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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN: EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE LACTOBACILLUS EN CONDICIONES GASTROINTESTINALES HUMANAS SIMULADAS IN VITRO. CLAVE: 20070160 PERÍODO: DE ENERO A DICIEMBRE DE 2007 DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO DIRECTOR DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN UPIBI – IPN
FEBRERO DE 2008
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1.- RESUMEN.
El presente proyecto de investigación tuvo como objetivo principal la evaluación de
la viabilidad de Lactobacillus bajo condiciones gastrointestinales humanas
simuladas in vitro. Para ello, se seleccionó a Lactobacillus delbrueckii subs.
bulgaricus como bacteria láctica probiótica para la evaluación de la viabilidad
bacteriana bajo las condiciones de estudio.
El trabajo realizado tuvo como antecedente el proyecto de investigación:
“Aplicación de la inmovilización celular como vector de bacterias lácticas
probióticas para la producción de alimentos funcionales” con clave 20060651. En
dicho proyecto se evaluó la técnica de inmovilización celular por atrapamiento
utilizando Lactobacillus delbrueckii como cepa de estudio. Se evaluó el potencial
de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento como vector de bacterias
lácticas probióticas. Se demostró que dicha técnica puede ser utilizada de manera
eficaz para la producción de alimentos funcionales. Se realizaron experimentos de
simulación in vitro bajo condiciones de acidez similares a las encontradas en el
estómago humano. Se determinaron las perdidas de viabilidad bacteriana en
bacterias libres y en bacterias inmovilizadas en soportes de alginato. Así mismo,
se determinó la influencia de la adición de un alimento tipo a las muestras
bacterianas durantes los experimentos de cinéticas de pérdida de viabilidad
bacteriana mediante simulaciones in vitro de las condiciones gastrointestinales
humanas.
2
2.- INTRODUCCIÓN.
La inmovilización celular representa un conjunto de técnicas que permiten localizar
en un espacio definido a un conjunto de células para la realización de un gran
número de bioconversiones. En proyectos anteriores, nuestro grupo de trabajo ha
demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas permite mantener los
niveles de viabilidad de bacterias cuando son sometidas a procesos de
conservación o de preservación de la actividad biológica, como la liofilización. Así
también, se ha demostrado que la inmovilización de bacterias lácticas por la
técnica de atrapamiento ha permitido el uso de reactores empacados para la
inoculación continua de leche para la producción de cualquier producto lácteo.
Por otra parte, también se ha demostrado que, con base en las simulaciones in
vitro de las condiciones gastrointestinales del ser humano, así como de cinéticas
de pérdida de viabilidad realizadas, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NRRL-734 inmovilizado en soportes de alginato de sodio, mantiene mayores
niveles de viabilidad con respecto a las células libres de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus tratadas bajo las mismas condiciones fisicoquímicas.
Se demostró también que la presencia de una muestra de desayuno tipo mezclado
a las células de Lactobacillus delbrueckii a un pH de 4.2 disminuyó
significativamente los porcentajes de pérdida de viabilidad de las células libres, así
como la velocidad de pérdida de viabilidad durante las cinéticas realizadas. Dicho
efecto no fue significativo para el caso de las cinéticas realizadas a un pH de 2.4.
Dichos resultados obtenidos en el proyecto de investigación precedente quieren
3
decir que en el caso de que un ser humano consuma células de Lactobacillus
delbrueckii, existirán mayores posibilidades de dichas células libres de
Lactobacillus delbrueckii sobrevivan a las condiciones gastrointestinales del ser
humano, cuando las bacterias se consuman acompañadas de algún alimento tipo
como el que aquí se utilizó, que cuando la persona se encuentre en ayunas.
Por otra parte, se demostró que la técnica de inmovilización celular por
atrapamiento resultó adecuada para su aplicación como vector de bacterias
probióticas hacia el ser humano, ya que su utilización permitió de manera
significativa y por medio de simulaciones in vitro, la disminución de los niveles de
pérdida de viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas.
En esta ocasión, el presente proyecto contempló la evaluación de la viabilidad de
Lactobacillus delbrueckii bajo condiciones gastrointestinales humanas, más
complejas, simuladas in vitro. La presencia de bilis hepática para simular el
duodeno fue incluida, así como la presencia de un prebiótico (inulina) fue evaluada
asociada al soporte de inmovilización, todo ello con la finalidad de aplicar los
resultados de dicho proyecto en el desarrollo de alimentos funcionales.
En efecto, los alimentos funcionales definidos como aquellos alimentos o
componentes de éstos, que aportan un beneficio a la salud del consumidor,
además de sus características básicas nutritivas. Por otra parte, en los últimos
años se han constatado los efectos benéficos de las bacterias lácticas en el
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organismo humano, lográndose evidenciar su efecto probiótico, es decir que estos
microorganismos tienen efectos benéficos en la salud humana.
Dada la importancia de estos microorganismos, se han introducido en una gran
variedad de productos comerciales, llamados “alimentos probióticos”, debido a la
inclusión de los microorganismos vivos. Uno de los principales alimentos
probióticos es el yogurt en sus diferentes presentaciones.
Los productos lácteos con características probióticas están cada vez más
presentes en la dieta humana. Es importante mencionar que las bacterias lácticas
son microorganismos que pierden muy fácilmente su viabilidad, ya que son muy
sensibles a los cambios bruscos del medio ambiente.
En este contexto, en el presente proyecto de investigación contempló una
evaluación más completa de la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii sometido a
condiciones gastrointestinales humanas simuladas in vitro. Para tales fines, se
evaluó la presencia de bilis hepática para simular el duodeno, así como la
influencia de la presencia de un prebiótico (inulina) asociado al soporte de
inmovilización sobre la viabilidad bacteriana. Todo ello con la finalidad de aplicar
los resultados de dicho proyecto en el desarrollo de alimentos funcionales.
5
3.- MATERIALES Y MÉTODOS.
En esta sección se explica de forma resumida la estrategia de trabajo y las
técnicas utilizadas para el desarrollo del proyecto.
Se utilizó una bacteria láctica muy utilizada para la producción de yogurt:
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Se realizaron diversas cinéticas de
pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus libres, bajo condiciones de acidez
y en presencia o ausencia de bilis hepática simuladas in vitro; así como el efecto
del acompañamiento de un alimento tipo a las preparaciones bacterianas sobre la
viabilidad celular. Los niveles de sobrevivencia fueron registrados y posteriormente
fueron comparados con aquellos obtenidos de cinéticas de pérdida de viabilidad
de lactobacillus inmovilizado por atrapamiento celular en un soporte de
inmovilización compuesto de alginato de sodio.
Los métodos generalmente empleados fuero la determinación de los niveles de
viabilidad por cuantificación en placa de Petri y el método de inmovilización por
atrapamiento celular.
6
3.1.- Microorganismo.
La cepa de estudio en el proyecto fue: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
NRRL-734.
Se trata de una cepa de colección obtenida por parte del Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es una bacteria láctica considerada
como probiótico, esto es que proporcionan efectos benéficos en el huésped
mejorando su equilibrio microbiano intestinal, además de mejorar el sistema
inmunológico del mamífero que lo consuma y lo adopte dentro de su flora
intestinal. Así mismo, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus es ampliamente
usado, en conjunto con Streptococcus thermophilus, para la producción industrial
de yogurt. Por todo ello, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus representa una
bacteria láctica de amplio interés económico-industrial.
3.2.- Estrategia de trabajo.
Se inició con la siembra de dos colonias de Lactobacillus delbrueckii en medio
líquido MRS contenido en un matraz (matraz semilla), el cual se incubó a 38 ºC y
180 rpm durante 24 horas. Después de la incubación, se inoculó un segundo
matraz y se incubó a las mismas condiciones que el matraz semilla. Posterior a la
incubación, se recuperó la biomasa por medio de centrifugación (5000 rpm, 5 min).
La biomasa se inmovilizó utilizando la técnica de atrapamiento celular en alginato
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de sodio al 1% y 2%. Al término de la inmovilización se tomó una muestra de
células inmovilizadas (equivalente a 1 mL), mismas que fueron tratadas con
solución de Citrato de sodio 0.1 M, a 40 ºC y agitación con vortex para disolver la
matriz de inmovilización y liberar las células. Posterior a esto, se realizan
diluciones y se determina la viabilidad bacteriana por medio de la técnica la
técnica de conteo en placa en medio MRS.
Las pruebas que se realizaron fueron: la evaluación de la viabilidad de células
libres e inmovilizadas en presencia de ácido clorhídrico y de bilis hepática en
condiciones gastrointestinales simuladas in vitro, con la finalidad de simular el
paso de las células por el estómago del ser humano. Así como la presencia
también de un alimento tipo que acompañaba a las preparaciones bacterianas.
3.2.1.- Determinación de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii libre (sin
inmovilizar, muestra testigo) e inmovilizado por atrapamiento, en medio
ácido simulando in vitro la estancia de las bacterias en el estómago humano.
Se realizaron cinéticas de pérdida de viabilidad en medio ácido a pH 2.4 y 4.2,
ambos ajustados con solución de ácido clorhídrico 150 mM (concentración
presente en el estómago), con y sin presencia de alimento tipo (simulación de un
desayuno ligero típico de un ser humano, que consiste de leche y fruta), la
temperatura y agitación orbital se mantuvieron constantes 37 ºC y 50 rpm
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respectivamente. Se tomaron muestras de células libres e inmovilizadas
(equivalente a 1 mL) cada 15 minutos, para determinar la viabilidad bacteriana a
dichas condiciones, mediante la técnica de conteo en placa en medio MRS
sólido. En esta etapa se trata de simular el efecto de la acidez que presenta el
estómago, sobre la viabilidad de Lactobacillus delbrueckii cuando el ser humano
se encuentra en ayunas (estómago vacío, pH 2.4) y cuando se encuentra con un
desayuno tipo en el estómago (Figura 1). Con base en esta determinación se
podrá conocer si la presencia de alimento tipo puede disminuir los efectos del pH
ácido sobre la perdida de viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii,
tanto libres como inmovilizadas.
Células (libres o inmovilizadas) + alimento muestra (fruta con leche),
ajustando pH con solución de HCl 150
37 º C, 50 rpm
Células (libres o inmovilizadas) + solución de HCl 150 mM sin
alimento muestra.
37 º C, 50 rpm
Figura 1.- Evaluación de la viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii
en medio ácido.
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3.2.- Medio de cultivo MRS líquido y sólido.
La composición del medio de cultivo MRS es descrita en el Cuadro 1.
Cuadro 1. Formulación del medio MRS líquido.
REACTIVOS
CANTIDAD
Glucosa 20 g
Peptona de caseína 10 g
Extracto de carne 10 g
Extracto de levadura 10 g
Acetato de sodio 5 g
Citrato de amonio 2 g
Fosfato ácido de potasio 2 g
Twen 80 1 mL
Sulfato de magnesio
heptahidratado 200 mg
Sulfato de manganeso 50 mg
Agua destilada cbp. 1 L
Nota: para preparar medio sólido se agregan 12 g de agar bacteriológico.
3.3.- Determinación de viabilidad por conteo en placa.
En la Figura 2, se presenta el esquema del desarrollo de la técnica de conteo en
placa, el procedimiento es el siguiente: de una concentración de células conocida
se toma 1 mL de la suspensión, y se realizan diluciones de 10-1 a 10-6. De las
diluciones 10-3 a 10-6, se toman alícuotas de 0.1 mL para sembrar por extensión en
placa en medio sólido MRS. Posteriormente, las cajas de Petri se incuban a 37 ºC
10
durante 48 h, al término de incubación se cuentan las colonias y se reportan como
UFC/mL.
1 mL
10 - 2 10 - 3
10 - 5 10 - 6 10 - 1 10 - 4
0.1 mL
0.1 mL 0.1 mL0.1 mL0.1 mL
Placas con medio sólido MRS sólido
Incubar a T (38 ºC) óptima durante 24
horas
Figura 2. Esquema de la técnica de determinación de viabilidad por conteo en placa de Petri.
3.4.- Inmovilización celular por la técnica de atrapamiento.
En la Figura 3 se muestra el esquema de la técnica de inmovilización por
atrapamiento celular que fue utilizada en el proyecto.
La biomasa recuperada por centrifugación, se adiciona a la solución de soporte
(alginato de sodio ó κ-carragenina) contenida en un recipiente enchaquetado,
manteniendo constante la temperatura (38 ºC a 40 ºC) para evitar que el
polisacárido gelifique y agitación de 120 rpm para homogenizar la suspensión.
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La suspensión se hace pasar a través de una aguja por medio de una bomba
peristáltica (12 rpm), se forman gotas que al ponerse en contacto con la solución
gelificante (KCl ó CaCl2 0.3 M), gelifican formándose partículas esféricas de
aproximadamente 3 mm de diámetro.
La solución gelificante se encuentra con agitación mínima, para evitar que las
esferas se peguen entre ellas al momento de caer.
Suspensión de soporte con biomasa
38 – 40 ºC, 120 rpm Solución de KCl ó CaCl2 0.3 M, 120 rpm
Bomba peristáltica
12 rpm
Figura 3. Esquema de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento.
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4.- RESULTADOS.
4.1.- Tratamientos en medio ácido a pH 2.4 (simulando in vitro la etapa de
estancia de las bacterias en el estómago humano).
El Cuadro 2 y la Figura 4 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2% (p/v), tratadas a pH 2.4 y en
ausencia de “alimento muestra” o “desayuno tipo”, con la finalidad de simular in
vitro la estancia de las bacterias en el estómago humano a pH muy ácido y cuando
el estómago humano se encuentra vacío.
En la figura 4 puede observarse que se iniciaron las cinéticas de pérdida de
viabilidad con un 100% de células de Lactobacillus delbrueckii libres viables
(2.43x108 UFC/mL). Al término de las cinéticas de pérdida de viabilidad, el 14%
(3.47x107 UFC/mL) de las bacterias lácticas libres se mantuvieron viables,
mientras que las bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2%,
mantuvieron porcentajes de viabilidad del 62% (7.73x108 UFC/mL) y del 70%
(5.10x108 UFC/mL), respectivamente; siendo el 100% igual a 1.25x109 UFC/mL
para la muestra de células inmovilizadas en alginato al 1% y de 7.30x108 UFC/mL
para la muestra de bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 2%.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene de 4 a 5 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, en
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alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 2.4 y en ausencia de alimento tipo.
Analizando los resultados presentados en el Cuadro 2 y la Figura 4 para el minuto
30, que es el tiempo de referencia de vaciado del estómago para este estudio,
podemos observar que las velocidades de pérdida de viabilidad de las bacterias
fueron en el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en
alginato al 1% de 0.47% de pérdida de viabilidad/min y para alginato al 2% de
0.50%/min. En el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii libres, la
velocidad de pérdida de viabilidad fue 2.03%/min (Cuadro 3).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser 4 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
atrapamiento, ya sea en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 2.4 y
en ausencia de alimento tipo.
Los resultados estadísticos demostraron que existieron diferencias significativas
entre la viabilidad de células libres de Lactobacillus delbrueckii con respecto a la
de células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas, ya que la viabilidad
bacteriana resultó significativamente mayor cuando las bacterias lácticas se
encontraron inmovilizadas en alginato de sodio. Por otra parte, se observó que no
14
existieron diferencias significativas entre la utilización de alginato a
concentraciones de 1% y de 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 2. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas Células Inmovilizadas en alginato 1% en alginato 2%
(min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. +
0 100 0 100 0 100.0 0.0 15 63 16.6 96 8.2 91 8.8 30 39 9.0 86 6.5 85 6.2 45 28 5.6 72 7.0 74 2.3 60 14 10.0 62 2.1 70 1.2
100
63
3928
14
100100.0
6272
86
96
7074
85
91
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (h)
Via
bilid
ad (%
)
Cél. libres Inmovilizadas en alginato 1%
Inmovilizadas en alginato 2%
Figura 4. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 2.4 en ausencia de
“desayuno tipo”.
15
Cuadro 3. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 2.03 30 Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.47 30 Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.50 30
El Cuadro 4 y la Figura 5 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v), tratadas a pH 2.4 en
presencia de “desayuno tipo” (leche y fruta). En este tratamiento se trató de
simular in vitro la estancia de las bacterias lácticas en el estómago humano a pH
muy ácido en presencia de alimento.
Se iniciaron las cinéticas de pérdida de viabilidad con un 100% de viabilidad para
células libres de Lactobacillus delbrueckii (3.27x108 UFC/mL) e inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% (1.24x109 UFC/mL) y al 2% (9.80x108 UFC/mL). Al término
de las cinéticas de pérdida de viabilidad, se observó que el 16% (4.67x 107
UFC/mL) de las células libres de Lactobacillus delbrueckii mantuvieron su
viabilidad al término del tratamiento en medio ácido. Por el contrario, las células de
Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2%,
16
mantuvieron porcentajes de viabilidad del 72% (8.93x108 UFC/mL) y del 78%
(7.80x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene casi 5 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, ya sea en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 2.4 y en presencia de alimento tipo.
Analizando los resultados presentados en el Cuadro 4 y la Figura 5 para el minuto
30, podemos observar que las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas
en alginato de sodio al 1% presentaron una velocidad de pérdida de viabilidad de
0.48%/min; mientras que para alginato de sodio al 2% de 0.46%/min. En el caso
de las células libres de Lactobacillus delbrueckii, la velocidad de pérdida de
viabilidad fue 100% más alto (1%/min) con respecto a las células inmovilizadas.
En el período de cinética de pérdida de viabilidad comprendido entre el minuto 30
y el minuto 60, las velocidades de pérdida fueron de 1.82% de pérdida de
viabilidad/min, 0.45%/min y 0.26%/min para células libres, células inmovilizadas en
alginato al 1% y al 2%, respectivamente (Cuadro 5).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 2 a 7 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
17
atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 2.4 y en
presencia de alimento tipo.
Los resultados estadísticos demostraron que la viabilidad de las células de
Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio fue significativamente
mayor, con respecto a la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
libres. Así también, se observó que no existieron diferencias significativas entre la
viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii con relación a la utilización de
alginato al 1% ó al 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 4. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en presencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas
Células Inmovilizadas
en alginato 1% en alginato 2%
(min) (%) Desv. Std.
+ (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + 0 100 0.0 100 0.00 100 0
15 76 7.05 94 4.51 90 7 30 70 5.76 86 9.20 86 9 45 40 4.13 78 14.47 81 13 60 16 9.76 72 19.99 78 14
Los resultados estadísticos también demostraron que no se encontraron
diferencias significativas en el efecto de la presencia o la ausencia de alimento tipo
sobre la viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii sin importar que las células
estuvieran libre o inmovilizadas sometidas a un pH de 2.4 (Duncan, α= 0.05).
18
100
7670
40
16
100.0100
78
9486
72
868190 78
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60tiempo (min)
Viab
ilidad
(%)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1%Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 5. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 2.4 en presencia de
“desayuno tipo”.
Cuadro 5. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 2.4 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 1 1.82
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.48 0.45
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.46 0.26
30 60
19
4.2.- Tratamientos en medio ácido a pH 4.2 (simulando in vitro la etapa de
estancia de las bacterias en el estómago humano).
El Cuadro 6 y la Figura 6 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) e
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v), tratadas a pH 4.2 en
ausencia de “alimento muestra”. En este tratamiento se trató de simular la estancia
de las bacterias en el estómago humano cuando éste se encuentra vacío.
Las cinéticas de pérdida de viabilidad de Lactobacillus delbrueckii iniciaron con un
100% de células libres viables (1.20x108 UFC/mL) e inmovilizadas en alginato de
sodio al 1% (1.24x109 UFC/mL) y al 2% (1.19x109 UFC/mL). Al término de las
cinéticas de pérdida de viabilidad se observó que el 8% (9.5x106 UFC/mL) de las
células libres mantuvieron su viabilidad, mientras que las células inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% y 2% mantuvieron porcentajes de viabilidad del 61%
(7.6x108 UFC/mL) y de 73% (8.73x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene de 7 a 9 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 4.2 y en ausencia de alimento tipo.
20
Las velocidades de pérdida de viabilidad para las células de Lactobacillus
delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% en el minuto 30,
tiempo de referencia de vaciado del estómago, fueron de 0.69%/min y de
0.53%/min, respectivamente; mientras que para las células libres de Lactobacillus
delbrueckii fue de 2.57% de pérdida de viabilidad/min.
En el período de cinética de pérdida de viabilidad comprendido entre el minuto 30
y el minuto 60, las velocidades de pérdida fueron de 0.60%/min y de 0.36%/min
para células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 1%
y al 2%.
Para el caso de células libres de Lactobacillus delbrueckii, la velocidad de pérdida
de viabilidad al inicio de la cinética (del minuto cero al minuto 15) fue de
4.73%/min. Ello quiere decir que cada minuto que pasa durante la cinética, 4.73%
de las células de Lactobacillus delbrueckii originales pierden su viabilidad. La
velocidad de pérdida de viabilidad para las células libres de Lactobacillus
delbrueckii disminuyó después del minuto 30 de cinética, presentando un valor de
0.50% /min. entre los tiempos 30 y 60 minutos (Cuadro 7).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 4 y hasta 13 veces mayor
para las células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
21
atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 4.2 y en
ausencia de alimento tipo.
El análisis estadístico de los resultados demostró que existieron diferencias
significativas entre la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii
inmovilizadas en alginato de sodio con respecto a la viabilidad de células de
Lactobacillus delbrueckii libres. La viabilidad de las células de Lactobacillus
delbrueckii fue mayor cuando éstas se encontraban inmovilizadas en alginato de
sodio con respecto a cuando se encontraban en forma libre. Además, se observó
que no existieron diferencias significativas entre la utilización de alginato de sodio
a concentraciones de 1% ó de 2% (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 6. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en ausencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas
Células Inmovilizadas
en alginato 1% en alginato 2% (min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. +
0 100 0 100 0 100 0.0 15 29 14.91 90 3.49 91 7.52 30 23 13.10 79 5.39 84 4.21 45 19 11.37 68 3.39 80 4.63 60 8 1.50 61 6.60 73 2.15
22
100
2923 19
8
100
6861
100
7379
90 8491
80
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (min)
Via
bilid
ad (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1% Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 6. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 4.2 en ausencia de
“desayuno tipo”.
Cuadro 7. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en ausencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 4.73 2.57 0.50
15 30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.69 0.60
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.53 0.36
30 60
23
El Cuadro 8 y la Figura 7 presentan los resultados de viabilidad (expresados en
porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin inmovilizar) y células
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2% (p/v), tratadas a pH 4.2 en
presencia de “desayuno tipo” (leche y fruta).
Las cinéticas de pérdida de viabilidad iniciaron con un 100% de células libres
viables (2.20x108 UFC/mL) e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% (1.09x109
UFC/mL) y al 2% (9x108 UFC/mL). Al término de las cinéticas, el 18% (3.98x107
UFC/mL) de las células libres de Lactobacillus delbrueckii mantuvieron su
viabilidad, mientras que las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en
alginato de sodio al 1% y al 2% conservaron porcentajes de viabilidad de 74%
(8.03x108 UFC/mL) y de 83% (7.23x108 UFC/mL), respectivamente.
Los resultados indican que la viabilidad de las células de Lactobacillus delbrueckii
se mantiene 4 veces mayor cuando las células están inmovilizadas, ya sea en
alginato al 1% o al 2%, con respecto a cuando se encuentran libres, en
condiciones de pH de 4.2 y en presencia de alimento tipo.
La velocidad de pérdida de viabilidad para las células de Lactobacillus delbrueckii
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% estimada hasta el minuto 30 de la
cinética fue de 0.39% de pérdida de viabilidad/min, mientras que para alginato de
sodio al 2% fue de 0.33%/min. Para el caso de las células libres de Lactobacillus
delbrueckii se observó una velocidad de pérdida de viabilidad de 2.27%/min. Sin
embargo, si observamos los primeros 15 minutos de la cinética de pérdida de
24
viabilidad para la muestra de células libres de Lactobacillus delbrueckii, la
velocidad de pérdida de viabilidad fue de 4 %/min. Esto quiere decir que cada
minuto, el 4% de las células de Lactobacillus delbrueckii originales pierde su
viabilidad cuando están sometidas a un pH de 4.2. Sin embargo, la velocidad de
pérdida de viabilidad presenta una disminución entre los minutos 30 y 60 de la
cinética, presentándose únicamente una velocidad de pérdida de viabilidad de
0.46%/min (Cuadro 9).
Los valores estimados de las velocidades de pérdida de viabilidad celular indican
que la velocidad de pérdida de viabilidad resulta ser de 5 a 7 veces mayor para las
células de Lactobacillus delbrueckii libres con respecto a las velocidades
calculadas para las células que han sido previamente inmovilizadas por
atrapamiento, en alginato al 1% o al 2%, bajo condiciones de pH de 4.2 y en
presencia de alimento tipo.
Por otra parte, se observó que existieron diferencias significativas entre la
viabilidad de células Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio
(1% y 2%) con respecto a la viabilidad de células libres de Lactobacillus
delbrueckii. Además, se observó que no existieron diferencias significativas entre
la utilización del alginato de sodio, como soporte de inmovilización, a
concentraciones de 1% y de 2% (Duncan, α= 0.05).
25
Cuadro 8. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en presencia de “desayuno tipo”.
Tiempo Células libres Células
Inmovilizadas Células
Inmovilizadas alginato 1% con inulina 2%
(min) (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + (%) Desv. Std. + 0 100 0 100 0 100 0.0 15 40 1.61 94 5.78 94 1.81 30 32 3.84 88 6.04 90 3.41 45 21 1.09 82 5.75 87 4.91 60 18 0.97 74 1.49 83 7.14
100
40
18
100
74
100
87 83
2132
8288
9490
94
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60
tiempo (min)
Via
bilid
ad (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1% Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 7. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% a pH 4.2 en presencia de
“desayuno tipo”.
26
Cuadro 9. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, a pH 4.2 en presencia de “desayuno tipo”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo (min)
Células libres 4.00 2.27 0.46
15 30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 1% 0.39 0.48
30 60
Células Inmovilizadas en alginato al 2% 0.33 0.23
30 60
Los resultados estadísticos también demostraron que sí se encontraron
diferencias significativas en el efecto de la presencia o la ausencia de alimento tipo
sobre la viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii libre o inmovilizado
sometido a un pH de 4.2 (Duncan, α= 0.05). Las células libres de Lactobacillus
delbrueckii presentaron porcentajes de viabilidad significativamente menores
cuando la cinética de pérdida de viabilidad se llevó a cabo en ausencia de
alimento que cuando ésta se llevó en presencia del desayuno tipo a un pH de 4.2.
27
4.3.- Tratamientos con bilis hepática al 0.3% (p/v) (simulando in vitro la etapa
de estancia de las bacterias en el duodeno humano).
En el Cuadro 10 y la Figura 8 se presentan los resultados de viabilidad
(expresados en porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii libres (sin
inmovilizar) e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v), tratadas con
bilis hepática al 0.3% (p/v) en ausencia de “alimento muestra”, en este tratamiento
se trató de simular la estancia de las células en el duodeno humano cuando éste
se encuentra sin “alimento muestra”.
En la cinética se inició con un 100% de viabilidad celular, que correspondió a
1.99x106 UFC/mL para células libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1%
(6.47x108 UFC/mL) y al 2% (1.25x109 UFC/mL ), al término de la cinética de
pérdida de viabilidad, se observó que el 0.6% (6.67x103 UFC/mL) de las células
libres conservaron su viabilidad al término del tratamiento, mientras que las células
inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%, mantuvieron porcentajes de
viabilidad del 52% (3.33x108 UFC/mL) y 55% (6.87x108 UFC/mL) respectivamente.
La velocidad de pérdida para las células inmovilizadas en alginato de sodio al 1%
en los primeros 15 minutos de la cinética fue de 1.0 %pérdida de viabilidad/min, en
alginato de sodio al 2% fue 0.76 %pérdida de viabilidad/min y para células libres
fue 6.16 %pérdida de viabilidad/min. Después de este tiempo y hasta el minuto 30
la velocidad para células inmovilizadas en alginato de sodio al 1% fue de 1.40
%pérdida de viabilidad/min y después del minuto 30 hasta el minuto 60 disminuyó
la velocidad a 0.43 %pérdida de viabilidad/min (Cuadro 11).
28
De acuerdo con el análisis estadístico se observó que existió diferencia
significativa entre la viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas
en alginato de sodio, respecto a la viabilidad de células libres, ambas tratadas en
las mismas condiciones. En cuanto a la utilización de alginato al 1% y al 2% no
existió diferencia significativa, (Duncan, α= 0.05).
Cuadro 10. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, con bilis hepática al 0.3% y ausencia de “alimento
muestra”.
Tiempo Células libres Células Inmovilizadas Células Inmovilizadas en alginato 1% en alginato 2%
min % Desv. Std. % Desv. Std. % Desv. Std. 0 100 0 100 0 100 0.0
15 7.6 5.37 86 9.70 89 6.95 30 4.4 4.92 64 10.08 79 4.71 45 1.5 1.85 57 1.11 70 5.60 60 0.6 1.05 52 0.61 55 8.81
100.0100
6457
100
7970
0.61.54.47.6
52
86
55
89
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0 15 30 45 60
tiempo (min)
Viab
ilida
d (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 1% Cél. Inmov. en alginato 2%
Figura 8. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%, con bilis hepática al 0.3%
(p/v) y ausencia de “alimento muestra”.
29
Cuadro 11. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, con bilis hepática al 0.3% en presencia de
“alimento muestra”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad
bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo
(min)
Células libres 6.16
0.21
0.13
15
30
60
Células Inmovilizadas en alginato al
1%
1.00
1.40
0.43
15
30
60
Células Inmovilizadas en alginato al
2%
0.76
0.63
0.80
15
30
60
En el Cuadro 12 y la Figura 9 se presentan los resultados de viabilidad
(expresados en porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres (sin inmovilizar) e inmovilizadas en alginato 1% y 2% (p/v),
tratadas con bilis hepática al 0.3% (p/v) y en presencia de “alimento muestra”. En
este tratamiento al igual que en el anterior se trató de simular in vitro la estancia
de las bacterias en el duodeno humano en presencia de “alimento muestra”.
La cinética de pérdida de viabilidad celular de Lactobacillus delbrueckii, inició con
un 100% de células libres viables (9.73x108 UFC/mL) e inmovilizadas en alginato
30
de sodio al 1% (1.80x109 UFC/mL) y al 2% (6.57x108 UFC/mL), al término de la
cinética el 34% (3.91x108 UFC/mL) de las células libres se mantuvieron viables,
mientras que las células inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y 2% bajo las
mismas condiciones, presentaron porcentajes de viabilidad del 78% (1.40x109
UFC/mL) y 84% (5.53x108 UFC/mL) respectivamente.
La velocidad de pérdida para las bacterias libres fue de 1.13 %pérdida de
viabilidad/min durante los primeros 45 minutos de la cinética, mientras que para
las bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% las velocidades
fueron 0.32 %pérdida de viabilidad/min y 0.22 %pérdida de viabilidad/min
respectivamente. Después de este tiempo (minuto 45) y hasta el término de la
cinética en el minuto 60, se observó un cambio en la pendiente de las curvas de
bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%, las velocidades
resultantes fueron 0.54 %pérdida de viabilidad/min y 0.40 %pérdida de
viabilidad/min en cada caso y para este tiempo bajo las mismas condiciones, la
velocidad en el caso de células libres fue 0.98 %pérdida de viabilidad/min (Cuadro
13).
Del análisis estadístico se observó que existió diferencia significativa entre la
viabilidad de bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%, respecto
a la viabilidad de células libres ambas tratadas bajo las mismas condiciones. En la
utilización del alginato de sodio al 1% ó al 2% no existió diferencia significativa
entre la viabilidad de ambas muestras, (Duncan, α= 0.05).
31
Cuadro 12. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, con bilis hepática al 0.3% y en presencia de “alimento
muestra”.
Tiempo Células libres Células
inmovilizadas Células
inmovilizadas en alginato 1% en alginato 2%
min % Desv. Std. % Desv. Std. % Desv. Std. 0 100 0 100.0 0.0 100.0 0
15 80 14.8 94 3.22 96 0.63 30 65 20.8 89 5.05 93 2.03 45 48 17.5 86 4.35 90 2.20 60 34 20.8 78 6.61 84 1.04
100
80
65
48
34
100100 96 9390
8494 89
8678
0
20
40
60
80
100
0 15 30 45 60tiempo (min)
Viab
ilida
d (%
)
Células libres Cél. Inmov. en alginato 2% Cél. Inmov. en alginato 1%
Figura 9. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% con bilis hepática al 0.3% (p/v)
y en presencia de “alimento muestra”.
32
Cuadro 13. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, con bilis hepática al 0.3% y en presencia de
“alimento muestra”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad
bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo
(min)
Células libres 1.13
0.98
45
60
Células Inmovilizadas en alginato al
1%
0.32
0.54
45
60
Células Inmovilizadas en alginato al
2%
0.22
0.40
45
60
En los resultados obtenidos para esta etapa (tratamientos simulando in vitro la
estancia de las células de Lactobacillus delbrueckii en el duodeno, en presencia
de bilis hepática al 0.3% y en ausencia de “alimento muestra”), las células
inmovilizadas previamente en alginato de sodio al 1% y 2%, presentaron
porcentajes de viabilidad de 86 y 91 veces mayores respecto al de las células
libres (Figura 8). Además, se observó que la velocidad de las bacterias
inmovilizadas en alginato al 1% en los primeros 15 minutos de la cinética fue 6
veces menor que la de células libres, bajo las mismas condiciones físicas y
químicas evaluadas, y para alginato al 2% fue 8 veces menor en comparación con
la de bacterias en forma libre (Cuadro 11).
33
Para el tratamiento con bilis hepática al 0.3% y presencia de “alimento muestra”,
las células previamente inmovilizadas en alginato de sodio al 1% presentaron una
velocidad de pérdida 3.5 veces menor respecto a la observada en las bacterias
libres, mientras que para las bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 2%
fue 5 veces menor comparada con la de células libres, en ambos casos durante
los primeros 45 minutos de la cinética.
La viabilidad de bacterias inmovilizadas en alginato al 2% incrementó 2.5 veces en
presencia de “alimento muestra” y en 2.3 veces empleando alginato al 1%, en
comparación con las células libres al final de la cinética (Figura 9 y Cuadro 13 ).
De la misma forma que en los tratamientos anteriores, las velocidades de pérdida
de viabilidad de las células inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%,
fueron inferiores a la presentada por las bacterias en forma libre, bajo las mismas
condiciones (bilis hepática al 0.3% con presencia y ausencia de alimento según el
caso).
Una vez más fue posible demostrar que la inmovilización celular por atrapamiento
en alginato de sodio al 1% y 2% permite incrementar los niveles de viabilidad de
células de Lactobacillus delbrueckii, ya que existió diferencia significativa respecto
a la viabilidad de células libres, (Duncan, α= 0.05). Este efecto puede ser debido a
que la matriz de inmovilización protege a las bacterias lácticas y minimiza el efecto
dañino de la bilis hepática sobre la viabilidad. También, fue posible reducir la
velocidad de pérdida de viabilidad bajo las condiciones in vitro evaluadas para
dicha etapa.
34
Los resultados aquí presentados confirman lo reportado por Charteris, et al.,
(1998) quienes reportaron que bifidobacterium tratado con jugo gástrico puede
conservar mejor su viabilidad cuando se adicionan proteínas de la leche al medio.
Fávaro-Trindade and Grosso, en 2002, obtuvieron porcentajes de viabilidad del
80% para Bifidobacterium lactis encapsulado en celulosa después de 12 h de
incubación en bilis.
Mainville, et al., 2005 reportaron para Lactobacillus rhamnosus porcentajes de
viabilidad del 75% a 30 minutos de tratamiento con bilis Oxgall al 0.3% y del 89%
para Lactobacillus johnsonii bajo las mismas condiciones y tiempo.
35
4.4.- Tratamientos in vitro de bacterias libres e inmovilizadas en condiciones
gastrointestinales a pH 2.4 y bilis hepática al 0.3% (p/v), y con adición de
inulina en el soporte de inmovilización.
El Cuadro 14 y la Figura 10 se presentan los resultados de viabilidad (expresados
en porcentaje) de células de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, libres (sin
inmovilizar) e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2% (p/v) con adición de
inulina al 1% y 2.5% en el soporte de inmovilización, tratadas en condiciones
gastrointestinales simuladas in vitro. En los primeros 30 minutos de la evaluación,
las bacterias lácticas fueron tratadas a pH 2.4 y en presencia de “alimento
muestra” (leche y fruta). Después de los 30 minutos las bacterias lácticas fueron
tratadas con bilis hepática al 0.3% (p/v) y en presencia de “alimento muestra”. En
este tratamiento se trató de simular in vitro la estancia de las bacterias lácticas en
el estómago humano y después el paso de las mismas al duodeno humano.
La cinética de pérdida de viabilidad inició con células libres 100% viables
(1.35x108 UFC/mL), al término de la evaluación a pH 2.4 (minuto 30) el 72%
(9.70x107 UFC/mL) de las células conservaron su viabilidad y al finalizar el
tratamiento con bilis hepática al 0.3% y movimiento peristáltico (simulación in vitro
de la actividad peristáltica del duodeno humano) en el minuto 90, el 24% (3.27x107
UFC/mL) de las células se mantuvieron viables (Figura 10).
Durante la etapa de evaluación a pH 2.4, (0 a 30 minutos) la velocidad de pérdida
de viabilidad para las bacterias libres fue 0.94 % pérdida de viabilidad/min y en el
36
tratamiento con bilis hepática al 0.3% y peristalsis (30 a 90 minutos) la velocidad
fue 0.78 % pérdida de viabilidad/min (Cuadro 15).
En el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de
sodio al 2% sin inulina, al término de la evaluación a pH 2.4 (minuto 30) el 87%
(1.05x109 UFC/mL) de las células conservaron su viabilidad, de un 100% inicial de
bacterias viables inmovilizadas que correspondió a (1.21x109 UFC/mL); al finalizar
la etapa con bilis hepática al 0.3% y peristalsis (simulación de duodeno in vitro) en
el minuto 90, el 59% (7.20x108 UFC/mL) de las células inmovilizadas se
mantuvieron viables (Figura 10).
Durante la etapa de evaluación a pH 2.4, ( 0 a 30 min), la velocidad de pérdida de
viabilidad de células inmovilizadas en alginato al 2% sin adición de inulina fue 0.43
% pérdida de viabilidad/min, y durante el tratamiento con bilis hepática al 0.3% y
presencia de “alimento muestra” (30-90 min), la velocidad resultante fue 0.48 %
pérdida de viabilidad/min (Cuadro 15).
La muestra de bacterias viables inmovilizadas en alginato de sodio al 2%
conteniendo inulina al 1%, al término de la etapa a pH 2.4 (minuto 30) el 83%
(8.27x108 UFC/mL) de las células conservaron su viabilidad de un 100% de
bacterias viables inmovilizadas (1.01x109 UFC/mL), al finalizar el tratamiento con
bilis hepática al 0.3% y movimiento peristáltico (minuto 90) el 55% (5.50x108
UFC/mL) de las células inmovilizadas se mantuvieron viables (Figura 10).
37
La velocidad de pérdida de viabilidad de bacterias lácticas inmovilizadas en
alginato de sodio al 2% conteniendo inulina al 1% fue 0.56 % pérdida de
viabilidad/min, durante la etapa de evaluación a pH 2.4, (0-30 min) , después de
este tiempo y hasta finalizar la etapa con de bilis hepática al 0.3% y peristalsis (30-
90 min), en la cual se trató de simular in vitro la estancia de las bacterias en el
duodeno humano, la velocidad fue de 0.45 % pérdida de viabilidad/min (Cuadro
15).
En el caso de las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de
sodio al 2%, conteniendo inulina al 2.5%, al término de la etapa a pH 2.4 (minuto
30) el 97% (2.56x109 UFC/mL) de las bacterias conservaron su viabilidad, de un
100% inicial (2.64x109 UFC/mL). Al finalizar la etapa con bilis hepática al 0.3% y
movimiento peristáltico (minuto 90) el 80% (2.11x109 UFC/mL) de las células
inmovilizadas se mantuvieron viables (Figura 10).
La velocidad de pérdida de viabilidad de células inmovilizadas en alginato al 2%
conteniendo inulina al 2.5% fue 0.10 % pérdida de viabilidad/min en la etapa de
evaluación a pH 2.4 y de 0.30 % pérdida de viabilidad/min en la etapa con bilis
hepática al 0.3% (30-90 min) con peristalsis y presencia de “alimento muestra”.
(Cuadro 15).
38
De acuerdo con el análisis estadístico existe diferencia significativa entre la
viabilidad celular obtenida en todos los tratamientos con células inmovilizadas en
alginato de sodio al 2% respecto a la viabilidad de células libres (Duncan, α=
0.05).
Las células de Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 2%
con adición de inulina al 2.5% presentaron la viabilidad más elevada (80%), en
comparación con las muestras sin inulina (59%) y conteniendo inulina al 1%
(55%), respecto de la viabilidad de células libres (24%), todas las muestras
tratadas bajo las mismas condiciones (Duncan, α= 0.05). En el caso de las
muestras de bacterias inmovilizadas en alginato de sodio al 2% conteniendo
inulina al 1% y sin inulina, no existió diferencia significativa de acuerdo con los
resultados del análisis estadístico (Duncan, α= 0.05).
39
Cuadro 14. Resultados de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus en alginato de sodio, en condiciones gastrointestinales simuladas in vitro a pH
2.4, bilis hepática al 0.3% con peristalsis y en presencia de “alimento muestra”.
Tiempo Células libres Células
inmovilizadas Células
inmovilizadas Células inmovilizadas sin inulina con inulina 1% c/inulina 2.5%
Min % Desv. Std. + % Desv. Std. + % Desv. Std. + % Desv. Std. + 0 100 0 100 0 100 0 100 0
15 79 4 91 4.04 91 4.58 99 1.00 30 72 2.64 87 7.81 83 9.29 97 2.51 45 60 4.93 82 6.42 74 14.57 94 3.21 60 52 10.26 76 7.63 68 11.13 89 1.00 75 39 11.06 66 10.40 62 8.54 83 1.52 90 24 4.50 59 10.78 55 7.57 80 4.35
010
2030
4050
6070
8090
100110
0 15 30 45 60 75 90
tiempo (min)
Via
bilid
ad (%
)
Cél. Inmov en alginato 2% sin inulina Cél. Inmov. en alginato 2% e inulina 1%
Cél. Inmov. en alginato 2% e inulina 2.5% Células libres
Figura 10. Cinética de pérdida de viabilidad de células de Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus, libres e inmovilizadas en alginato de sodio al 1% y al 2%, con bilis hepática al 0.3%
(p/v) y en presencia de “alimento muestra”.
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Cuadro 15. Velocidades de pérdida de viabilidad de células libres e inmovilizadas Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus en alginato de sodio, en condiciones gastrointestinales simuladas in
vitro a pH 2.4, bilis hepática al 0.3% con peristalsis y en presencia de “alimento muestra”.
Muestra Velocidad de pérdida de viabilidad
bacteriana
(%pérdida de viabilidad/min)
Tiempo
(min)
Células libres 0.94
0.78
0 - 30
30 - 90
Células Inmovilizadas en alginato al
2% sin inulina
0.43
0.48
0 - 30
30 - 90
Células Inmovilizadas en alginato al
2% conteniendo inulina al 1%
0.56
0.45
0 - 30
30 - 90
Células Inmovilizadas en alginato al
2% conteniendo inulina al 1%
0.10 0.30
0 - 30
30 - 90
De los resultados obtenidos se observó que la viabilidad de las células de
Lactobacillus delbrueckii inmovilizadas en alginato de sodio al 2% sin adición de
inulina en el soporte, al término de la etapa de simulación in vitro de la estancia en
estómago humano a pH 2.4 (minuto 30) fue 1.2 veces mayor que la obtenida para
bacterias libres bajo las mismas condiciones. Así mismo, la velocidad de pérdida
de viabilidad de las células inmovilizadas fue 2 veces menor respecto a la de
células libres en esta etapa de evaluación. Al término de la etapa de evaluación en
bilis hepática al 0.3% y peristalsis (minuto 90), la viabilidad de células
inmovilizadas fue 2.5 veces mayor que la de células libres, y la velocidad de
pérdida fue 1.6 veces menor que la presentada por las células libres (Cuadro 15).
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La viabilidad de bacterias inmovilizadas en alginato al 2% conteniendo inulina al
1%, en el minuto 30 de la cinética (etapa de simulación in vitro de la estancia de
las bacterias en estómago humano a pH 2.4), fue 1.15 veces mayor comparada
con la de células libres en esta misma etapa; y 2.3 veces mayor comparada
nuevamente con la de células libres al término de la etapa en presencia de bilis
hepática (min 90) (Figura 10). Las velocidades de pérdida de viabilidad de las
bacterias inmovilizadas fue 1.7 veces menor comparada con la de células libres al
minuto 30 y 90 de la cinética (Cuadro 15).
Utilizando inulina al 2.5% en el soporte se logró incrementar la viabilidad en 1.3 y
3.3 veces más comparando con la viabilidad de células libres, al término de la
etapa de simulación in vitro de la estancia de las células en estómago humano
(minuto 30) y en duodeno humano (minuto 90) (Figura 10). De igual manera que
en los casos anteriores las velocidades de pérdida de viabilidad son menores que
las observadas en células libres (8.4 veces para células inmovilizadas en el minuto
30 y 3.1 veces en el minuto 90 Cuadro 15).
En esta etapa, el análisis estadístico demostró que existió diferencia significativa
entre la viabilidad de células inmovilizadas respecto a las libres, evaluadas bajo
las mismas condiones. Además, los porcentajes de viabilidad son mayores
significativamente utilizando inulina al 2.5% en el soporte de inmovilización.
Mientras que no existió diferencia significativa entre la viabilidad de células
inmovilizadas en alginato al 2% sin inulina en el soporte y con inulina al 2.5%
contenida en el soporte (Duncan, α= 0.05).
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Por lo anterior, podemos decir que la adición de inulina al 2.5% en el soporte,
contribuyó de manera favorable a la viabilidad de células de Lactobacillus
delbrueckii, evaluadas en condiciones gastrointestinales in vitro, ya que se logró
mantener un elevado nivel de viabilidad (80%).
Mainville, et al., 2005 reportaron para Lactobacillus rhamnosus porcentajes de
viabilidad del 75% y 63% a 30 y 90 minutos de tratamiento con bilis Oxgall al 0.3%
y del 89% y 62% para Lactobacillus johnsonii bajo las mismas condiciones y
tiempos. También reportaron pérdida total de viabilidad para Lactobacillus
rhamnosus a pH 2.0 y porcentajes de viabilidad del 85% y 6% para Lactobacillus
johnsonii a pH 2.0 a 30 y 90 minutos respectivamente. Para Bifidobacterium
infantis reportaron 5% de viabilidad en bilis Oxgall al 0.3% y pérdida total a pH 2.0
en un tiempo de 30 minutos y 1% de viabilidad en bilis Oxgall al 0.3% en 90
minutos de tratamiento.
Chandramoulli, et al., (2004) reportaron porcentajes de viabilidad alrededor del
80% para L. acidophillus encapsulado en alginato al 1.8%, concentración del
inóculo109 UFC/mL, tamaño de partícula de 450 μm.
Las investigaciones relacionadas con el presente trabajo reportadas en la literatura
científica, únicamente han evaluado el efecto de la presencia de la inulina como
prebiótico para estimular el crecimiento de bacterias lácticas probióticas libres
sobre la pérdida de viabilidad celular.
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En nuestro trabajo de investigación evaluamos el efecto de 2 concentraciones de
inulina (2% y 2.5%) asociados a la matriz de inmovilización (alginato de sodio al
2%), los resultados de su efecto sobre la viabilidad son los siguientes:
Con inulina al 1% en el soporte:
La viabilidad de células inmovilizadas al término de 30 minutos a pH 2.4 83%, y
de 55% al término del tratamiento con bilis hepática al 0.3% y peristalsis (minuto
90).
Con inulina al 2.5% en el soporte:
La viabilidad de células inmovilizadas al término de 30 minutos a pH 2.4 fue 97%,
y de 80% al término del tratamiento con bilis hepática al 0.3% y peristalsis (minuto
90).
Se ha relacionado el uso de inulina principalmente con bifidobacterias, sin
embargo, autores como Roberfroid, et al., (1998) observaron que todos los fructo-
oligosacáridos son rápidamente y completamente metabolizados cuando se
incuban en presencia de bacterias presentes en heces fecales humanas, esto
incluye al género de los lactobacilos. Así mismo, Wang y Gibson en 1993,
demuestran en estudios in vivo que la inulina y la oligofructosa son fermentables
por la flora colónica.
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5.- CONCLUSIONES.
Con base en las simulaciones in vitro de las condiciones gastrointestinales del ser
humano, más completas con presencia de bilis hepática, así como de cinéticas de
pérdida de viabilidad realizadas, los resultados obtenidos en el proyecto reflejaron
que Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NRRL-734 inmovilizado en
soportes de alginato de sodio, mantiene mayores niveles de viabilidad con
respecto a las células libres de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus tratadas
bajo las mismas condiciones fisicoquímicas.
Con la aplicación de la técnica de inmovilización celular por atrapamiento en
alginato de sodio, se logró mantener concentraciones de bacterias viables
elevadas (108 UFC/mL) al término de los diferentes tratamientos en condiciones
gastrointestinales simuladas in vitro.
También, se puede concluir que la presencia de una muestra de desayuno tipo
mezclado a las células de Lactobacillus delbrueckii a un pH de 4.2 disminuyó
significativamente los porcentajes de pérdida de viabilidad de las células libres, así
como la velocidad de pérdida de viabilidad durante las cinéticas realizadas. Estos
resultados quieren decir que en el caso de que un ser humano consuma células
de Lactobacillus delbrueckii, existirán mayores posibilidades de dichas células
libres de Lactobacillus delbrueckii sobrevivan a las condiciones gastrointestinales
del ser humano, cuando las bacterias se consuman acompañadas de algún
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alimento tipo como el que aquí se utilizó, que cuando la persona se encuentre en
ayunas.
Con el empleo de la técnica de inmovilización por atrapamiento en alginato de
sodio al 1% y 2%, es posible minimizar los efectos que tiene el ácido clorhídrico
150 mM y la bilis hepática al 0.3% sobre la viabilidad de células de Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, esto puede ser debido a que la matriz de
inmovilización ejerce un efecto protector en la célula, minimizando de esta manera
los efectos dañinos del medio.
De acuerdo con los resultados observados, la presencia de “alimento muestra”
contribuye en la reducción del daño sobre la viabilidad de Lactobacillus
delbrueckii.
La adición de inulina al 2.5% en el soporte de inmovilización, contribuye
significativamente en la conservación de la viabilidad de células de Lactobacillus
delbrueckii.
Por último, podemos concluir que, con base en las simulaciones in vitro realizadas,
la técnica de inmovilización celular por atrapamiento resultó ser benéfica para la
disminución de los niveles de pérdida de viabilidad de las células de Lactobacillus
delbrueckii inmovilizadas. Todo ello con el objeto de que dicha técnica pueda ser
empleada para el desarrollo de alimentos funcionales.
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6.- IMPACTO.
El impacto del presente proyecto en el sector productivo puede llegar a ser
importante en un futuro cercano, una vez que la tecnología aquí presentada,
basada en la inmovilización celular de bacterias lácticas probióticas, pueda ser
realizada de manera automatizada y además validada por medio de la
experimentación con animales o con seres humanos; todo ello con la finalidad de
desarrollar nuevos alimentos lácteos funcionales que contenga grandes
cantidades de bacterias probióticas y con altos niveles de viabilidad celular, lo que
resultaría en múltiples beneficios para la salud del ser humano.
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