que manejan, en este momento, el mercado mundial. Adems existen experiencias en otros pases como Estados Unidos, Nueva Zelanda y Australia, donde ya se est produciendo trufas. En Sudamrica, Chile es el pas ms adelantado en este cultivo, contabilizndose slo experiencias documentadas en Argentina. La trufa negra es el cuerpo fructfico de un hongo que se conoce con el nombre de Tuber melanosporum = Tuber nigrum, este hongo se encuentra asociado simbiticamente, como micorriza, a diversas especies arbreas (encinas, robles, coscojas, avellanos, tilos, carpes y pinos.). Tuber melanosporum es un hongo hipgeo que se presenta a modo de tubrculo (cuerpo fructfico) de color negro en su estado maduro y que libera un aroma muy intenso, lo que lo hace muy apreciado en el mercado mundial de la gastronoma, este aroma es una estrategia de supervivencia y expansin, ya que con el se asegura que algunos animales del bosque (jabales, tejones y roedores.) la encuentren y diseminen sus esporas al comerlas y posteriormente liberarlas a travs de sus heces fecales. La microfauna tambin cumplira esta funcin. (Reyna, 1992).

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Las experiencias ya realizadas en la Universidad Catlica del Maule con simbiontes de Tuber melanosporum son muy satisfactorias. Sin embargo, Corylus avellana, el avellano europeo, propagado por semilla presenta dificultades, principalmente por los bajos niveles de germinacin. Por otro lado, al disponer de un mtodo efectivo de propagacin vegetativa, asegurara la reproduccin de plantas de avellano en un menor tiempo y con mejores resultados, permitiendo adems poder seleccionar y propagar lneas especficas con el objetivo de desarrollar un mtodo efectivo de micorrizacin con Tuber melanosporum. Mediante el desarrollo de este mtodo se logr un sistema de propagacin vegetativa de plantas de C. avellana para un proceso efectivo de micorrizacin con Tuber melanosporum, que garantiza la calidad de las plantas inoculadas con el hongo, esto dado que las plantas logran micorrizar en gran proporcin de acuerdo con lo propuesto por Reyna (2000). El desarrollo de las tcnicas aqu propuestas, genera una gran posibilidad de produccin de plantas ms velozmente y de mejor calidad que por mtodos tradicionales.

3 2.- RESUMEN Nuestro pas presenta variadas condiciones agroecolgicas para el desarrollo de diversos cultivos. A pesar de esto, los pequeos y medianos propietarios del sector silvoagropecuario no se benefician directamente, ya que no puden competir en igualdad de condiciones con el resto de los productores. Por lo que, la incorporacin de nuevas alternativas de produccin es vital. Asimismo, y dado la alta valorizacion en el mercado internacional de los hongos micorrizicos, y en particular Tuber melanosporum, es que se decide, llevar a cabo el proyecto, Desarrollo de las Bases Tecnolgicas para el Cultivo de Trufa Negra (Tuber Melanosporum, Vitt.) en Chile, como Alternativa Productiva y Comercial para los Pequeos y Medianos Productores del Sector Silvoagropecuario, financiado por FIA, y ejecutado por la Universidad Catolica del Maule con colaboracin del CEAM, evaluar la factibilidad de multiplicacin de Corylus avellana, mediante reproduccin vegetativa por estacas, con el objeto de producir plantas factibles de inocular con Tuber melanosporum, e inocular las mismas para evaluar su posterior micorrizacin bajo condiciones controladas de invernadero. El material vegetal de C. avellana se obtuvo de un huerto ubicado en la zona de Pelarco, a 12 kilometros de la ciudad de Talca, Chile. Se utilizo dos tipos de estacas, en dos sustratos distintos, y sometidas a tres concentraciones de cido indolbutrico (AIB) y un testigo. Se trabaj en un invernadero que cont con un sistema de riego automatizado y con camas calientes de arraigamiento. Los resultados indican que C. avellana puede propagarse por estacas. Las provenientes de sierpes arraigan en un 88.5 % y las de rebrote de poda en un 47,6 %. En cuanto al nmero de races las estacas provenientes de sierpes formaron 27,6 races promedio por estaca, por sobre las de rebrote de poda con 18,2. Considerando lo anterior es que se seleccion la planta proveniente de sierpes para el desarrollo de la segunda etapa de investigacin (micorrizacin). Al aplicar AIB, se generaron 28 races promedio por estaca, contra 7,4 para la no aplicacin,. Lo que hara recomendable el empleo de AIB al enraizar estacas de C. avellana, dado que este factor es determinante en cuanto a la sobrevivencia posterior de las plantas. Luego se ensaya la micorrizacin con T. melanosporum de las plantas obtenidas a travs del enraizamiento de estacas de sierpe, en contenedor de 450 cc y 650 cc, y con inculos de la temporada 2003 y 2004, obteniendose muy buenos resultados. Sin embargo el contenedor mayor resulta ser muy superior en cuanto al nmero de pices micorrizados por planta, 12.649 contra 2.689. Ademas se aprecia esta diferencia en el porcentaje de pices micorrizados 33.6 % para el contenedor mayor y 16.1 % para el de menor tamao. El tipo de inculo no presenta diferencias significativas, sin embargo, se apreci interaccin entre los tratamientos, por lo que se analizaron las combinaciones. El contenedor mayor y el inculo de la temporada 2003 presentaron la mejor combinacin, 39.8 % de pices micorrizados, pero no es estadsticamente diferente de la combinacin contenedor mayor inculo de la temporada 2004, 27.5%, por lo que se asume que la variable relevante es la del tamao del contenedor.

4 3.- SUMMARY Our country presents varied agro-ecological conditions for the development of diverse cultures, In spite of this, the small and medium owners of the livestock, agriculture and forestry sector do not benefit directly from this, since they not can to compete in equality of conditions with the rest of the producers. For this, the incorporation of new alternatives of production is vital. In agreement to this and in view of the high appraisement on the international market of the micorrhizal fungi, and especially Tuber melanosporum, it is that decided, inside the frame of the project, Development of the Technological Bases for the Culture (Culturing) of Black Truffle (Tuber Melanosporum, Vitt.) in Chile, as Productive and Commercial Alternative for the Small and Medium Producers of the livestock, agriculture and forestry sector", financed by FIA, and executed by the Catholic University of the Maule with collaboration of the CEAM, to evaluate the feasibility of Corylus avellana multiplication , by means of vegetative reproduction for stakes, in order to produce feasible plants of inoculating with Tuber melanosporum, and to inoculate the same ones to evaluate his later low micorrhizatin conditions controlled of greenhouse. The vegetable material of C. avellana obtained of a plantation located in Pelarco zone, to 12 kilometers of Talca city, Chile. I use two types of stakes, in two different substrata, and submitted three concentrations of indolbutric acid (IBA)and testimony. One was employed at a greenhouse that possessed a system of automated irrigation and warm beds of root generation. The results indicate that C. avellana can propagate for stakes. The originated of Low Outbreaks take root in 88.5 % and those of new shoot of pruning in 47, 6 %. As for the number of roots the stakes generated of low outbreaks 27, 6 roots average for plant, for on those of new shoot of pruning with 18,2. Owed to this is that the plant was selected generated of low outbreaks for the development of the second stage of investigation (micorrhizatin). On having applied IBA, 28 roots were generated for stake, against 7, 4 for not application. What would make IBA employment advisable when stakes take root of C. avellana, provided that this factor is determinant as for the later Survival of the plants. Then the micorrhizatin practises with T. melanosporum of the plants obtained across the root generation of stakes of low outbreaks, in container of 450 cc and 650 cc, and with incula of the season 2003 and 2004, results being obtained very good. Nevertheless the major container turns out to be very top as for the number of apexes micorrhizates for plant, 12.649 against 2.689. Besides 33.6 % estimates this difference in the percentage of Root tips micorrhizates for the major container and 16.1 % for that of minor size. The type of incula does not present significant differences; nevertheless, it appreciated interaction between the treatments, by what the combinations were analyzed. The major container and the incula of the season 2003 presented the best combination, 39.8 % of apexes micorrhizates, but it is not statistically different from the combination major container incula of the season 2004, 27.5 %, by what there is assumed that the relevant variable is that of the size of the container.

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4.- OBJETIVOS4.1.- OBJETIVO GENERAL Evaluar la factibilidad de multiplicacin de Corylus avellana, mediante reproduccin vegetativa por estacas, con el objeto de producir plantas factibles de inocular con Tuber melanosporum, e inocular las mismas para evaluar su posterior micorrizacin bajo condiciones controladas de invernadero 4.2.- OBJETIVOS ESPECFICOS Evaluar el enraizamiento de dos tipos de estacas de C. avellana en dos sustratos distintos, sometidas a tres concentraciones de cido indolbutrico Evaluar los niveles de micorrizacin de C. avellana bajo condiciones controladas de cultivo en invernadero, en dos tipos de contenedores, con inculo de distinta temporada y con plantas provenientes de distinto tipo de estacas.

6 5.- REVISIN BIBLIOGRAFICA 5.1.- ANTECEDENTES GENERALES DE Corylus avellana. 5.1.1.- Situacin en el pas. En Chile se denomina avellano europeo a Corylus avellana, para hacer diferencia del avellano chileno, Gevuina avellana, especie nativa ms emparentada a la macadamia. (Macadamia integrifolia). C. avellana es introducida a Chile, probablemente a mediados del siglo XIX, por inmigrantes europeos. A pesar de esto, se desconoce su presencia en el pas y por consiguiente tambin el desarrollo comercial que este tiene. Existan huertos de muy poca superficie o ejemplares aislados desde la VII a la X regiones; en estos lugares, incluso hoy en da los propietarios no conocen el cultivar de que se trata, esto porque no siempre se ha logrado produccin (Lemus, 2004). En el Catlogo del Criadero de plantas frutales de don Salvador Izquierdo, pionero de la fruticultura chilena, en la dcada de 1920 se ofreca plantas de esta especie, aunque sin especificar variedad ni origen (Lemus, 2004). El avellano se encuentra entre las regiones VII a X, en forma individual, como huertos caseros o cerco vivo (Sin embargo, ahora se estima que hay 1000 ha de este cultivo aproximadamente). Se adapta a suelos de diferente naturaleza (Carreo, 1996 citado por Cerda, 2005). Las regiones que mayor aporte daran a la produccin son la VIII y la IX. Los principales mercados externos para nuestra produccin de avellanas son los latinoamericanos. (Cerda, 2005). La incorporacin del avellano a la industria nacional es reciente, se distribuye desde la VI a la X regiones, con un total de 116 hectreas en formacin y produccin (INE 1997). A pesar de esto, en la VII Regin existen plantaciones comerciales que no figuran en las estadsticas de 1997 que superaran las 1.000 hectreas con fines agroindustriales al ao 2000. Tambin existen plantaciones en las provincias de Valdivia y Osorno, X Regin y en la provincia de Melipilla, Regin Metropolitana (Lemus, 2004). Como la mayora de las dems especies frutales, el avellano fue introducido en forma de semilla. La posterior propagacin en el pas continu de forma sexual o vegetativa. Lo anterior motiv que las plantas de avellano que existan hasta hace 10 15 aos en Chile no constituan variedades comerciales, sino un ecotipo de origen desconocido (Grau, 2002). En la dcada de los 90, una empresa europea desarroll plantaciones en la VII Regin, estas suman hoy mas de 1000 hectreas de cultivares comerciales destinados a la produccin de chocolates. (Lemus, 2004).

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5.1.2.- Aspectos Botnicos y Ecolgicos El avellano europeo pertenece al orden fagales, familia betulceae, sub-familia corylideas y gnero Corylus, al cual pertenecen alrededor de quince especies, la mayora de ellas nativas del norte de Amrica, Europa y Asia y son formas arbustivas y ocasionalmente arbreas. La nica especie cultivada extensivamente por sus frutos es Corylus avellana. Esta especie es uno de los frutales ms antiguos cultivados en Europa y fue difundido por los romanos en las regiones bajo su influencia en el siglo II despus de Cristo. (Saavedra, 1981 citado por Valenzuela, 1988.). Arbusto caducifolio, a veces arbolillo de 5-6 m de altura. Ramas de corteza lisa, pardo-rojiza; ramillas pubescentes-glandulosas. Hojas de 5-10 cm, alternas, simples, suborbiculares o anchamente ovadas, a menudo sublobadas, cuspidadas, cortamente pecioladas, de base cordada, rugosas, con los bordes doblemente aserrados, pilosas sobre todo en los nervios del envs. Flores unisexuales (monoicas); las masculinas agrupadas en amentos de 3-9 cm, pndulos, en grupos de 2-5 en la terminacin de las ramillas, cada una dispuesta en la axila de una brctea, con 4-8 estambres de filamentos bfidos que producen grandes cantidades de polen antes de que broten las hojas; las femeninas en grupos de 1-5 en la terminacin de las ramillas, incluidas en una yema escamosa de la que sobresalen los estigmas rojizos. Fruto en nuez, de 1,5 - 2 cm, globoso u ovoideo, algo picudo, de color pardo-rojizo, rodeado en la base por un involucro formado por brcteas foliceas y laciniadas. (Blanca et al, 2001; Richter y Dallwitz, 2000). C. avellana es una especie monoica. Las flores masculinas nacen en amentos cilndricos de 4 a 6 centmetros de largo (Fig1A ), de yemas laterales simples, presentan una escama trilobulada, en la que se insertan alrededor de 8 estambres en su cara interior, no presenta restos de pistilos, se observan escamas algodonosas, de color verde claro, trilobulado, y con su extremidad acuminada. (Westwood, 1982; Lemus, 2004). Las flores femeninas (Fig1B) nacen en racimos sobre yemas laterales en madera del ao anterior, situadas en posiciones terminales y reunidas en amentos muy cortos, que salen solitarios en el pice de pequeos brotes laterales, o reunidos de 2 a 4, en la base del pednculo que lleva los amentos masculinos. El cliz piloso (cpula) envuelve el ovario a modo de saco. Estas flores no tienen ptalos y aparecen solo como pequeos penachos rojos que salen de las yemas en invierno. (Westwood, 1982; Lemus, 2004).

8 El fruto (Fig1C)es un aquenio en forma de copa partida, con un pericarpio seo (cscara) y de testa lisa, casi de color canela, envolviendo por lo general a una sola semilla (abcAgro, 2005).

Figura N 1: Inflorescencias masculina (A), femeninas (B), y fruto maduro en rama (C) de C. avellana (Extrado de: www.jardin-mundani.org). Esta especie presenta un sistema radical poco profundo, largo y nudoso. Sus hojas son ms bien grandes, alternas, ovales, pecioladas, rugosas, pilosas, de color verde amarillento y doblemente aserradas (Tamaro 1953 citado por Valenzuela 1988; Lemus, 2004) El proceso de brotacin en Chile se inicia al trmino del mes de septiembre, continuando los brotes en crecimiento hasta el mes de diciembre. Sin embargo, los brotes de mayor vigor pueden crecer durante el verano. Las ramas o hijuelos que brotan desde la parte basal del fuste lo hacen en el mes de noviembre, y continan su crecimiento hasta el mes de febrero. (Saavedra 1981, citado por Valenzuela, 1988). En el invierno, ocurre la polinizacin, la que se realiza de forma anemfila. La capacidad germinativa y la viabilidad del polen difieren de acuerdo a cada variedad, esto como consecuencia de que existen granos estriles que aparecen como resultado de irregularidades durante el proceso meitico en variedades de constitucin hbrida, producido porque estas presentan incapacidad en el apareamiento cromosmico. (Saavedra 1981, citado por Valenzuela, 1988).

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El polen por lo general, no suele ser funcional para un mismo cultivar, a pesar de que es altamente germinable y viable, es decir, existe autoesterilidad. Tambin se dan casos de interesterilidad, dado que, aparentemente, existen inhibiciones del tubo polnico. (Saavedra 1981, citado por Valenzuela, 1988). La fecundacin tiene lugar al final de noviembre (Hemisferio Sur) y en general afecta a uno solo de los vulos cuando el ovario presenta un dimetro algo superior a 10 mm, despus de un periodo de espera en la base de los estilos de alrededor de cinco meses (Saavedra 1981, citado por Valenzuela, 1988). En Espaa, est presente en sitios hmedos, umbros cerca de corrientes de agua, formando parte de lo que se conoce como bosques de ribera, se encuentra asociado a chopos y lamos (Populus spp.), fresno (Fraxinus augustifolius), sauces y mimbreras (Salix spp.), zarzamora (Rubus ulmifolius), escaramujos (Rosa spp.), clemtide (Clematis vitalba) entre 1.300 y 1.700 m de altitud, preferentemente en el piso supramediterrneo (Blanca 2001)

10 5.2.-ANTECEDENTES GENERALES DE LA PROPAGACIN ASEXUAL Cuando se habla de reproduccin asexual, se referiere al tipo de reproduccin en que se utilizan partes vegetativas de una planta original o planta madre, esta se hace posible ya que cada clula de la planta presenta toda la informacin gentica necesaria para generar una nueva planta. De una clula original se pueden originar nuevas plantas, ya sea en forma adventicia o en sistemas de cultivo aspticos. A la propiedad de mantener la informacin gentica por parte de las clulas vegetativas de una planta se le llama toti-potencia. Ms especficamente, estos nuevos individuos, resultantes de la multiplicacin vegetativa de partes de los vegetales se le denomina clon, y estos mantienen las caractersticas especficas de la planta original de donde se extrajo el material vegetal. (Hartmann y Kester, 1999). El comportamiento y la apariencia que una planta tiene en el presente, su fenotipo, es resultado de la interacin del medio ambiente con su genotipo, es por esto que en las plantas de un mismo CLON pueden existir variaciones ambientales sin que cambie su genotipo.(Zobel y Talbert 1988, citado por Ramos 2004; Hartmann y Kester, 1999). La propagacin vegetativa es asexual ya que slo implica divisin celular mittica de las clulas, vale decir que es aquella donde se produce una replicacin del material gentico (o del sistema cromosmico) y del citoplasma de la clula madre a las dos clulas hijas. Esta condicin origina, posteriormente, crecimiento y diferenciacin de tejidos somticos (Hartmann y Kester, 1999). Las plantas propagadas vegetativamente, a travs de la replicacin del ADN, duplican la informacin gentica de la planta madre, por lo que las caractersticas de la planta individual se mantienen a travs del tiempo (Cabello, 2000; citado por Ramos, 2004). En fruticultura, es importante la utilizacin de tcnicas de reproduccin asexual dado que la mayora de los cultivares de plantas frutales presentan genotipos altamente heterocigotos, lo que hace que las caractersticas nicas de estas plantas se pierdan si se utiliza la propagacin por semillas (Hartmann y Kester, 1999). Las especies forestales tambin presentan un alto grado de heterocigocidad, adems de un largo ciclo de vida, lo que trae como dificultad que se requiere una gran cantidad de generaciones para lograr una real ganancia gentica, en cambio con la clonacin de individuos seleccionados y su multiplicacin vegetativa se lograr una mayor ganancia en una sola generacin. (Caso, 1992; citado por Navarro). No obstante lo anterior, en las clulas puede ocurrir cambios genticos que conduciran a cambios permanentes en partes del clon. Esta situacin requiere que el cambio gentico sea seguido por divisiones celulares en el que exista una proporcin considerable de las clulas hijas en el meristema. (Hartmann y Kester, 1999).

11 En general la reproduccin asexual es importante, dado que es posible propagar, a grado comercial y tcnico, material gentico de alto valor, asegurando gran ganancia en cuanto a la velocidad de seleccin gentica, de genotipos individuales, captura de los componentes aditivos y no aditivos de la variacin gentica, lo que posibilita la generacin de masas productivas uniformes. (Zobel y Talbert, 1988 citado por Ramos 2004; Santelices, 1998). Los mtodos ms utilizados hoy en da son: enraizamiento de estacas y acodos, injertos y cultivo de tejidos (propagacin in vitro) (Hartmann y Kester, 1999). 5.2.1.- Propagacin Vegetativa a travs de estacas Se entiende por estaca a cualquier porcin separada de la planta, que presente yemas caulinares y sea inducida a emitir races; las estacas pueden ser inducidas a enraizar estando en estado de reposo o encontrndose con hojas, si a estas se les dan las condiciones y tratamientos qumicos apropiados (Westwood, 1982). Las estacas son porciones vegetativas extradas de plantas madres. En la mayora de las especies forestales, incluidas las conferas, es posible la propagacin por estacas, sin embargo, se realiza con mayor frecuencia en las especies que presentan mayor facilidad de enraizamiento y que no requieren de equipos especiales para este fin. (Parry 1976; Weaver 1976; citados por Santelices 1998). Al propagar vegetativamente se debe cortar de una planta madre una porcin de tallo, raz u hoja, colocar esta en condiciones ambientales favorables e inducir a que enrace, obteniendo a partir de esto una planta nueva distinta de la original, pero con la mantencin de su genotipo. (Hartmann y Kester, 1999). La multiplicacin masiva por medios vegetativos no es ms barata que la multiplicacin por semilla, pero se justifica debido a la supremaca y uniformidad de clones determinados, la economa est dada por la exclusin de la etapa juvenil y por ende la disminucin del tiempo requerido para llegar a la etapa de madurez reproductiva. (Hartmann y Kester, 1999). Las estacas pueden dividirse en tres grandes grupos, de acuerdo a su origen: estacas de raz, de tallo y de hojas. De estos grupos el de estacas de tallos es el ms importante. Es el ms utilizado en el mundo para la multiplicacin de plantas forestales de todo tipo. Se usa tambin para propagar comercialmente muchos cultivos florales y especies frutales (Hartmann y Kester, 1999). A nivel prctico, es este mtodo uno de los ms utilizados, por lo que adquiere una gran importancia econmica. (Wells, 1979; citado por Ramos, 2004), ya que existe una multiplicidad de razones que justifica el uso de este mtodo; entre las que se encuentra la mantencin de clones a travs del tiempo. Esto es particularmente importante al propagar rboles frutales, ornamentales y de importancia forestal (Awad, 1993; citado por Ramos, 2004).

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5.2.1.1.- Origen de las races adventicias En primer lugar se debe sealar que las races adventicias pueden ser de dos tipos: races preformadas y races de lesin. Las primeras se desarrollan naturalmente en los tallos o ramas cuando todava estn adheridas a la planta madre, pero que no emergen sino hasta que no se corta la estaca. Las de lesin se desarrollan slo despus que se ha hecho la estaca, como respuesta al efecto de preparar la misma. (Hartmann y Kester, 1999). El origen de las races se localiza en un amplio rango de tejidos, de los cuales el cambium, el floema y el periciclo son los tejidos ms importantes, mientras que la corteza, la mdula y el xilema son de menor importancia (Haissig, 1974; Citado por, Santelices, 1998). Desde la perspectiva anatmica, la formacin de races, o rizognesis, radica en la organizacin de iniciadores radicales, estos son pequeos grupos de clulas meristemticas que continan en divisin y forman grupos de muchas clulas de pequeo tamao que se desarrollan formando nuevos primordios de raz, los que en las condiciones adecuadas comienzan su crecimiento, para posteriormente pasar a formar una estructura de pice radical. A la vez se desarrolla un nuevo sistema vascular en el primordio radical que se conecta con el adyacente ya existente, el pice crece hacia el exterior pasando por la corteza y la epidermis y apareciendo finalmente del tallo (Weaver, 1976; Baldini, 1992; citados por Navarro 2002). Hartmann y Kester, (1999) sealan que los cambios anatmicos que ocurren en el tallo al iniciarse la formacin de races pueden dividirse en cuatro etapas: 1. Desdiferenciacin de clulas maduras especficas 2. Formacin de iniciales de raz en ciertas clulas cercanas a los haces vasculares, las cuales se han vuelto meristemticas por desdiferenciacin. 3. Primordios de raz organizados desarrollados subsecuentemente a partir de las iniciales de raz. 4. Desarrollo y emergencia de estos primordios de raz hacia fuera a travs de los tejidos del tallo, ms la conexin vascular entre los primordios radicales y los tejidos conductores de la propia estaca. En la mayora de las plantas la formacin de races y de callo se desarrolla en forma independiente, cuando esto ocurre en forma simultnea es debido a su dependencia de condiciones ambientales e internas similares. Sin embargo, en algunas especies la formacin de callo aparentemente es precursor de races adventicias. (Hartmann y Kester, 1999; Priestley y Swingle, 1929; Citado por Santelices, 1998).

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5.2.1.2.- Factores que afectan el enraizamiento El proceso de rizognesis es caracterstico de todos los procesos de autoenraizamiento, incluida la propagacin por estacas, esta rizognesis depende de una serie de factores, tanto internos como externos, los que interactan de forma compleja y generan una amplia gama de efectos sobre el equilibrio metablico, el crecimiento y la diferenciacin celular. (Baldini, 1992; Gutirrez, 1995; citados por Navarro, 2002; Hartmann y Kester, 1999). Cuando se dispone a enraizar una estaca, se debe tener en cuenta que son varios los factores que hay que considerar para realizar de buena manera este proceso, estos factores se pueden dividir en tres grandes reas o grupos, estos son: Tratamientos aplicados a las estacas Caractersticas del material vegetal Condiciones ambientales

(Hermosilla, 1996; citado por Ramos, 2004; Hartmann y Kester, 1999). 5.2.1.2.1 Tratamientos aplicados a las estacas Los reguladores de crecimiento, hormonas vegetales, son compuestos, elaborados por las plantas, que controlan el crecimiento y otras funciones vitales de las mismas, estas actan en pequeas cantidades (Primo y Cuat, 1968; citado por Santelices 1998; Hartmann y Kester, 1999). A lo largo del tiempo se han sintetizado algunos compuestos capaces de inducir o acelerar la formacin de races adventicias, como lo son el cido Indolactico (IAA) y el cido indolbutrico AIB. Debido a su actividad fisiolgica se les ha denominado hormonas auxinas de sntesis, para hacer una analoga con las hormonas naturales, pero es mejor denominarlas con el nombre de reguladores de crecimiento (Hartmann y Kester, 1999). Al mezclar sustancias reguladoras de crecimiento, en las proporciones adecuadas, se obtiene un mejor comportamiento en la accin de estas. Por ejemplo, cuando en cierto nmero de especies muy diferentes se us una mezcla de partes iguales de cido indolbutrico y cido naftalenactico, se encontr que induca un mayor porcentaje de enraizamiento en las estacas y la produccin de ms races por estaca que cada material por separado (Hartmann y Kester, 1999). Por lo general, en el enraizamiento de estacas de tallo de la mayora de las especies, es muy recomendada la utilizacin de cido indolbutrico o el cido naftalenactico. La forma ms apropiada de determinar cual es el mejor para una especie

14 en particular, y en qu concentraciones se debe usar es la realizacin de pruebas empricas. (Hartmann y Kester, 1999). El AIB, es uno de los mejores estimuladores del enraizamiento, producto qumico, que presenta muy poco grado de movilidad y se mantiene cerca del sitio de la aplicacin, comparado con los reguladores de crecimiento que se desplazan con facilidad, ya que estos pueden causar crecimientos inapropiados o indeseables del material de enraizamiento. En general los reguladores de crecimiento actan modificando el tipo y el nmero de raz, el AIB produce races apropiadas para la mantencin futura de la planta. (Weaver, 1976; citado por Navarro 2002 ). Cuando la concentracin de reguladores de crecimiento, se encuentra inmediatamente por debajo del punto txico presenta un comportamiento ptimo en la promocin del enraizamiento, estas concentraciones producen un hinchamiento en la parte basal del tallo y profusa produccin de races por encima de la base de la estaca. Las concentraciones demasiado fuertes producen el efecto contrario y pueden llegar a producir, a la larga, la muerte de la estaca (Weaver, 1976; citado por Navarro 2002). Para que exista un buen enraizamiento se debe tener en cuenta que existen los denominados cofactores de las auxinas, estos en combinacin con las auxinas, permiten el desarrollo inicial de las races; los compuestos nitrogenados y los carbohidratos producidos por la parte area de la planta (hojas y tallos fotosintticos), son quizs cofactores del enraizamiento. El metabolismo puede ser inhibido o activado por compuestos fenlicos que actan sobre las enzimas. (Weaver, 1976; Baldini, 1992 citados por Navarro 2002). La multiplicacin del avellano por medio de estacas de madera blanda ha sido objeto de mayor atencin que por medio de estacas de madera dura, a pesar de que los resultados son variables, segn los autores y la localizacin de los ensayos. Sin embargo, la mayora de ellos concuerdan en que acertando la poca de recoleccin, usando sustancias rizognicas, entre las que se destacan el AIA, AIB, Y ANA, un sustrato adecuado, ligero y esponjoso, y empleando nebulizacin es posible obtener entre un 60 y un 80% de enraizamiento (Tassias y Clave, 1976; citado por Valenzuela 1988). En diferentes ensayos de propagacin vegetativa de avellano europeo citados por Valenzuela (1988), se concuerda en sealar que los mejores resultados obtenidos para esta especie se logran con una concentracin de 1.000 partes por milln de cido indolbutrico en distintos tipos de estacas. Al utilizar una mezcla de AIA 2000 ppm + AIB 2000 ppm + ANA 1000 ppm. Se logr un 74% de enraizamiento en sesenta y cinco dias para C. avellana. (Rovaresi, 1969; citado por Valenzuela 1988). Ercisli y Read, (2001), sealan que la mejor concentracin general para el enraizamiento de Avellano (C. americana X C. avellana) es 1500 ppm de AIB si se trata de madera blanda, para el caso de madera semi dura los mejores resultados se obtiene con concentraciones de 1000 y 2000 ppm, dependiendo de que genotipo se trate.

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Durante el periodo de formacin de races y el desarrollo de las mismas, las estacas estn ms vulnerables al ataque de un gran nmero de patgenos; es aconsejable protegerlas de infecciones indeseadas como las fungosas, dado que al hacerlo se conseguir una mejor calidad de la raz y una mayor supervivencia. (Halloy, 1996). La iniciacin de races adventicias seguida por la supervivencia de las estacas enraizadas constituyen dos fases diferentes. Con frecuencia las estacas forman races pero no sobreviven mucho tiempo. Durante el enraizamiento y el perodo siguiente, las estacas estn expuestas a ataques de diversos microorganismos. Los tratamientos con fungicidas prestan cierta proteccin y conducen tanto a una mayor supervivencia como a una mejor calidad de races (Hartmann y Kester, 1999). La mayora de las casos, como el material a utilizar proviene de ambientes no controlados, este presenta algn tipo de contaminacin, principalmente del tipo fngico. Por lo que resulta fundamental la desinfeccin del material de trabajo antes del tratamiento con reguladores del crecimiento (Botti, 1999 citado por Ramos, 2004). los tratamientos antes sealados, pueden utilizarse tanto en mezclas como en forma individual.(Hartmann y Kester, 1999).

16 5.2.1.2.2.- Caractersticas del material vegetal. Al arraigar estacas de cualquier especie, se debe tener en consideracin que la edad del material a propagar es un factor de gran importancia, dado que al aumentar la edad del material de propagacin, en general, debiera disminuir la capacidad de ste para enraizar (Wright, 1964; citado por Santelices; 1998; Hartman Y Kester, 1999) El rejuvenecimiento de la planta, por cualquier medio, o la mantencin de sta en la etapa juvenil, lograrn favorecer el enraizamiento de las estacas. Existe la posibilidad de que, con el paso del tiempo, se acumulen sustancias inhibidoras del enraizamiento, como por ejemplo algunos tipos de fenoles, o disminuyan algunos que favorezcan el enraizamiento (Botti, 1999; citado por Ramos 2004). . La edad de la planta madre, en plantas de difcil enraizamiento, puede ser un factor determinante. Las estacas que presentan desarrollo juvenil de crecimiento, con frecuencia forman races nuevas con mayor facilidad. (Hartman y Kester, 1999; Kramer y Koslowski, 1979 citado por Ramos 2004). Santelices (1998) basndose en las investigaciones de varios autores para algunas especies del gnero Eucalyptus, muestra que a medida que aumenta la edad del rbol madre disminuye la capacidad de rizognesis, sin embargo existen excepciones. En trabajos realizados en C. avellana, se ha demostrado la re-vigorizacin inmediata que producen las podas severas, posibilitando as el trabajo in Vitro da material adulto, as como la tasa de proliferacin y enraizamiento. (Daz-Sala et al., 1994; Rey et al., 1994a; Berros, 1996; citados por Sanchez-Olate et al, 2004). Sanchez-Olate et al (2004) muestran que existe un efecto re-vigorizante de podas severas en plantas de C.avellana . cultivadas en campo, sin embargo ste presenta una corta duracin , siendo necesario la mantencin de este tratamiento cada dos aos a fin de mantener una fuente de material con rasgos juveniles y una adecuada respuesta a la propagacin. Tambien la ubicacin de la estaca en el rbol madre es de gran importancia en el enraizamiento, dado que existira una distribucin desigual de fito hormonas y de reservas nutritivas en las diferentes partes de la planta. (Vastey, 1962; citado por Santelices, 1998). Al tener mayor cantidad de sustancias endgenas promotoras del enraizamiento, en los extremos de las ramas terminales se producira una mayor disposicin al enraizado. Adems las estacas terminales son ms juveniles, existiendo as mayor facilidad para que algunas clulas se transformen en meristemticas. (Hartmann y Kester, 1999). Estacas de brotes de un ao de C. avellana enraizaron mejor que las que provenan de chupones; y las partes basales de los cortes enraizaron mejor que los terminales dstales (Roversi, 1969; citado por Valenzuela, 1988).

17 En algunas especies las estacas extradas de las ramas terminales presentan un menor porcentaje de enraizamiento que las obtenidas de ramas laterales. A pesar de ello existe un efecto denominado topfisis, que es que la rama tienda a mantener su estado de crecimiento original, es decir, consiste en un cambio o variacin de fases de diferentes partes de la planta y cuyos meristmas perpetan esas fases en su descendencia vegetativa (MacDonald, 1986; Dirr y Heuser, 1987 citados por Ramos 2004; Hartmann y Kester, 1999). La capacidad de propagacin vegetativa est asociada con el carcter juvenil, cuanto ms joven es el ejemplar, ms rpida y fcil ser su propagacin. Este carcter juvenil persiste en las reas basales de un rbol y las ramas ms basales lo que posibilita su empleo para la multiplicacin vegetativa (Caso, 1992; citado por Navarro 2002). En estacas de tallo de Ciruelo se compar el enraizamiento de distintos tipos de estacas. Los resultados mostraron una marcada superioridad en el enraizamiento de las provenientes de ramas laterales, enraizando stas, cuando se encontraban en etapa de cese de su crecimiento activo un 35%, las laterales en crecimiento activo un 19% y las terminales solo un 10% (Hartmann y Kester, 1999) En E. camaldulensis, estacas extradas de rebrotes herbceos, de plantas que tenan entre 12 y 15 aos de edad y que fueron cortadas a 1.5 metros del suelo, enraizaron en un 70% comparado con estacas cortadas de la parte area en rboles de 10 aos de edad que no enraizaron.(Concha y Montaldi,1964; citados por Santelices 1998). Otro factor es la presencia de hojas, ya que es determinante en el proceso de rizognesis, stas pueden ocasionar desecacin en las estacas, debido al aumento de la transpiracin, y por lo tanto su muerte, sin embargo es importante considerar que las hojas sintetizan hormonas que podran contribuir al desarrollo de las races. (Santelices 1998). Para que las estacas no se sequen se suele reducir la cantidad de hojas que estas presentan, con el objetivo que no transpiren, aunque una estaca sin hojas podra no disponer de la energa necesaria para generar races (Montoya y Camara, 1996). En enraizamiento de estacas de T. scleroxylon, se obtuvo un arraigamiento que super el 80% con estacas en que su rea foliar era de 10 y 50 cms2, y en aquellas que tenan 100 cm2 fue de 65%. Se observ tambin que transcurridas 6 semanas con todos los tratamientos ensayados se produjo un incremento en el peso seco de las estacas. (Leakey Y Coutts, 1989; Citado por Santelices, 1998).

18 A pesar de que las hojas en las estacas constituyen un fuerte estmulo para la iniciacin de races, la prdida de agua por stas puede reducir el contenido de agua en las estacas, a un nivel tal, que ocasione su muerte antes de que pueda efectuarse la formacin de races. (Hartmann y Kester, 1999). El material a utilizar puede ser muy variado, desde ramas terminales hasta grandes estacas de madera dura de varios aos. Por consiguiente existirn diferencias entre los tipos de estacas en cuanto a su enraizamiento, por ejemplo. Tambin si la madera es floral o vegetativa, dndose, en apariencia un cierto grado de antagonismo entre la regeneracin vegetativa y la etapa de floracin de las plantas (Hartmann Y Kester, 1999). En algunas especies, la poca de recoleccin es de vital importancia en el desarrollo del enraizamiento dndose sto especialmente en estacas verdes, de madera blanda, las que generalmente debieran extraerse en primavera o verano. (Botii, 1999; Citado por Ramos 2002). Al recolectar estacas en primavera, muchas especies de difcil enraizamiento presentan mejores resultados, sin embargo se debe considerar que cada especie presenta un periodo ptimo de recoleccin del material y se debe investigar, en el caso de las especies de difcil enraizamiento, cual ser el periodo ms adecuado. (Hartmann y Kester 1999; Botti, 1999 citado por Navarro 2002). Es importante considerar el contenido de agua del material vegetal, ya que se reducir la capacidad de enraizamiento de las estacas si el material a propagar no est turgente, adems la nutricin de la planta ejercera una gran influencia en el desarrollo futuro de las races, siendo ms favorable el bajo contenido de nitrgeno y el alto contenido de carbohidratos. (Hartmann y Kester, 1999). Otro factor que puede influir en el desarrollo de las races en una estaca es el tamao de sta, en algunos casos se establece que las estacas de mayor tamao, presentaran mejor capacidad de enraizamiento que las de menor tamao (Melchior y Quijada, 1972; Baggio, 1982; citados por Santelices 1998). Al propagar C. avellana en condiciones controladas de invernadero y con estacas de madera blanda, se evalu el efecto de tres fechas de colecta sobre el desarrollo radical de estacas de madera blanda, las fechas fueron: 30.12.87, 28.01.88, 14.03.88. La fecha de estaquillado significativamente menos efectiva fue el 14 de marzo debido a un aumento de cido abscsico e inhibidores fenlicos, los que estn ligados a la evolucin de las yemas. (Medel et al., 1989; citado por Navarro2002).

19 5.2.1.2.3.- Condiciones ambientales. 5.2.1.2.3.1.- Medio de enraizamiento. . El medio en el que se desarrollarn las estacas presenta una gran importancia en cuanto a las caractersticas de las races que se originarn, y debe tener caractersticas que permitan reducir al mximo el estrs hdrico de las estacas.(Santelices, 1998). Para el xito del enraizamiento, el sustrato de propagacin debe cumplir con tres funciones bsicas que harn culminar con xito el proceso, estas son: Servir de sostn para las estacas durante el proceso Entregar humedad a las estacas y mantener la humedad del medio Permitir el ingreso de aire a la base de las estacas.

Cuando un medio de enraizamiento permanece bien drenado, est libre de organismos patgenos, tiene una gran capacidad de retencin de agua, y presenta una apropiada porosidad, se puede decir que es ideal para el enraizamiento. Las races desarrolladas en mezclas de arena, de arena y musgo turboso, o de perlita y musgo turboso, son mas ramificadas, delgadas y flexibles, por lo tanto, ms apropiadas para el transplante. No as las que se desarrollan en arena, que son por lo general mas quebradizas y gruesas. (Hartmann y Kester, 1999). Para evitar que se produzcan estancamientos hdricos perjudiciales para la estaca, el medio de enrace debe estar en buena condicin de drenado, adems de tener una buena aireacin y suficiente porosidad, con el fin de permitir el intercambio gaseoso, optimizando de esta forma las condiciones para obtener un buen desarrollo radical. (Baldini, 1992; citado por Navarro 2002). El sustrato debe contener un escaso porcentaje de materia orgnica, los mejores resultados generalmente se han obtenido con el empleo de una mezcla de perlita y vermiculita en proporcin de 2:1 1:1, pero su costo es demasiado elevado (Sandoval, 1997; Botti, 1999, citados por Ramos 2004). Las races se forman rpidamente cuando se est en presencia de un sustrato ligero, suelto, esterilizado, de temperatura templada y de humedad continua pero no excesiva, ya que la falta de oxigeno es perjudicial. Los medios ms convenientes son la arena fina, la vermiculita y la turba. (Wright, 1964; citado por Santelices, 1998) Un sustrato tambin debe tener un pH adecuado, en general es preferible un pH neutro, ya que se ha comprobado que un pH cido disminuye el enraizamiento de algunas especies. (Hartmann y Kester, 1999). Torres y Contreras, (1990) citados por Seplveda (2004), en un estudio realizado en C. avellana sealan que hijuelos no enraizados, se trozan en tres tipos de estacas,

20 (apical media y basal), se colocan en invernadero utilizando como sustrato una mezcla de tierra mas aserrn previamente esterilizado. Ercisli y Read, (2001) utilizan como sustrato para el enraizamiento de distintos genotipos de Avellano (C. americana X C. avellana) una mezcla de perlita y vermiculita en partes iguales y colocados bajo invernadero. 5.2.1.2.3.2.- Humedad Las condiciones de humedad y de temperatura son muy importantes para el desarrollo de las races, por lo que resulta fundamental controlarlas, mantenindolas dentro de los rangos adecuados (Botti, 1999; citado por Ramos 2004). La evapotranspiracin aumentar si se mantiene las estacas en un medio atmosfrico seco, y por consiguiente se desecarn, lo que podra provocar su muerte. Lgicamente entonces, es imperativo mantener una humedad relativa del aire alta, en el comienzo del desarrollo radicular de las estacas, para evitar la desecacin y el marchitamiento de los propgulos. (Oosting, 1951; citado por Santelices 1998). En las estacas, se ha interrumpido la provisin natural de agua de las races a las hojas, pero estas todava transpiran. En estacas de especies que enrazan con facilidad, la formacin rpida de races permite que la absorcin de agua compense la que es removida por las hojas, pero en especies de difcil enraizamiento, las prdidas de agua debe tratar de reducirse de tal forma de mantener viva a la estaca hasta que logre enraizar. Para ello se debe reducir al mnimo la transpiracin de las hojas, sto se consigue manteniendo la presin de vapor del agua que circunda a la hoja casi igual a la que se encuentra en los espacios intercelulares. (Hartmann y Kester, 1999). Al mantener las estacas en un medio controlado de humedad se mantiene el equilibrio hdrico, permitiendo de esta forma, una larga supervivencia de las estacas, para esto se puede regar las estacas en forma intermitente con agua aerosolizada, tanto para la mantencin de la transpiracin como para el control de la temperatura interna (Baldini, 1992 citado por Navarro 2002). En la familia de las fagceas, que se consideran especies difciles de enraizar, existen experiencias que establecen la importancia de mantener una alta humedad relativa. En la propagacin de N. Alpina en invernadero se utiliz para este fin un sistema de riego en forma de niebla. (Becker y Dautzenberg, 1978; citado por Santelices 1998).

21 5.2.1.2.3.3.- Temperatura La temperatura ambiental en que se desarrollan las estacas influye fuertemente en el proceso de enraizamiento, a medida que esta aumente, tambin aumentan los procesos fisiolgicos y por consiguiente se produce un agotamiento de las reservas del material vegetal. Para cada especie, la temperatura ambiental en que enrazan las estacas es distinta, pero en general, el rango se encuentra entre 21 y 27 C. La temperatura nocturna ideal debe estar alrededor de los 15 C (Hartmann y Kester, 1999). La temperatura acta tambin en la respiracin celular, al aumentar sta aumenta la actividad celular en menor proporcin que la respiracin, por lo que se produce un mayor consumo de energa y una disminucin de la ganancia diaria del material fotosinttico, lo producira un debilitamiento del material vegetal si esta situacin se prolonga por mucho tiempo, pudiendo causar la muerte. (Meyer, 1976; citado por Valenzuela, 1988) La utilizacin de camas calientes de enraizado, puede ser determinante en el aumento de la capacidad de formacin de races. Si se logra mantener una temperatura ms alta en la base de las estacas, se producir un aumento localizado de la respiracin, lo que en teora, lograra una sntesis de carbohidratos y, a continuacin, una vigorosa formacin de protoplasma. De esta manera se cree que se forman las condiciones primordiales para las divisiones celulares en el sector de la raz y la aparicin de races adventicias. Con un rango adecuado de temperatura, es posible adems de la formacin de races, que se generen un mayor nmero de stas. (Krussmann, 1981; citado por Santelices; 1998) Un alto nmero de especies logran un mayor nmero de races en menor tiempo al elevar la temperatura del sustrato, mantenindose esta entre 25 y 28 C en los primeros 20 das, para posteriormente bajarla a entre 18 y 20 C. Esto es vital para el proceso de enraizamiento en algunas especies vegetales (Botti, 1999; citado por Ramos 2004). En algunas especies bastara con proteger las estacas de la radiacin directa del sol. En otras, se requiere que el enraizado se realice en condiciones controladas de invernadero (Vastey, 1962; Citado por Santelices, 1998). Las condiciones micro ambientales deben ser reguladas para favorecer la rizognesis, de acuerdo con las variaciones del cuadro fisiolgico y nutricional de las estacas tratadas (Baldini, 1992; Citado por Navarro 2002). En el arraigamiento de estacas de D. Winteri, el empleo de camas calientes no slo incentiva la formacin de un mayor nmero de races, sino que stas son de mayor longitud .En el arraigamiento de estacas de especies del gnero Nothofagus, se ha usado como factor constante una temperatura de 21 C en la base de ellas (Santelices 1998).

22 5.2.1.2.3.4.- Luz. La luminosidad en que se desarrollan las estacas es un factor primordial, dado que es la fuente de energa para la realizacin de la fotosntesis, los productos de sta son utilizados en el desarrollo y crecimiento de las nuevas races, esto se afecta debido a la intensidad (radiancia), al fotoperodo (longitud del da) y a la calidad de luz. Estos efectos pueden ser ejercidos ya sea en las plantas madres de las que se toma el material o en las estacas mismas durante el proceso de enraizamiento (Dirr y Heuser, 1987 citado por Ramos 2004; Hartmann y Kester, 1999). Es necesario dosificar la cantidad de luz segn la especie de la que se trate. La luz fomenta el enraizamiento al actuar sobre las hojas verdes, sin embargo es un inhibidor si se est presente en los sectores iniciadores de las races. Una luminosidad baja tiende a producir races antes que la produccin de hojas, esto disminuir la evaporacin de agua presente en las estacas y por consiguiente, mantendr a sta turgente. La carencia de luz bloquea la funcin fotosinttica que se necesita para el desarrollo de la planta. Exceso de luz provocar un aumento en la temperatura, lo que producir una disminucin en el porcentaje de enraizamiento, el porcentaje adecuado ser de un mnimo de 30%. (Cuculiza, 1995; Vastey, 1962; citados por Santelices, 1998). Existen en los vegetales, mecanismos que pueden percibir la composicin, duracin e intensidad de la luz, e influir en la actividad de las plantas, de tal manera que su funcionamiento se hace dependiente del momento del da. Fotomorfognesis comprende todos los procesos dependientes de la luz, distintos de la fotosntesis, y que intervienen en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Los procesos fotomorfognicos, jugando un papel regulador, intervienen en el control de la forma y momento de la utilizacin de los productos de la fotosntesis, influyendo el tamao, la forma y la composicin de los distintos rganos, as como el momento en que algunos rganos comienzan o dejan de ser formados (Sivori, 1980 citado por Navarro 2002). La disponibilidad de luz a lo largo del da modificar notablemente los resultados del eraizamiento cuando se trate de estacas de madera blanda. En el cultivar de mora Black Satin, propagado por esquejes de nudo, que se realiz en verano y en otoo, y donde no se control el largo del da, y disponiendo de luz natural, se obtuvo mejores resultados en verano. (Medel y Pessot, 1992; citados por Navarro, 2002).

23 5.3.- ANTECEDENTES GENERALES DE Tuber melanosporum. 5.3.1.-Tipos De Trufas. Hasta la fecha en Europa se han encontrado veintiuna especies diferentes del gnero Tuber. Solamente unas pocas son apreciadas desde el punto de vista gastronmico. Las de mayor valor comercial son las tres siguientes: Tuber melanosporum Vitt. = (Tuber nigrum Bull) Es la llamada trufa negra o de Perigord, la ms apreciada en Espaa y Francia y el motivo de este estudio. ( Figura 2 A). Tuber brumale Vitt. Es una trufa negra muy similar a la anterior pero de inferior calidad y precio. Se recolecta junto a T. nigrum en Europa. Para su correcta separacin hay que adquirir experiencia. ( Figura 2 B). Tuber magnatum Pic. Es la trufa blanca de Italia y la que alcanza los precios ms elevados en el mercado. ( Figura 2 C).

Figura N2: Tuber melanosporum Vitt (A), Tuber brumale Vitt. (B), Tuber magnatum Pic (C). Extrado y modificado de: www.infoagro.com. La trufa negra (Tuber melanosporum Vitt = T. nigrum Bull.) es un hongo hipgeo, es decir que sus carprforos o cuerpos fructferos se desarrollan bajo tierra viviendo siempre asociado a rboles y arbustos mediante una forma de simbiosis en las races de stos, denominada micorriza. (Reyna, 1992). Esta tiene forma de tubrculo irregular, mas o menos redondeado, de 3 a 6 cm. y un peso variable de 20 a 200 gr.; en realidad su aspecto y tamao dependen de la poca del ao. La carne es consistente y blanquecina al principio, luego gris-pardusca, y al madurar, negro-violcea; al realizar un corte se aprecian finas venitas, sinuosas labernticas y que enrojecen algo al contacto con el aire. (Garca 1991).

24 Las trufa negra se clasifica de la siguiente forma: Reino: Fungi Divisin: Ascomycota Subclase: Pezizomycetidae Clase: Ascomisetes Orden: Pezizales Familia: Tuberaceaes Gnero: Tuber

CABI BIOSCIENCE DATABASES, 2006, Clasificacin basada en la novena edicin de Diccionary of the Fungi Tuber melanosporum, es en primavera menor que una avellana y de color rojo violceo; en verano, cuando ya ha crecido algo, es pardo oscuro; al final del otoo comienza a madurar y se va poniendo marrn negruzco con manchas herrumbrosas y luego negro, con la superficie cubierta de verrugas. Desde el punto de vista morfolgico la trufa consta de las siguientes partes: Peridio. Es la cscara o corteza de la trufa; est formada por pequeas y apretadas verrugas piramidales de color negro. Estos salientes, de 3-4 mm de dimetro, son bajos, con 4-6 caras o facetas poligonales, con el extremo truncado o hundido, pero slo se ven despus de quitar bien la tierra que el hongo tiene adherida. Gleba. Esta masa interior cuando la trufa madura tiene un color negro violceo. Est surcada por una serie de finas venas blanco cremosas. En la gleba se encuentran las esporas. Entre la trufa y las races del rbol simbionte existe una masa de filamentos microscpicos (hifas y micelio del hongo) que sirven de enlace entre ambos organismos. Estos filamentos slo son visibles a simple vista en los lugares en donde se agrupan fuertemente, como por ejemplo en los puntos de unin con las raicillas de las plantas simbiontes (Ectomicorrizas).

Extrado de: www.infoagro.com. Caracteres morfolgicos: Se trata de una micorriza simple o con ramificaciones de tipo monopdico, pinnado, o piramidal, de pices redondeados. (Etayo, y De Miguel, 1998). Color: marrn ocrceo, mbar oscuro en fase de crecimiento, el color es ms claro siendo el pice blanquecino, si observamos una micorriza muy vieja, el color es casi negro y opaco, no dejando pasar la luz a su travs, y por lo tanto no permitiendo observar el diseo de la micoclena. (Etayo, y de Miguel, 1998).

25 Superficie de la micoclena: presenta una cubierta de puzzle bien definida, la micoclena es pluriestratificada con estructura pseudo parenquimatosa con clulas epidermoides. (Etayo, y de Miguel, 1998). Ornamentacin: presenta unas espnulas o cistidios amarillentos, alargados y ramificados en ngulo recto pluriceptados. El pice de estas espinas es redondeado. (Etayo, y de Miguel, 1998).

Figura N3: micorrizas de Tuber melanosporum pertenecientes al ensayo. Grupo de micorrizas (3 A), detalle de Cistidios (3 B), micorriza solitaria (3 C). El color distinto se debe nicamente al tipo de luz empleada al tomar la fotografia. T. melanosporum es una micorriza carnosa, beige cuando joven, pardo oscura a negra al envejecer. Presenta una cubierta de puzzle y un micelio que emerge de la micorriza con ramificaciones en ngulo recto: pelos poco abundantes ramificados perpendicularmente. El estudio de cortes revela la penetracin del micelio entre las clulas de la raz dando origen a la red de Harting, a travs de la cual se efecta el intercambio planta-hongo. En corte longitudinal, se observa la penetracin del micelio entre las clulas corticales oblicuamente respecto al eje principal de la raz (De Miguel, y Sez, 1997). La micorriza (del griego mykes que significa hongo y rhiza que es raz), es una simbiosis mutualista y beneficiosa que se establece entre un hongo y las races de un rbol. La palabra micorriza se usa para designar las estructuras compuestas por hifas fngicas y tejidos de la raz de las plantas como pinaceas, fagaceas, cupressaceas, gramneas, leguminosas, etc. Puede aseverarse y establecerse que todas las plantas estn micorrizadas, las que no lo estn son la excepcin a la regla (Castillo, 1987).

26 El trmino simbiosis, relacionado con interaccin, se refiere a la convivencia entre dos organismos de diferentes especies, y en este sentido se incluye los conceptos de parasitismo, comensalismo y mutualismo. En trminos mas estrictos es un sinnimo de mutualismo, es decir, es una relacin favorable para ambos simbiontes (Donoso, 1981). A menudo las micorrizas se agrupan en glomrulos de hasta ms de 1 cm hacia el final de las raicillas, esta asociacin es simbitica, es decir favorece al rbol y al hongo que seguramente intercambian sustancias nutritivas. (Garca, 1991). La trufa vive en necesaria simbiosis con especies forestales (encinas, robles,), de modo que para realizar una plantacin se parte de encinas o robles preparados en viveros especializados, que son portadores del hongo en la raz. La palabra correcta es "plantn micorrizado", ya que la micorriza es el rgano mixto que comparten ambos seres vivos: planta y hongo. En ella se materializa la simbiosis y son las micorrizas de las races las responsables de que con el paso de los aos la plantacin produzca trufas. (Casas, 2002). Desde el punto de vista anatmico se puede diferenciar dos tipos de micorrizas: -Endomicorrizas, tpicas de arbustos y herbceas. -Ectomicorrizas, tpicas de rboles y arbustos. La asociacin ectomicorrzica ocurre en cerca del 10 % de la flora mundial. Se encuentran en Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae. Se estima, a nivel mundial, que sobre 5000 especies de hongos pueden formar ectomicorrizas en unas 2000 especies de plantas leosas. Los hongos ectomicorrzicos son simbiontes obligados, por lo que no puede completar su ciclo vital sin los carbonos procesados de las plantas huspedes, en este sentido no pueden crecer como saprfitos en el suelo, por lo que sus esporas e hifas resistentes pueden sobrevivir largo tiempo sin planta hospedadora (Marx, Marrs and Cordell, 2000 citado por Venegas 2003). 5.3.2.- Efectos de la aplicacin de micorrizas seleccionadas para el desarrollo forestal. Aumento de la vigorosidad, tienden a absorber y acumular en el manto numerosos elementos como son nitrgeno, fsforo, potasio y calcio entre otros. (Castillo, 1987). Las Ectomicorrizas incrementan la tolerancia de los rboles a la sequa, a las altas temperaturas del suelo, a las toxinas y los pH extremos.(Castillo, 1987). Confiere a la planta un mejor sistema de defensa contra enfermedades al estar mejor nutrida, adems debido a la capa biolgica de proteccin constituda por el manto fngico que proporciona una barrera a los agentes patgenos,

27 especficamente en el caso de la trufa la produccin de ciertos agentes alelopticos, que evita la competencia de otras especies vegetales. (Reyna,2000). Restauracin de la flora fngica: La ausencia de las especies caractersticas de cada comunidad puede implicar riesgos para el buen funcionamiento del bosque. Esto es interesante en zonas donde se quiera recuperar cultivos abandonados, donde el tratamiento de la tierra o los monocultivos hayan desplazado la flora edfica primigenia. Se pueden introducir inculos con las diferentes especies caractersticas de una zona para as potenciar su presencia y, de esta manera, facilitar la micorrizacin y por lo tanto la supervivencia de las especies forestales. Mejora las propiedades fisico-qumicas del suelo, como por ejemplo la textura y estructura (Etayo, y de Miguel, 1998). Reduccin de la respiracin radical, lo que en opinin de varios autores, hace aumentar la vida de las races (Peuelas Y Ocaas1996).

5.3.3.- Factores Que Afectan a Las Micorrizas. Segn (Montoya y Camara 1996):. Falta de aireacin: se desarrollan mejor sobre sustratos porosos o texturas arenosas Exceso de humedad :el drenaje debe estar asegurado, pues al ser las micorrizas hongos aerobios los encharcamientos son negativos para ellas Temperaturas extremas del suelo: las temperaturas en que se desarrollan est comprendida entre los 6-35C ,dependiendo de la altitud y la orientacin Nutrientes en el suelo: cantidades importantes de fsforo y nitrgeno en el sustrato inciden negativamente en el grado de micorrizacin Basisidad: son preferibles los pH cidos; aun as las micorrizas se desarrollan en un amplio abanico de pH Fitocidas: deben ser evitados, el empleo de las mismas en cantidades elevadas, conlleva una inhibicin del desarrollo miceliar Laboreo (alteracin del perfil):especialmente dainos resultan los laboreos muy profundos Iluminacin: se debe garantizar la oscuridad a los sistemas radicales.

28 5.3.4.- Geografa, clima y suelo. No es normal que la trufa se produzca por debajo de los 700 metrosde altitud La optima est comprendida de los 700 a 1400 metros sobre el nivel del mar. (Reyna,2000). En Espaa se suele encontrar siempre por encima de los 600 m, siendo normal que en las zonas mas sureas de su distribucin, las mejores truferas se siten en el entorno de los 1000 m. La pendiente ptima para la trufera es inferior al 10% y la orientacin sur, suroeste, en Espaa, ya que necesita insolacin en el suelo (Reyna, 1992). El clima es un factor muy importante a considerar, es importante tener en cuenta la precipitacin anual que debe ser de 600-900 mm. Las primaveras no han de ser secas para favorecer el desarrollo de primordios. (Bardet y Fresquet, 1995 citado por Reyna, 2000). La trufa prefiere climas mediterrneos de marcada estacionalidad y es capaz de soportar extremos rigurosos (Bonet y Colinas 1999). Los suelos mas convenientes han de ser frescos pero permeables, es decir que drenen bien, por eso van bien los francos algo arcillosos, granulosos y con un porcentaje grande de piedras y cascajos pequeos. No conviene que sean profundos, ni que se sequen rpidamente deben ser alcalinos o neutros, por lo que interesan los calcreos (se habla de un pH algo superior a 7,6) su contenido en materia orgnica debe ser bajo (menos de 7%) y la relacin carbono /nitrgeno de alrededor de 10.(Garca, 1991). La trufa se desarrolla sobre suelos calcreos de 10-40 cm de profundidad del tipo rendzina, calcosoles y calcisoles (Bonet y Colinas 1999). El calcio es el primer factor limitante de la distribucin de la trufa, un valor recomendable de calcio flucta en 20-30 M.e.q de Ca /100g de suelo (Reyna, 1992).

29 5.3.5.- Resumen. En la Tabla N1 se sealan las Caractersticas de los terrenos recomendados para el cultivo de trufa negra. Fuente: Bonet J. y Colinas C. 2000 . CONDICIONES PARMETRO Cond. Geogrficas Altitud RANGO 300-1500 metros

Orientacin Oeste y Sur Cond. Climticas Pluviometra 400-900 mm/ao T media anual 11 - 14C T mx. del mes ms clido 23 - 32C T med. del mes ms clido 20 - 22C T min. del mes ms fro -2C - -6C T med. del mes ms fro > 2C T mxima absoluta 35 - 42C T mnima absoluta -9C - -25C Cond. Geolgicas Secundario-Mesozoico Cond. pH 7,5 - 8,5 Edafolgicas Materia orgnica oxidable (%) 1,5 - 8 Calcio intercambiable (% > 0,5 xido clcico) Carbonato clcico equivalente 10 - 75 (%) Nitrgeno (Kjeldahl) (%) 0,1 - 0,3 Fsforo (Olsen) (ppm) 12 18 Magnesio intercambiable > 100 (ppm) Textura Equilibrada Estructura Granulosagrumosa Tabla N1

30 5.4.- CICLO BIOLGICO DE LA TRUFA El conocimiento del ciclo biolgico de la trufa negra es de una importancia vital para poder tomar decisiones referentes a los mtodos culturales de las plantas micorrizadas e influir positivamente en el desarrollo de la simbiosis. (Palazn, et al, 2004) De acuerdo a Reyna (2000) La trufa una vez plenamente madura (mediados del invierno hasta principios de la primavera), debe liberar las esporas que encierra. Su aroma atrae a numerosos animales e insectos que se encargan de diseminar las esporas. Al final del verano comienzan a diferenciarse las esporas. A medida que prosigue la maduracin se produce la emisin de aromas que son mximos cuando la trufa est completamente madura y sus esporas son viables para germinar (Palazn, et al, 2004). Por una va u otra las esporas, liberadas de las ascas han alcanzado el suelo. Cuando alcanzan la temperatura y humedad adecuada (en primavera) la espora comienza a germinar emitiendo un finsimo filamento de micelio que se ramifica rpidamente. (Reyna, 2000). Para Infectar las races, el filamento miceliar emitido por la espora se introduce y explora el suelo, en busca de raicillas, cuando lo hace se forma la micorriza. A partir de este momento, el micelio crece recubriendo externamente a la raz y penetra a travs de las clulas corticales (Etayo y de Miguel, 1998). El micelio se desarrolla penetrando en el interior para formar el retculo de Harting y formando externamente el manto del que parten nuevas hifas para propagar la infeccin hacia races prximas. (Reyna, 2000). A partir de las micorrizas primarias el micelio comienza a colonizar el suelo, encontrando en su desarrollo nuevas raicillas y formando raicillas secundarias (Infeccin Secundaria), en ciertas zonas del sistema radical la infeccin micorricica provoca una abundante divisin radicular y un apelotamiento o glomrulo de micorrizas bastante compacto. (Reyna, 1992). En primavera, parte de los filamentos miceliares empiezan a especializarse, agrupndose y compactndose hasta dar lugar a la formacin de un pequeo ncleo o primordio de la futura trufa. (Reyna, 2000). A finales de la primavera o principios del verano se da comienzo a una fase saproftica en la trufa, el carpforo se independiza de las micorrizas y vive a partir de las sustancias orgnicas del suelo. En esta fase se produce un engrosamiento considerable de la trufa y es necesario una cierta cantidad de lluvia para que los carpforos lleguen a buen fin. El ciclo de formacin de las trufas tiene una duracin de 8 meses desde que comienzan a formarse los primordios iniciales hasta que madura plenamente. (Palazn, et al, 2004).

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5.4.1.- Etapas del ciclo de T melanosporum 1. En primavera se produce la germinacin de las esporas, expansin del micelio y del sistema radical de la planta micorrizada, reinfectacin de races por el hongo y una gran actividad metablica de las micorrizas. 2. En verano existe una formacin de los primordios fngicos y un engrosamiento de los mismos. 3. En otoo se disminuye la actividad metablica del hongo, desaparicin de micorrizas y las trufas adquieren el tamao y forma definitivas. 4. En invierno se detiene la actividad metablica, madura la trufa y se recolecta entre noviembre y marzo. Extraido y modificado de: www.infoagro.com 5.5.- TCNICAS DE MICORRIZACIN La micorrizacin de plantas realizada en invernadero, es una micorrizacin controlada en donde se intenta reproducir al mximo lo que ocurre en la naturaleza. Bsicamente se trata de poner en contacto un inculo a base de esporas de T melanosporum con el sistema radical de una plntula, de la manera ms eficaz posible (Palazn, et al, 2004). La inoculacin de micorrizas es una tcnica ms del profersional forestal, para cultivar mejores plantas y/o colonizar mejores terrenos, pero sta debe ser flexible, pues al ser una simbiosis puede que no funcione bien cualquier combinacin , tampoco una combinacin vlida para un lugar lo es para otro, aunque tengan parecidos requerimientos ecolgicos. De aqu que los programas de inoculacin se justifican econmicamente, siempre y cuando la flora local sea inexistente, se encuentre fuertemente degradada, quieran introducir especies exticas, y/o se busque productividades basadas en los cuerpos de fructificacin de determinadas especies de hongos.( Peuelas, y Ocaa, 1996). Inoculacin del suelo se basa simplemente en tomar suelo bajo rboles huspedes de Ectomicorrizas, este suelo o inculo bruto contiene propgulos de todo tipo de esporas, micelios rizomorfos, cordones miceliares, esclerocios y trocitos de races micorrizadas (Peuelas, Y Ocaa, 1996). Para Inoculacin con plantas micorrizadas se procede a colocar las plantas micorrizadas a espacios regulares dentro del vivero. Se obtiene una micorrizacin muy lenta comparado con otros mtodos, adems de ser poco homognea ; se desconoce la identidad del o los hongos micorrizantes y al igual que el mtodo de inoculacin con suelo forestal, es posible introducir agentes fitopatgenos en el vivero (Vergara, 1997 citado por Carrasco, 1998).

32 La inoculacin mediante esporas se trata de suspensiones de esporas en agua destilada estril, estas se obtienen a partir de los cuerpos de fructificacin de los hongos, o dejando que estos las liberen y recogindolas a continuacin, o bien triturando en agua los carprforos maduros trozados (Peuelas, Y Ocaa, 1996). La Inculacion miceliar, Tambin llamada inoculacin vegetativa, es el ms efectivo y seguro mtodo de cuantos sistemas existe, pero al mismo tiempo es el ms costoso y complicado. Su aplicacin implica conocimientos e instalaciones especficas, el inculo se puede obtener de varias fuentes; por aislamiento y cultivo de tejidos fngicos extrados directamente de los carprforos, por germinacin in Vitro de esporas o por cultivo de micelio a partir de las propias estructuras micorrcicas (Peuelas, y Ocaa, 1996). 5.5.1- Tcnicas De Inoculacin De Tuber melanosporum. La Inoculacin por espolvoreo es una tecnica que permite ajustar la dosis al valor deseado de un modo exacto, utilizndose generalmente dosis de inculo desde 0,5 hasta 2 g/planta, a raz desnuda este inculo se logra mezclando trufa en polvo con talco inerte, (hidrosilicato de magnesio y de hierro) (Cartie, 1999). Otro caso es la inoculacin por inmersin, donde se sumerge el sistema radical en la suspensin esporfera agregndole algn aditivo lquido como alginatos. Para espesar la suspensin y hacerla mas adherente Para este procedimiento es fundamental utilizar trufa bien madura, incluso casi podrida, siendo necesario entre 1 a 3 g de trufa por planta;(Reyna, 2000). La inoculacin por inyeccin, va muy relacionada con el tipo de contenedor utilizado y consiste en preparar, a partir de los carpforos, una suspensin acuosa para luego poderla incorporar, mediante inyeccin, en uno o varios pisos o zonas del contenedor una vez trasplantada la planta. (Palazn, et al 2004). Garca, (1991) explica que la inoculacin de semillas se basa en infectar con esporas de T. melanosporum las semillas de alguna especie que normalmente micorrice con ella, el proceso es muy simple, se echan a un recipiente con agua (ojal hermtico y previamente desinfectado) trufas muy maduras , al cabo de unos das es de suponer que las esporas de trufas abundarn en el agua por lo que se sumergen en ella las bellotas y se dejan all unos das, a continuacin se siembran las bellotas inoculadas en tierra esterilizada en macetas bajo invernadero. Algunos investigadores aconsejan inocular la tierra estril con la suspensin de esporas en invierno, y despus cuando llega la primavera plantar en macetas que la contengan, las plantitas que se obtuvieron, germinando la bellotas aparte en un medio estril, o en soluciones nutritivas del tipo hidropnico (por ejem. vermiculita, a 10-15 C) todo bajo cubierto, para evitar la contaminacin por otros hongos o microorganismos que puedan competir o atacar al cultivo (Garca, 1991).

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Las ventajas e inconvenientes de los mtodos descritos pueden ser relativos y, en muchos casos subjetivos, por lo que la eleccin de uno u otro puede ir relacionado con las aptitudes, las instalaciones existentes o simplemente los gustos y las apetencias personales. A pesar de todo, conviene resaltar que la inoculacin por inmersin sera la nica incapaz de dosificar el inculo, dado que la cantidad del mismo retenida por las races va en funcin del desarrollo de su cabellera radical, siendo variable para cada planta. (Palazn, et al 2004). 5.5.2- Principales Especies Simbiontes de T. Melanosporum. Son muchas las especies susceptibles de micorrizacin por T. Melanosporum ; roble, encina, pino, cedro, haya, castao, cisto, avellano, tilo, etc.- la consolidacin de la simbiosis a pleno campo y, lo que es ms importante, la recoleccin de la trufa con el paso de los aos, se produce fundamentalmente con la encina, el roble y el avellano. En la actualidad, los problemas de contaminacin de este ltimo, unidos a un ciclo de produccin ms corto, han motivado que las especies micorrizadas con T. Melanosporum estn comprendidas por la encina y el roble. (Palazn et al, 2004). En Espaa a pesar de que se ha conseguido obtener plantas mediante multiplicacin vegetativa a partir de plantas madre o cultivo in Vitro, lo cierto es que las bellotas constituyen el material vegetal de partida en casi todas las empresas comerciales productoras, quienes seleccionan dicho material segn la procedencia y las caractersticas productoras de los rboles y de las zonas consideradas como truferas (Palazn et al, 2004). La encina constituye el husped preferido y el ms utilizado en el momento actual por las Empresas tanto en Espaa como en Francia dedicadas a la produccin de planta micorrizada con trufa negra (Palazn et al, 2004). 5.5.3- Especies Potenciales Presentes En Chile En Chile se describen una gran cantidad de especies posibles de inocular con T Melanosporum, sin embargo, lo concreto para el pais es lo desarrollado por el proyecto de truficultura de la Universidad Catolica del Maule, cuyas especies potenciales se mencionan a continuacin (Tabla N 2), cabe hacer notar la incorporacin de especies nativas lo que presenta un gran avance en la truficultura nacional.

34 Tabla N 2 Especies de simbiontes Potenciales Presentes En Chile NOMBRE COMN Encinos Avellano europeo Tilos Alamos Castaos Eucaliptos Pinos Sauces Robles * * especies nativas Fuente: proyecto FIA CO1-1-A-085 NOMBRE CIENTFICO Quercus s.p. Corylus avellana Tillia sp. Populus sp. Cantanea sp Eucalyptus sp. Pinus sp. Salix sp. Nothofagus sp.

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6.- METODOLOGA6.1.- ENRAIZAMIENTO DE ESTACAS. Se extrajeron estacas de plantas madres Corylus avellana variedad Barcelona, provenientes de un huerto productivo de esta especie, ubicado en fundo El Toqui, comuna de Pelarco, VII Regin. Las estacas fueron separadas en dos tipos, unas provenientes de rebrotes de poda y la otra de sierpes, stas se llevaron a invernadero donde se aplic cido indolbutrico (AIB), en tres concentraciones, 1000, 2000, y 3000 ppm AIB. Las estacas tratadas con AIB fueron puestas en dos tipos de sustratos (figura 4). Mezcla de turba y perlita en una proporcin de 4:1 respectivamente. Perlita y vermiculita en una proporcin de 7:3 respectivamente.

Figura N 4: estacas instaladas en el medio de enraizamiento, las mas cercanas corresponden a perlita vermiculita y las mas lejanas a turba perlita. La evaluacin del enraizamiento fue determinada mediante un anlisis de varianza de las siguientes variables: porcentaje de enraizamiento nmero de races longitud de races

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Adems se evalu la calidad de la planta de acuerdo a la factibilidad de micorrizacin que las races presentaron, para sto se utilizaron las variables nmero de races, longitud de races, y estructura y forma de estas. Slo las plantas de sierpes fueron utilizadas en la siguiente etapa del estudio, ya que presentaron una mejor condicin radical para la micorrizacin, esto de acuerdo a que a simple vista las provenientes de rebrote eran mas quebradizas y con menor desarrollo de races laterales (figuras 5 y 6). El anlisis estadstico indic que las plantas provenientes de sierpes presentaron un mayor nmero promedio de races que las de rebrote,(27,6 y 18,1 respectivamente). Adems se observ un mayor porcentaje de sobrevivencia en las de sierpe, 94.796 % contra 82.638 % en las de rebrote. (ver resultados). Lo que justifica el uso de las primeras en la siguiente etapa del estudio.

5

6

Figuras N5 y N6: Diferencia evidente entre races generadas en estacas de sierpes (5) y de rebrote ( 6).

37 6.2.- INOCULACIN DE LAS ESTACAS CON Tuber melanosporum. Las plantas se extrajeron del sustrato original cuidando de proteger las raicillas ms finas y conservando la humedad a travs del mantenimiento de stas en agua fresca, adems se elimin con esto la mayor parte del sustrato que mantenan las plantas; la inoculacin y replante se realiz lo ms rpido posible, ya que as se evita un exceso de estrs de las raicillas, lo que podra generar el retraso en el crecimiento y/o la muerte de la planta (Figura 7). En una mesa de trabajo se dispone de 20 lts. de sustrato de transplante, el que se mezcla con inculo de T melanosporum en dosis de 1 g. / planta Con sto se consigue una distribucin uniforme del inculo en el sustrato, con lo que con el posterior crecimiento radicular las raicillas aseguran el contacto con una porcin de esporas de T melanosporum.

A

B

C

D

Figura N7: muestra el proceso de inoculacin de las estacas: extraccin de la planta del sustrato de enraizamiento (A), traspaso al contenedor y aplicacin del sustrato con el inculo (B y C), continuacin hasta llenar la bandeja con plantas inoculadas (D).

38 La mezcla preparada para este objetivo consisti en la unin de los siguientes sustratos en la proporcin indicada en la tabla N 3 Tabla N 3 Caractersticas del sustrato (productos y proporciones de la mezcla) Sustrato Proporcin pH(aproximado) Turba sunshine N 6 50% 6,0 Vermiculita 40% 8,0 Perlita 10% 7,0 Con el objeto de ajustar el pH y niveles de calcio del medio de cultivo, se aplic una enmienda de cal, Carbonato de calcio (Ca CO3) ( Cal Sopracal polvo) en proporcin de 20 Kg /m3. En la mezcladora previamente esterilizada con una solucin de hipoclorito de sodio al 10%, se vertieron los componentes de la mezcla de sustrato que adems se le incorpora fertilizante de entrega lenta Osmocote 18:6:12 razn de 3 gr/lts de sustrato preparado. El tiempo de mezclado es de aproximadamente 3-4 minutos( Fig 8 y 9).

8

9

Figuras N 8 y N 9: mezcla de sustrato lista para la aplicacin del inculo (8), Inculo de Tuber melanosporum mezclado con talco (9) Posteriormente se procede al traspaso de las plantas a los dos tipos de contenedores, los cuales se mantienen incubando bajo condiciones controladas de invernadero para permitir la micorrizacin de stas, en un periodo de 7 meses; finalizado este tiempo se procede a evaluar la micorrizacin de las plantas mediante muestreos representativos del ensayo.

Para evaluar los niveles de micorrizacin se tom una muestra de 5 plantas por tratamiento, seleccionndolas en forma aleatoria. Luego se procedi a realizar un

39 muestreo de volumen del cepelln de los contenedores, de la siguiente manera: del cepelln de cada planta, se extrajo con un sacabocado una muestra cilndrica de 1,27 cm de dimetro en la zona media del contenedor y una longitud equivalente a la anchura del contenedor a esa altura, esto supone un volumen muestreado del orden de 7cc, equivalente aproximadamente, a un 1% del volumen del contenedor de 650 cc y a un 1.6 % del contenedor de 450 cc, de acuerdo a lo propuesto por Reyna (2000). y utilizado por Brunel y Flores (2003). La muestra cilndrica se tom en forma horizontal. Para sto se sac la planta del contenedor y se traslad a otro ya perforado en su parte media, se introdujo el sacabocados imprimiendo una rotacin constante para procurar la corta de las races y evitar su rotura. Las muestras extradas en la zona media del contenedor se consideran suficientes, ya que en ensayos previos realizados por Reyna, (2000), no se obtuvo diferencias significativas entre el estrato medio y el superior, ni entre el medio y el inferior.( Figura N 10).

40 Figura 10: secuencia fotogrfica que muestra la extraccin de la planta del contenedor con todo el cepelln (A), introduccin de la planta en el contenedor perforado (B y C), extraccin de la muestra con el sacabocado (D), Orificio que deja la extraccin de la muestra de cepelln (E), devolucin de la planta al contenedor original previo tapado del orificio con el mismo sustrato utlizado (F), muestra extrada con el sacabocado (G), incorporacin de la muestra al frasco con agua destilada para evitar deshidratacin (H), frasco con agua destilada utilizado para la colecta de muestras (I). Una vez extradas las muestras se procesan en laboratorio para su anlisis. Este proceso consiste en eliminar las partculas de sustrato adheridas a las raicillas. Se realizan varias decantaciones sucesivas incorporando agua corriente ms un detergente comercial cuyo propsito es actuar como surfactante. Con ello se lograr la eliminacin de gran parte del sustrato adherido a las races muestreadas. La manipulacin debe realizarse con el mximo cuidado para no destruir los pices radiculares que son en definitiva seran analizados El producto se recogo sobre un tamiz de 1mm y se volvo a lavar por inmersin lenta en un vaso de precipitado. El producto decantado en el fondo del vaso se observ nuevamente con el fin de comprobar que no se ha perdido pices; el producto del tamiz se deposit en una placa de petri con agua destilada y se analiz con lupa binocular, procediendo al conteo de los pices que estaban micorrizados, los que no se encuentraron en esta condicin, y los que presentaron algn tipo de contaminacin micorrzica. Para cuantificar los niveles de micorrizacin, se contabiliz el nmero de micorrizas de Tuber melanosporum, pices no micorrizados y contaminacin micorrzica no deseada. Todas las referencias se calcularon en volumen, ya que la opcin de referirlo a peso de las muestras genera mayores diferencias debido a la humedad, espacios o falta de uniformidad del sustrato. La calidad de las plantas se evalu de acuerdo a la propuesta hecha por Reyna (2000) y presentada en la tabla N 4: Tabla N 4 forma de evaluar la calidad de las plantas micorrizadas. N de micorrizas de Calidad de micorrizacin Tuber melanosporum por planta. 0 - 100 Insuficiente 100 - 500 Escasa 500 - 1000 Buena 1000 - 3000 Muy Buena Mayor a 3000 Excelente

41 6.3.- DISEO EXPERIMENTAL ENSAYO I ENRAIZAMIENTO DE ESTACAS DE C. avellana. En este caso se utiliz un diseo factorial de parcelas divididas sub-divididas, con una unidad muestral de 12 plantas para enraizamiento, considerando tres repeticiones y un testigo. Mediante un anlisis de varianza con un 95% de significancia, realizado para un diseo de parcelas divididas sub-divididas, se analiz la significancia de los tratamientos; para este anlisis se trabaj con la proporcin de estacas enraizadas (arraigamiento), nmero y largo de races, sobrevivencia y formacin de callo; con anterioridad fue necesario cumplir con los criterios de normalidad y homocedasticidad. Yijk = + i

+

j

+

k

+ (

)ij + (

)ik + (

)jk + (

) ijk