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V Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica XVI Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica

VI Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular

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DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENOLICOS TOTALES POR ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO Y ESPECTROMETRÍA DE GASES MASAS DE EXTRACTOS DE OREGANO MEXICANO (LIPPIA SPP) SECO Y FRESCO.

Autores ARROYO MAYA IZLIA JAZHEEL, HERNANDEZ UNZON HAYDEE YAZMIN, CRUZ Y VICTORIA TERESA, JIMÉNEZ SERNA ALAÍDE. DIRECCIÓN DE LOS AUTORES

DEPTO. DE GRADUADOS EN ALIMENTOS, ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL, PROLONGACIÓN DE CARPIO Y PLAN DE AYALA S/N C.P. 11340, MÉXICO, D.F. TEL. 57296000 EXT. 62464. CORREO ELECTRÓNICO [email protected]




INTRODUCCIÓN

Con el nombre de orégano se conocen en la República Mexicana aproximadamente 40

especies de plantas herbáceas pertenecientes a cuatro familias botánicas, las cuales son:

vervenaceas, labiadas, compuestas y leguminosas (Escobar,1981, Huerta, 2002 y Martínez,

1959).

La característica que distingue a la mayoría de estas especies es su extraordinario poder

saborizante, fácil de percibir cuando se añaden sus hojas frescas o secas, o sus extractos y

concentrados acuosos, a un sinnúmero de productos alimenticios frescos, procesados y

envasados. El aroma y sabor que los diversos tipos de orégano proporcionan a los

alimentos los hacen agradables al olfato, al paladar y favorecen su digestión (Huerta,

2002).

La mayoría de las especies de orégano poseen notables propiedades medicinales, que se

explican por la extraordinaria y compleja composición química que tienen estas plantas. En

la práctica terapéutica (herbolaria) las especies de orégano europeas (Origanum spp) y las

mexicanas (Lippia spp) se administran para las mismas dolencias. Sin embargo, en un

estudio comparativo con el orégano proveniente de Grecia y de Turquía con el orégano

mexicano (referido a las especies Lippia graveolens H.B.K y Lippia berlandieri Shawer),

se pudo comprobar que la calidad del orégano mexicano es superior, referido a la

composición química de sus aceites esenciales (Huerta, 2002).

El creciente interés por el uso de extractos naturales como alternativa para la prevención y

tratamiento de enfermedades ha revelado un importante potencial del orégano. Se ha

demostrado que el orégano contiene sustancias antioxidantes, por lo que no solo es benéfico

para la salud humana, sino que además se puede utilizar para sustituir a los aditivos

sintéticos de los alimentos. Los resultados de experimentos con orégano confirman el

potencial de esta planta y motivan para su mejor aprovechamiento, además se debe tener en

cuenta la importancia de explorar más lo beneficios del orégano y entender a fondo los




procesos que le dan funcionalidad a sus propiedades biológicas tan diversas y atractivas

(Arcila-Lozano y cols., 2004).

Objetivos:

Objetivo General: Elaborar un extracto de orégano (Lippia spp) y determinar que compuestos

específicos se encuentran en él.

Objetivo Particular: Identificar los compuestos presentes en los extractos de orégano por la técnica de

espectroscopia de infrarrojo.

Identificar los compuestos presentes en los extractos de orégano por la técnica de

espectrometríae gases masas.

Justificación: El orégano, debido a sus excelentes propiedades medicinales las cuales han sido

reconocidas durante siglos, tiene en la actualidad una gran demanda para el sector

farmacéutico, por otro lado, para la industria alimentaria, ésta hierba ofrece un sinnúmero

de ventajas ya que posee características de aditivo de alimentos, y se puede añadir a

productos frescos, procesados y envasados, brindándoles excelente sabor e incrementando

su vida de anaquel esto último se le atribuye a sus propiedades antioxidantes (KIntzios,

2002).

En la actualidad, ésta especia ha cobrado interés económico debido a que en su

comercialización existen ingresos para cultivadores, comerciantes, recolectores y

manufactureros de medicinas basadas en plantas, así como en la elaboración de extractos

derivados de ésta hierba y una serie de novedosos productos a base de ésta. Se estima que el

mercado mundial de productos con base a el orégano es de aproximadamente 35, 000

millones de dólares anuales (Huerta, 2002).




Las hierbas son una fuente de antioxidantes, en especial el orégano mexicano (Lippia spp).

El orégano contiene cantidades de antioxidantes que pueden ser utilizadas como aditivos

saludables para la elaboración de productos alimenticios. Hasta el momento se ha recurrido

a los antioxidantes sintéticos, sin embargo, recientes estudios científicos han demostrado

que algunos de ellos pueden provocar cáncer y otras enfermedades, por ésta razón, se

empiezan a desarrollar investigaciones con el objeto de obtener antioxidantes de forma

natural a partir de hierbas, las cuales además de brindar una excelente fuente de sustancias

antioxidantes, para la fabricación de nuevos productos, también proveen un beneficio en la

salud del consumidor.

Debido a la enorme importancia que representa ésta especie de orégano mexicano (Lippia

spp), se considero elaborar un extracto a base de orégano al cual se le determino su

actividad antioxidante, asi como los compuestos que le confieren dicha actividad.

MATERIALES Y MÉTODOS: Reactivos

• Tween 20. Merck-Schuchardt.

• Cloroformo. Alyt.

• β-caroteno. Sigma.

• Butilhidroxitolueno (BHT). Sigma.

• Acido Linoléico. Fluka. Biochemika.

• Reactivo de Folin-Cicalteu. Alyt.

Equipo

• Espectrofotómetro. Termo Spectronic.




• Equipo de espectrometría de gases-masas. 5890 SERIES II Gas Chromatograph.

JEOL JMS-AX505HA Gas Spectrometer.

• Equipo de espectroscopia de infrarrojo. Bruker. Tensor 27.

• Balanza granataria. Boeco Germany. BLC-500

• Balanza analítica digital. Explorer OHAUS Corporation.

• Equipo para soxhlet. GEO-LAB.

• Cámara para cromatografía en capa fina.

• Baño de agua con control de temperatura. Lab. Line Instrument..

• Cronómetro.

• Termómetro. Taylor.

• Equipo común de laboratorio.

Materia prima.

Orégano fresco proveniente del estado de Morelos, adquirido en el Mercado de Jamaica en lotes de

1 kg, cada lote se seleccionó, se limpió y se seco a la sombra por 5 días, los lotes de orégano se

adquirieron con el mismo proveedor y se analizaron en el departamento de botánica para

determinar su especie.

Extracción.

Para la obtención del extracto alcohólico (etanol) de orégano: a 5 g de orégano fresco/seco se

trataron en un equipo Soxhlet con alcohol como disolvente durante 4 horas. El volumen final de

extracto fue de 150 mL.

Identificación de los compuestos fenólicos por espectrometría de infrarrojo.

La espectroscopia infrarroja cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma de

espectroscopia de absorción que puede usarse para identificar un compuesto e investigar la

composición de una muestra, ya que los enlaces químicos tienen frecuencias específicas a las cuales

vibran y que corresponden a un cierto nivel de energía. Las frecuencias resonantes o frecuencias

vibracionales son determinados por la forma de las superficies de energía potencial molecular, las

masas de los átomos y por el acoplamiento vibrónico asociado. Para medir una muestra, un rayo de

luz infrarroja atraviesa la muestra y se registra la cantidad de energía absorbida en cada longitud de

onda. A partir de esto, se puede trazar un espectro de transmitancia o absorbancia, el cual muestra a




cuales longitudes de onda la muestra absorbe el infrarrojo y permite una interpretación de cuales

enlaces están presentes.

Identificación de los compuestos fenólicos por espectrometría de Gases-masas.

El uso de un equipo como el espectrómetro de masas permite identificar los diferentes elementos

que forman un compuesto o determinar el contenido isotópico de diferentes elementos de un mismo

compuesto. Con frecuencia se encuentra como detector de un cromatógrafo de gases, lo cual da

origen a una técnica híbrida como la espectrometría de gases-masas. El espectrómetro de masas

mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta

vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos. El haz de iones produce un patrón específico en el

detector que permite analizar el compuesto químico.

DESARROLLO Y DISCUSIÓN:

Identificación de los compuestos presentes en los extractos con alcohol de Orégano

mexicano (Lippia spp) seco y fresco por Espectroscopia Infrarroja.

Las muestras presentan caracteristicas espectroscopicas semejantes a los compuestos:

Carvacrol, Limoneno, Cariofileno.

En la siguiente Figura (1) se muestra el espectro del compuesto carvacrol el cual se utilizo

como referencia para identificar a los compuestos presentes en los extractos.




Figura 1. Espectro obtenido por espectroscopia infrarroja del compuesto Carvacrol.

CONCLUSIONES: El contenido de compuestos fenólicos en extractos de orégano

mexicano (Lippia spp) fresco y seco fue determinado por La técnica de espectrometría

infrarroja y se encontró que están presentes compuestos como el carvacrol, limoneno y

cariofileno. Lo anterior se pudo corroborar por la técnica de espectrometría de masas, ya que

se determinaron los compuestos presentes en los extractos por su peso molecular y su posible

estructura y esto se relaciono con los datos previamente obtenidos por espectroscopia

infrarroja.




MATERIALES Y MÉTODOS

DESARROLLO

IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENOLICOS

PRESENTES EN EL EXTRACTO

Carvacrol Timol Limoneno Cariofileno Ácido cumarico Quercetina

OBTENCIÓN DEL

EXTRACTO DE OREGANO (alcohol)

OBTENCION DE MATERIA PRIMA (OREGANO FRESCO/SECO)

Figura 2. Diagrama de flujo del proceso. Se muestra de manera general los pasos a seguir

para la realización de este trabajo




RESULTADOS

Figura 3. Espectro obtenido por espectroscopia infrarroja del extracto de orégano fresco.

Figura 4. Espectro obtenido por espectroscopia infrarroja del extracto de orégano seco.




TABLA 1. Correlación entre los datos obtenidos por espectroscopia infrarroja del estándar Carvacrol y los extractos de orégano fresco y seco en alcohol.

Correlaciones en Espectroscopia Infrarroja

Carvacrol Número de onda (cm-1)

Muestra 1 (orégano fresco-alcohol) Rf = 0.01 + 0.003 Número de onda (cm1)

Muestra 2 (orégano fresco-alcohol) Rf= 0.78 + 0.01 Número de onda (cm1)

Muestra 3 (orégano fresco-alcohol) Rf= 0.92 + 0.03 Número de onda (cm1)

Muestra 4 (orégano seco-alcohol) Rf= 0.70 + 0.001 Número de onda (cm1)

Muestra 5 (orégano seco-alcohol) Rf= 0.93 + 0.04 Número de onda (cm1)

Alcoholes, fenoles (3200-3400)

3381 3355 3556 3355 3356 3356

C=CH (3020) 3021 Metilo (2960) 2961 2975 2974 2974 2974 2975 Metileno (2850, 2925)

2928 2933 2928 2930 2931 2936

Metilo (2829) 2870 2883 2884 2884 2884 2883 C=C aromático (1450, 1500,1580,1600)

1621; 1586; 1503;1459

1654;1508; 1455

1660;1454 1660; 1455

1658; 1452

1655; 1456

Metileno (1470) 1421 1419 1418 1418 1420 1420 Metilo (1380) 1381 1381 1381 1381 1380 1381 Acido carboxilo (1200-1300)

1303 1330 1330 1330 1330 1331

Metilo (1200) 1251 1274 1275 1275 1275 Alcoholes terciarios (1150-1200)

1174

Alcoholes primarios (1050+10)

1063 1090 1089 1090 1089 1090

Benceno p-disustituído (800-860)

866; 813 881 881; 803 881; 803 881; 802 881




La identificación de compuestos presentes en los extractos de Orégano mexicano fresco y

seco en alcohol se realizó en un Espectométro de gases-masas.

En la Figura 5 se observa el espectro general del extracto de orégano seco en alcohol, en

éste se pueden observar los picos más sobresalientes, y éstos representan los compuestos

presentes en los extractos de orégano, además se determina su formua química y su posible

estructura.

Figura 6. Espectro general del extracto de orégano seco con alcohol.




Figura 7. Espectro específico de uno de los picos del espectro general para el extracto de orégano seco con alcohol.

Figura 8. Espectro general del extracto de orégano fresco con alcohol por la técnica de espectrometría de gases-masas.




Figura 9. Espectro específico de uno de los picos del espectro general para el extracto de orégano fresco con alcohol.

DISCUSIÓN

Como se observo en la Tabla 1, las muestras analizadas de extractos de orégano presentan

características espectroscópicas semejantes a los compuestos: Carvacrol, Limoneno,

Cariofileno.

En la Tabla 1 se hace una comparación entre el número de grupos funcionales encintrados

en el estándar carvacrol por espectrometría infrarroja y el número de grupos funcionales de

las diferentes muestras de extracto de orégano seco y fresco (en alcohol) que se estudiaron,

la identificación por ésta técnica nos permitió encontrar un total de 16 grupos funcionales

(representados como picos en los espectros antes mostrados) en el estándar, y al hacer la

comparación con cada una de las muestras de los extractos (obtenidas de las manchas la

correr la cromatografía en capa fina), se encontró que la mayoría de las manchas coincidían




con 13 de los 16 grupos funcionales del estándar carvacrol, a excepción de la Muestra 1, la

cuál coincidió con 12 de los 16 grupos funcionales.

CONCLUSIONES

En cuando a la determinación de los compuestos fenolicos por la técnica espectrometría

infrarroja se encontró que están presentes compuestos como el carvacrol, limoneno y

cariofileno al tener espectros muy parecidos y coincidir en la mayoría de los grupos

funcionales presentes en el estándar.

Lo anterior se pudo corroborar por la técnica de espectrometría de masas, ya que se

determinaron los compuestos presentes en los extractos por su peso molecular y su posible

estructura y esto se relaciono con los datos previamente obtenidos por espectroscopia

infrarroja.

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