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Análisis y comparación estructural de la rodopsina sensorial II y la
rodopsina bovina
Ortiz N. María Natalia*
* Escuela de química, Universidad Industrial de Santander, Santander, Colombia.
Trabajo de investigación personal para la asignatura de Bioquímica, código 24725.
Fecha de entrega: 15-09-2013
Palabras claves: fototransducción, rodopsina, estructura, herramientas computacionales.
Resumen
La rodopsina es un receptor de proteínas G esencial en la fototransducción el cual ,se localiza
en la retina de los vertebrados, y cuya función principal desencadena en el proceso de la
vision. El presente trabajo muestra la relación estructural de la rodopsina bovina y la
rodopsina sensorial II, pigmento que coexiste en la célula con la bacteriorodopsina (BR). Para
esto se comparó la estructura cristalina de la rodopsina sensorial II de Natronobacterium
pharaonis determinada a una resolución de 2.1Å, procedente de unos cristales cúbicos lipídicos en
fase de crecimiento y la estructura cristalina de la rodopsina bovina determinada a 2.2 Å. Esta
comparación se realizo con ayuda de herramientas computacionales: RCSB/PDB, TopMatch-web,
cluster W y T-Coffee.
El trabajo muestra en detalle la composición estructural de la BR.
1. Introducción
Las proteínas G se comportan como
transductores de señales que llevan
información desde el receptor hasta una o más
proteínas efectoras, la interacción de las
proteínas G con una molécula externa o
ligando las hace responsables de las cascadas
de señalización producidas en el interior de la
célula, logrando que la célula responda a
estímulos provenientes del exterior.
El receptor acoplado a proteínas G posee una
proteína constituida por siete α-hélices
(receptores 7TM, receptores
heptahelicoidales, receptores serpentina o
GPCR) atravesando su membrana plasmática;
en sus extremos un grupo carboxilo (interior
de la célula) y amino (exterior de la célula)
[1].
La proteína G une moléculas de GTP. La
estructura de esta proteína puede ser trimérica
con subunidades β, γ y α. Las subunidades α
tienen unido un grupo GDP el cual se
intercambiara por GTP, un ligando localizado
en el exterior de la célula que reconoce y se
une a algunas regiones de las α-hélices del
receptor lo que conduce a un cambio
conformacional del GPCR produciendo la
activación de la proteína G. En la estructura
trimérica las subunidades están unidas y se
localizan en la membrana plasmática, de cara
al citosol interaccionando hidrofóbicamente
con moléculas de ácido grado o compuestos
orgánicos derivados del isopreno conocidos
como isoprenoides.
La proteína G presenta también estructura
monomérica que únicamente tiene una
subunidad α, localizada en el citosol por
interacciones hidrofobicas se ancla a la
membrana celular de forma que permanecen
ocultas hasta que un ligando active a un
GPCR y éste a su vez induzca el cambio
conformacional de la proteína G.
Los GPCR se componen de una estructura
similar; siete α-helices membrana conectadas
por tres bucles intracelulares y tres bucles
extracelulares con una terminal extracelular
amino y un carboxilo terminal intracelular[2].
En este grupo se encuentra la rodopsina
sensorial II y la rodopsina bovina.
2. Descripción de la rodopsina
La estructura de la rodopsina proporciona
información para entender la función de
receptores acoplados a proteína G (GPCR).
La rodopsina visual es conocida como
púrpura visual, este pigmento biológico se
encuentra en las células fotorreceptoras de la
retina, siendo responsable de los primeros
eventos en la percepción de la luz. La
estructura de la rodopsina se ha estudiado en
detalle a través de la cristalografía de rayos X
de cristales de rodopsina. Su estructura se
compone de: un cofactor covalente unido
reversiblemente, un fragmento de la proteína
opsina que se encuentra dentro de la bicapa
lipídica, la opsina es
una proteína heptahelical de membrana con
un peso molecular de 40Da, formado por
alrededor de 348 aminoácidos que actúan
como un escudo que modifica las propiedades
fisicoquímicas del cromóforo, la opsina se
encarga de proporcionar un ambiente propicio
para la absorción de luz en una longitud de
onda particular, por ende un diferente tipo de
opsina afectará de manera distinta al retinal, la
opsina presenta un cambio conformacional
inducido por la luz debido a la isomerización
del 11-cis-retinal en el todo-trans-retinal, la
retina la cual esta horizontalmente respecto a
la membrana, el retinol que
genera pigmentos necesarios para el
funcionamiento de la retina un haz de siete
hélices transmembrana (opsina) conectados
entre sí por los bucles de proteína[3],
uniéndose a la retina la cual se encuentra en
un bolsillo central en la séptima hélice en un
residuo de lisina.
Se pueden encontrar diferentes opsinas que
presentan diferencias en algunos aminoácidos
y en longitudes de onda de la luz con una
absorción más fuerte. Los seres humanos
tienen cuatro tipos diferentes.
La rodopsina no solo está presente en
organismos eucariotas (animales o seres
humanos), sino también en organismos
procariotas los cuales poseen rodopsinas
microbianas. Las rodopsinas microbianas
tienen homología de secuencia significativa
entre sí, pero no tienen homología de
secuencia detectable a la familia de receptores
acoplados a proteína G de rodopsinas
visuales perteneciente a los animales. Sin
embargo, las rodopsinas microbianas y
GPCRs están posiblemente relacionadas
evolutivamente, sobre la base de la similitud
de sus estructuras tridimensionales. Por ende,
han sido asignadas a la misma súper familia
en clasificación estructural de proteínas.
3. Análisis estructural de la
rodopsina
En la rodopsina los ángulos de las hélices
muestran inclinación y torsiones internas
propias, alejándose del modelo estructural de
hélice estándar. Las siete α-helices que
integran la estructura de la rodopsina
conforman el dominio transmebrana (siete en
total H-l a la H-Vll), estas atraviesan
perpendicularmente la membrana celular. La
forma similar a la de un barril de las hélices es
debida a las interacciones con los
componentes hidrofóbicos (fosfolípidos) de la
membrana de los discos de los bastones de la
retina, en su parte interna se localiza el 11-cis-
retinal, este se une a la Lys 296
que se
encuentra en la hélice H-VII. El retinal
absorbe la luz y posteriormente se isomeriza
formando el todo-trans-retinal y dando inicio
al proceso visual.
Lys 296
y Glu113
contribuyen al mantenimiento
de la conformación inactiva en la estructura
de la rodopsina. La desprotonación y carga
negativa de Glu113
da estabilidad a la base de
Schiff en la oscuridad.
En el dominio transmembrana las hélices H-
I, H-IV, H-VI Y H-VII tienen residuos de
prolina, que son los causantes de la torsión en
estas hélices, teniendo mayor influencia en las
hélices H-VI y H-VII. En el dominio
transmebrana adicionalmente se encuentran
residuos de Tyr 223
, Lys 245
, Lys 248
y Arg 252
.
El acople de la proteína G ocurre en el
extremo C-terminal que se conoce como
dominio citoplasmático, en este se presenta el
fenómeno de transducción de la señal
luminosa durante el proceso de la visión. La
H-VIII también conforma el dominio
citoplasmático, las hélices trasmembrana son
unidas por C-I, C-II y C-III.
El extremo N-terminal se denomina dominio
extracelular o intradiscal, en este dominio se
encuentran tres bucles E-I, EII y EIII y
puentes disulfuro en medio de dos residuos de
cisteína Cys110
y Cys187
que controlan la
actividad de la rodopsina[4].
El extremo amino terminal se caracteriza por
estar formado por cinco zonas; La primera
esta forma por una lámina β de dos hebras
antiparalelas desde la Gly3 hasta Pro
12, esta
zona se denomina β1 y β2. La zona tres posee
a la Phe13
y Ser14
. Los residuos Asn2 hasta
Pro23
y Pro27
hasta Pro 34
integran las zonas
cuatro (β4) y cinco respectivamente (β5). El
11-cis-retinal esta ubica en la parte posterior
de β4.
3.1 La formación de una base de
Schiff
Su estructura tridimensional analizada por
DRX [9] , representa una estructura elipsoide,
el dominio helicoidal constituye
aproximadamente la mitad de la proteína,
estudios por espectroscopia infrarroja han
dado también evidencia de esto, el cilindro
elíptico es originado por las α-helices, una
octava hélice citoplasmática se encuentra
insertada en las cisteínas 322 y 323 (Cys 322
y
Cys 323
).
4. Descripción de la
bacteriorodopsina (BR)
Condiciones extremas de hipersalinidad en
lagos o mares cerrados como el Mar de Aral o
el Mar Muerto hacen difícil el desarrollo de
vida, solo algunas bacterias pueden
sobrevivir, la Halobacterium salinarum se
caracteriza por soportar este tipo de
condiciones, se identifican por su color rojo-
purpura en la superficie del lugar donde
habitan debido a la bacteriorodopsina.
El H. salinarum es una bacteria que al
fragmentar su membrana celular se originan
fragmentos de membrana diferenciados de la
membrana citoplasmática conocida como
membrana púrpura (MP) por su coloración, la
membrana purpura está constituida por una
única proteína transmembrana con una
molécula retinal unida, las proteínas que se
enlazan al retinal transmembranoso y
heptahelical actúan como convertidores de
energía en la BR o como sensores lumínicos
(rodopsindas visuales y fotoaxis) con un
máximo de absorbancia de 560nm, que
presenta variaciones cuando MP se ilumina
con diferentes longitudes de onda, con lo cual
se pudo determinar que la proteína podía
actuar como fotorreceptor, además al tener
unida una molécula de retinal la hacen muy
similar a la rodopsina visual. Esta proteína se
conoce como Bacteriorodopsina (BR).
La BR es una proteína bombeadora de
protones ya que al iluminarla se produce un
transporte de protones desde el citoplasma al
espacio extracelular mediante un ciclo de
reacciones que inicia con la isomerización de
su cromóforo el cual está unido a la proteína
formando una base de Schiff (BS) con el
grupo amino de una lisina, el retinal, mediante
la absorción de un fotón, generandose un
gradiente electroquímico de protones, el
gradiente generado es aprovechado por
ATPsintasas introduciendo un protón en la
célula y expulsando dos Na+ hacia el exterior
de esta manera se genera ATP a partir de
ADP. El gradiente electroquímico de protones
es ocasionado por la variación de pH del
medio al iluminar la BR, en este proceso la
BR cambia su absorbancia (560 nm)
alcanzando valores de 475 nm[5], debido al
movimiento de protones desde un lado de la
membrana hacia el otro. (Oesterhelt et al
1971, 1973). Los cambios en el espectro UV-
vis, en su carga eléctrica, protonaciones y
desprotonaciones de residuos, cambios
estructurales, entre otros de la proteína son
cíclicos, con cinéticas que se relacionan entre
sí (Stoeckenius, 1999).
4.1 Caracterización estructural de la
BR
La BR es una proteína transmebrana de
aproximadamente 26 KDa, los estudios
iniciales para la determinación de su
estructura indicaron que se constituía de siete
hélices, perpendiculares al eje de la
membrana con dimensiones de 25*35*45Å,
esta determinación se realizó a una resolución
de 7 Å utilizando difracción de electrones
posteriormente se reafirmó mejorando la
resolución (3.5 Å). (Unwin et al., 1975;
Ovchinnikov et al., 1979). En 1997 se pudo
determinar con mayor precisión la estructura
proteica, gracias a la elaboración de cristales,
permitiendo obtener estructuras con una
mayor resolución (Pebay-Peyroula et al.,
1997). La bacteriorodopsina tiene relación
con la proteína transmebrana rodopsina
sirviendo como modelo de estudio de esta.
(Hoflack et al., 1994; Neumuller et al., 1996;
Riek et al., 2001).
El estudio cinético de los ciclos que ocurren
en la BR permitierón identificar mediante el
uso de técnicas espectroscópicas (UV-vis y
UV cercano) cinco intermediarios con una
vida media muy corta.
BR570 K590 L550 M410 N520 O640 BR570
El máximo de absorción se indica en los
subíndices, los intermediarios se designan por
una secuencia alfabética ya que el tercero y
segundo presentan similitudes con la
lumirodopsina y metarodopsina del pigmento
visual.
Utilizando espectroscopia de resonancia de
Raman se identificó la existencia de una red
de moléculas de agua a ambos lados de la
proteína, permitiendo un intercambio rápido
de su protón. Este método espectroscópico
permitió establecer que los cambios
conformacionales del cromóforo generaban
cambio en el pKa de la BS y otros residuos
proteicos implicados en el transporte del
protón y a su vez estos eran originados por
una fuerza originada por en el fotociclo.
En la BR el sitio de unión del retinal, la Lys216
se localiza cerca de la mitad de la hélice G y
el Asp212
es el contraión más probable de la
BS.
Estudios de espectroscopia vibracional y
RMN confirman una secuencia de
intermediarios que ya habían sido detectados
utilizando esctroscopia UV-visible. RMN en
estadio sólido introdujo la idea que el
contraión de la BS consistía en varios grupos
y no solamente en un aspártico. La
espectroscopia de infrarrojo con transformada
de Fourier (FTIR) permite estudiar toda la
proteína e identificar los residuos implicados
en sus funciones, los aspáticos 85 y 96
localizados en la hélice C se identificarón por
FTIR, estos residuos se protonaban y
desprotonaban durante el fotociclo. Por el
contrario el Asp115
y el Asp 212
sólo sufren
cambios en su entorno durante el fotociclo.
El anillo β-ionona y seis aminoácidos
aromáticos (4 Trp y 2 Tyr) permiten definir el
bolsillo de unión del retinal, el espacio
citoplasmático de la BS es estrecho e
hidrofóbico en contraste con el espacio
extracelular el cual es más ancho.
El interés que genero el comportamiento de la
BR llevo a clonar el gen, secuenciarlo y
expresarlo en E.coli para posteriormente
reconstituirlo con retinal en vesículas lipídicas
y micelas de detergente. Permitiendo la
expresión de mutantes y su caracterización.
La obtención de la proteína expresa en E.coli
no se daba en un entorno nativo y era
necesario incubación con el retinal y la
reconstitución en micelas o liposomas, que ya
se había visto para la BR nativa que generaba
algún cambio en la función.
La bacteriorodopsina está acompañada de
diferentes pigmentos: Bacterioruberina,
halorodopsina (hR), rodopsina sensorial I (sR)
y rodopsina sensorial II (pR). En este trabajo
se hace énfasis en la pR, conocida como
foborodopsina, es transmembranal y tiene
unido retinal, actúa como fotorreceptor
repeliendo la radiación azul-ver, direcciona la
bacteria hacia intesidades de luz adecuadas
para la funcionalidad del organismo,
alejándose de la luz ultravioleta y migrando
hacia regiones de elevada intensidad naranja.
Este fenómeno se conoce como fototaxis.
5. Análisis computacionales de
rodopsina sensorial II de
natronobacterium pharaonis y la
estructura cristalina de la rodopsina
bovina.
A continuación se muestra el trabajo
desarrollo con herramientas computacionales
para el análisis de la rodopsina sensorial II y
la rodopsina bobina.
El PDB proporciona las estructuras
tridimensionales de la rodopsina bovina y la
rodopsina sensorial, figura 1. La tabla 1 se
obtuvo basándose en datos obtenidos con el
PDB.
Figura 1. (a) Estructura cristalina de la rodopsina sensorial II de Natronobacterium pharaonis determinada a una
resolución de 2.1 (b) Estructura cristalina de la rodopsina (1U19) bovina a una resolución de 2.2 Å.
Rodopsina Sensorial II (1H68) Rodopsina Bovina (1U19)
Longitud de la
cadena
239 residuos 349 residuos
Tipo de cadena Polipeptida (L) Polipeptida (L)
Estructura
segundaria
71% helical (8 helices; 171
residuos).
3% hojas beta (2 hebras; 8
residuos).
60% helical (14 helices; 211
residuos).
2% hojas beta (4 hebras; 10
residuos).
Súper familia Familia A. Receptores acoplados a
proteínas G.
Familia A. Receptores acoplados a
proteínas G.
Topología 7-helices proteicas transmembrana 7-helices proteicas transmembrana
Homología 7-helices proteicas transmembrana 7-helices proteicas transmembrana
Clase Membrana y superficie celular de
proteínas y péptidos.
Membrana y superficie celular de
proteínas y péptidos. Tabla 1. Comparación entre la rodopsina sensorial II y rodopsina bovina.
La herramienta computacional TopMatch-
web permitio visualizar las estructuras 3D
superpuestas de las proteínas rodospina
sensorial II y la rodopsina bovina, figura 2.
Figura 2. Imagen tridimensional de las proteínas superpuestas rodopsina bovina (azul) y rodopsina sensorial II
(verde), los pares de residuos estructuralmente equivalentes se muestran en color naranja y rojo respectivamente.
(a) Estructura con ligandos y (b) Estructuras sin ligandos
.El análisis computacional se realizó
descargando el formato de identificación
PDB (FASTA) proporcionado para cada
proteína, 1U19 rodopsina bovina y 1H68
rodopsina sensorial II. TopMatch reporta
una lista clasificada de las alineaciones
(tabla 2) alternativas al superponer las dos
estructuras proteicas.
Tabla 2. Tabla de alineaciones alternativas las proteínas superpuestas rodopsina bovina y rodopsina sensorial
II.
En la tabla 2 todos los parámetros
indicados son importantes, algunos más
complejos que otros, entre estos se
destacan:
a b
T que indica el tipo de alineación, la
estructura básica se indica con “b”
(rodopsina bovina) y la proteína alineada
se indica con “c” ( rodopsina sensorial II).
R es el rango de alineamiento, S muestra si
las partes estructuralmente equivalentes en
consulta (rodopsina bovina) y destino
(rodopsina sensorial II) coinciden
perfectamente, P indica el número de
permutaciones y alineamientos entre las
dos estructuras, Is las secuencias
equivalentes entre las dos estructuras.
TopMatch proporciona las secuencias
superpuestas de las dos estructuras
analizadas, en esta ocasión se mostraran las
secuencias alineadas obtenidas con cluster
W figura 3 y con TopMatch figura 4.
Figura 3. Secuencias alineadas de la rodopsina bovina (1U19) y rodopsina sensorial II (1H68). (:) Aminoácidos
con propiedades similares, (*) aminoácidos iguales, (.) aminoácidos diferentes.
En la figura tres se observan cuatro
colores. Los aminoácidos Ala, Pro, Val,
Leu, Ile y met tienen grupos R apolares
alifáticos esta clase de aminoácidos son
apolares e hidrofóbicos al igual que Phe,
Tyr y Trp, que tienen cadenas laterales
aromáticas, estos aminoácidos integran el
grupo de los R aromáticos. Ambos grupos
se identifican con el color rojo.
El color verde identifica la Gly que
pertenece al grupo de R apolares alifáticos,
este aminoácido tiene su carbono α está
unido solo a tres grupos diferentes,
contrario al resto de aminoácidos tienen el
carbono α enlazado a un grupo carbonxilo,
un grupo amino, un grupo R y un átomo de
hidrógeno, presentando un centro quiral.
De igual forma se señalan en verde los
aminoácidos de grupos R polares sin carga,
S, T, C, N y Q, estos aminoácidos son más
solubles en agua, o hidrofilicos, debido que
en su estructura algunos grupos
funcionales forman puentes de hidrógeno
con el agua.
Los grupos R cargados positivamente
(básicos) se identifican con color rosado,
estos aminoácidos se caracterizan por ser
más hidrofilicos. Este grupo lo integran
Lys, His y Arg. Y por último los
aminoácidos identificados en azul son los
grupos R cargados negativamente (ácidos)
D y E.
Figura 4. Secuencias alineadas de la rodopsina bovina (1U19) y rodopsina sensorial II (1H68) Obtenida con
TopMatch.
En la figura 4, 1H68 no presenta
coincidencias hasta el aminoácido 34, a
partir del 35 W (Try) para 1U19 y V (Val)
se alinean, el triptófano es un aminoácido
con grupo R aromático con propiedades
apolares al igual que la valina que es un
compuesto alifático. Esta alineación se
conserva hasta el aminoácido 65,
finalizando la cadena H (His) y G(Gly).
Tanto 1U19 como 1H68 coinciden en los
aminoácidos 40, 119, 128,131 L(Leu),
51,280 G(Gly), 81, 209 y 300 V(Val), 212
F(Phe), 263 y 305 I(Ile), 265 W (Try), 268
Y(Tyr). Los aminoácidos con propiedades
semejantes se alinean, en la comparación
de las dos estructuras proteicas se observan
9 alineaciones.
6. Conclusiones
En la BR y en la rodopsina se encuentra
que el retinal se isomeriza por absorción de
la luz. Adicionalmente en la BR el isómero
todo-trans cambia al isómero 13-cis. La
rodopsina sensorial presente en la BR
guarda similitudes estructurales con la
rodopsina bovina presente en vertebrados.
Métodos espectroscópicos permiten
predecir propiedades con base a la
estructura de las proteínas, cada técnica
espectroscópica tiene un fin específico que
al combinarse proporcionan información
muy valiosa sobre estructuras proteicas.
La bioquímica computacional permite
estudiar moléculas, predecir
comportamientos, caracterizar, determinar
estructuras, desarrollar modelos
computacionales de posibles
conformaciones geométricas de las
estructuras biológicas.
El PDB permitio obtener la estructura
tridimensional de la rodopsina bovina y la
rodopsina sensorial II, las dos estructuras
fueron obtenidas mediante cristalografía de
rayos X.
El software T-Coffee es ideal para obtener
el alineamiento de varias secuencias
proteicas, como se observó en este trabajo,
utilizando la información estructural de
archivos PDB.
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